Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Résumé

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Résumé

L'isolement des virus géants est d'un grand intérêt dans cette nouvelle ère de la virologie, d'autant plus que ces virus géants sont liés à des protistes. virus géants peuvent être potentiellement pathogènes pour de nombreuses espèces de protistes. Ils appartiennent à l'ordre des Megavirales récemment décrit. La nouvelle lignée Faustovirus qui a été isolé à partir d'échantillons d'eaux usées est lointainement apparenté au virus de la peste porcine africaine de l'agent pathogène de mammifère. Ce virus est également spécifique à son hôte amibienne, vermiformis Vermamoeba, un protiste commun dans les systèmes d'eau de soins de santé. Il est crucial de continuer à isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d'élargir sa collection de génotype et étudier son pan-génome. Nous avons développé de nouvelles stratégies pour l'isolement de souches supplémentaires en améliorant l'utilisation de combinaisons d'antibiotiques et antifongiques, afin d'éviter les contaminations bactériennes et fongiques de la co-culture de l'amibe et de favoriser la multiplication du virus. Nous avons également mis en place un nouveau starvation moyen pour maintenir V. vermiformis dans des conditions optimales pour les virus co-culture. Enfin, nous avons utilisé la cytométrie en flux, plutôt que l'observation au microscope, ce qui prend du temps, afin de détecter l'effet cytopathogène. Nous avons obtenu deux isolats provenant d'échantillons d'eaux usées, ce qui prouve l'efficacité de cette méthode et élargissant ainsi la collection de Faustoviruses, afin de mieux comprendre leur environnement, la spécificité d'hôte et le contenu génétique.

Introduction

La découverte des virus géants, en particulier ceux appartenant à l'ordre Megavirales, a complètement changé le monde des virus en termes de taille des particules et de la complexité du génome. Les virus ont déjà été pensés pour être de petites entités, et l'Mimivirus semblaient briser toutes les règles. ¹ données métagénomique suggère l'omniprésence des virus géants , non seulement dans l'environnement, ^2-5 , mais aussi chez l' homme. ⁶ Par conséquent, il est encore nécessaire à la recherche de ces virus à grande échelle. La diversité de ces virus géants a été évaluée par échantillonnage non seulement une variété de milieux aquatiques et leurs sédiments associés dans le monde entier, ^7-11 , mais aussi par criblage d' une variété d'échantillons humains ^12,13 et les échantillons environnementaux. ^7,9 Les mimivirus de polyphaga Acanthamoeba était isolé par co-culture en utilisant protistes phagocytaires, principalement Acanthamoeba spp. ^14-16 toute une collection de virus géants étaient alors aussiisolé à partir de cet hôte de protistes spécifié, ce qui a rendu la communauté scientifique restreindre sa recherche et l' isolement procédure de Acanthamoeba spp. Il est clair que cette dépendance sur une seule espèce d'accueil a donné lieu à une grande partie des virus étant négligée. Le fait que le virus géant, CroV, a été isolé avec le très motiles marine protozoaires cafeteria roenbergensis, ^17,18 démontre la nécessité d'utiliser une plus large gamme de protozoaires afin de découvrir de nouvelles lignées ou familles de virus géants. Reteno et al. A réussi à choisir d' autres protozoaires comme des cellules hôtes qui n'a jamais été utilisé auparavant, et isolé la nouvelle lignée Asfar liée des virus géants (le Faustovirus nouvellement nommé). ¹⁹

Dans une tentative d'isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d'élargir les membres de cette lignée virale, nous avons modifié nos procédures d'isolement et les ont utilisés pour dépister les échantillons environnementaux capables de récolter de nouvelles Faustoviruses. Nous avons ensuitedécrit l'ensemble du protocole pour caractériser les nouveaux isolats. Nous avons évalué vermiformis Vermamoeba, le protistes vivant en liberté le plus répandu dans les environnements humains, ^20-22 , qui est déjà utilisé dans l'isolement du premier prototype Faustovirus E12. ¹⁹ Cette protist actuellement encore l' hôte spécifique pour Faustovirus. Nous savions que aucun des virus géants connus était pathogène pour cette amibe, car aucune tentative de se développer d'autres virus géants dans notre laboratoire a montré une lyse amibe ou la croissance virale. Pour cette raison, nous croyons que V. vermiformis est le meilleur et le plus unique support cellulaire connue pour isoler de nouveaux Faustoviruses.

Protocole

Collection 1. Sample

1. Recueillir 70 échantillons provenant de différents milieux et régions. Dans ce cas, utilisez les suivants: 5 échantillons d'eau sale du village de Saint Pierre de Meyzoargues (France), 15 échantillons du lac dans le Parc Borély à Marseille (France); 15 échantillons d'eau de mer avec les sédiments des calanques à Samena à Marseille (France), 25 échantillons d'eau de la rivière des Alpes (France), et enfin, 10 échantillons provenant des eaux usées à La Ciotat (France).
2. échantillons Vortex pour l'homogénéisation avant inoculant, pendant une minute à la température ambiante sans aucun traitement.

2. Procédé d'isolation

1. Hôte Préparation pour les procédures aveugles Culture et Inoculation Sample
   1. Utilisez V. vermiformis (souche CDC19) en tant que support de cellules pour la co-culture.
   2. Maintenir les amibes à 28 ° C, dans une cellule de 75 ^cm2 flacon de culture avec 30 ml de protease peptone-extrait de levure milieu glucose (PYG). S'il vous plaît vérifier la composition PYG dans le tableau 1.
      Remarque: Après 48 heures, les amibes sont quantifiés par un comptage en utilisant des diapositives normales de comptage (par exemple, Kovaslides).
   3. Récolte des cellules à une concentration de 5 x 10 ⁵ à 10 ⁶ cellules / ml, et on pastille amibes par centrifugation à 720 g pendant 10 min.
   4. Retirer le surnageant par aspiration, et remettre en suspension le culot amibes dans 30 ml de solution saline stérile amibienne de la page (PAS) Tableau 1. Répétez cette procédure de rinçage.
   5. Resuspendre les amibes dans 30 ml de milieu de privation avec un mélange d' antibiotiques et d' antifongiques à une concentration d'environ 10 ⁶ amibes / ml. Le milieu de la faim est un moyen de survie pour l'amibe, ce qui lui permet de rester en vie sans enkystement ou multiplication. Vérifier la composition dans le tableau 1.
      Remarque: Le mélange d'agent antimicrobien contenant 10 pg / ml de vancomycine, 10 pg / ml imipénème, 20 pg / ml ciprofloxacine, 20 μg / ml de doxycycline et 20 pg / ml voriconazole. Cette combinaison a permis de réduire la contamination bactérienne et fongique qui peut diminuer ou modifier la multiplication virale.
   6. inoculer directement 25 pi de chaque échantillon sur la 200 pi amibe monocouche dans un fond plat plaque de 96 puits favorisant l'adhérence des amibes et incuber à 30 ° C dans un environnement humide (un environnement humide consiste à placer une compresse humide à l'intérieur du sac contenant la la plaque afin d'éviter l'évaporation). Ceci est la primo-culture. Laissez deux puits d'amibes sans échantillon inoculation; celle-ci agit en tant que témoin négatif. Incuber cette primo-culture pendant trois jours.
   7. Trois jours après la première inoculation, sous-culture de la plaque primo- culture sur amibes frais comme décrit ci-dessus, sans aucune observation microscopique. Incuber la nouvelle plaque pendant trois jours dans les mêmes conditions que la primo-culture.
   8. Effectuer la culture finale après ces trois jours d'incubation de la même manière que pour ee primo- et sous-culture. Incuber la culture finale pendant deux jours. Ensuite, passez à la détection.
2. Détection de Lysis par cytométrie de flux automatisé
   Remarque: la culture aveugle couplé avec le flux diffère cytométrie du système standard précédent de l'isolement. Il est plus sensible, précise et automatisée. Pour des fins de détection, nous avons appliqué une nouvelle technique développée pour détecter la lyse à la vitesse maximale et sans l'observation microscopique. Cette technique est avantageuse pour les échantillons de dépistage et a une meilleure sensibilité que les techniques anciennes. ^7-9
   1. Utiliser la plaque à 96 puits de la co-culture finale de détecter la lyse.
   2. Allumez le cytomètre et exécuter un cycle de nettoyage et de rinçage afin d'obtenir un bruit de fond plus faible selon le protocole du fabricant.
   3. Lancez le High Throughput Sampler (HTS) combinée avec cytométrie de flux pour charger automatiquement des échantillons de la plaque de 96 puits et de procéder à une acquisition entièrement automatisée à moins de 40 min according au protocole du fabricant.
   4. Mettre en place les HTS comme suit: volume d'échantillon de 150 pi, le volume de mélange 50 ul, vitesse 180, nombre de mélanges 5 de mélange, le volume de lavage entre chaque échantillon de 400 pi, débit de 2,5 pl / s, nombre d'événements enregistrés 10.000.
   5. Évaluer les puits de contrôle négatif de la co-culture de micro-plaque finale en premier afin de porte la population amibes et de déterminer le pourcentage de ces cellules hôtes en fonction de leurs caractéristiques physiques. Soyez sûr d'avoir une population amibe homogène et une seconde population d'une baisse des événements correspondant à des débris et du bruit.
      Remarque: Cette procédure de déclenchement distingue les débris et les amas subcellulaire de cellules individuelles par taille, estimés par diffusion vers l'avant. Il est donc important de déterminer avec précision le pourcentage de chaque population utilisant la meilleure procédure de transmission sélective possible. Ces pourcentages peuvent varier, en particulier si de nombreux types de protozoaires sont utilisés, il est donc important de toujours avoir un negativcontrôle électronique, qui peut être utilisé en tant que la population de référence pour le reste des échantillons.
   6. Démarrez le déclenchement en cliquant échantillon acquérir.
   7. Notez le nombre d'événements non moins de 10.000 événements.
   8. Localisez la population amibe d'intérêt en utilisant la flèche. Voici comment définir les portes.
   9. Après déclenchement, laissez la tache HTS ou de localiser la plaque en cliquant sur 'Home', puis exécutez la plaque entière automatiquement. Effectuer l'acquisition et l'analyse des données en fonction de la taille et de la structure des paramètres (respectivement, FSC (de diffusion vers l'avant) et SSC (diffusion latérale)).
      Remarque: La détection de la perte de la population amibe fermée signale la présence d'un agent pathogène responsable de la amibe lyse. la lyse des protozoaires associée à une infection virale est détectée avec un seuil arbitrairement conçu de 50% de lyse de la population ayant une amibe fermée par l'analyseur et par rapport à la population non infectée utilisé comme témoin négatif fiable.

3. Caractérisation des nouveaux isolats après détection Lysis

1. Coloration préliminaire pour révéler la présence des virus géants
   1. Après la détection de la lyse par cytométrie de flux, Pipette les co-cultures lysées pour suspendre les amibes restants. Ensuite cytocentrifugeuse directement 50 pi de la suspension à 800 g pendant 10 min.
   2. Après centrifugation, fixer les lames avec une solution de méthanol pur. Colorer les lames en utilisant une coloration rapide commerciale de éosine / bleu Azur et coloration DAPI et observer sous un microscope optique à un grossissement 1,000X afin de vérifier la présence d'usines de virus.
      1. Pour une coloration rapide, plonger les lames dans la première solution de l'éosine (4 sec répété trois fois), puis passer directement à plonger les lames dans la seconde solution de fixation contenant du bleu Azur pour 6 sec, et enfin rincer les diapositives de 45 secondes avec une solution de tampon phosphate pH 7,2. Laissez les lames sécher à la température ambiante, puis passez à observatisur.
      2. Pour la coloration DAPI, le dépôt de 15 pi de la solution de stock commercial DAPI sur la lame sèche fixe. Protéger de la lumière, puis procéder à l'observation.
2. Microscopie électronique
   1. Après la première identification sur les glissières, d'évaluer la présence du virus géant à travers l'observation en microscopie électronique des cultures de surnageant.
   2. Dépôt de 5 pi de l'échantillon positif sur la grille de lueur déchargée. Attendez environ 20 min à température ambiante.
   3. Sécher soigneusement la grille et le dépôt sur une petite baisse de 1% de molybdate d'ammonium pendant 10 secondes. Laissez la grille sécher pendant 5 min.
   4. Passez à la microscopie électronique à 200 keV.
   5. Placer la grille sur le support; introduire le support dans le microscope. Vérifiez la liste de vide en cliquant sur l'icône correspondante. Fermer les vannes et commencent l'observation à une taille du point 5, et un grossissement de x 25 000.
   6. Mesurer le virus géant en utilisant ImageJ ou directementment sur le microscope à l'aide de l'outil de mesure du microscope située à l'écran d'acquisition.
      Remarque: Classifier l'échantillon dans le groupe Faustovirus avec une taille de capside d'environ 200 nm.
3. Biologie moléculaire
   Remarque: Après cette identification, les tests de biologie moléculaire ont été cruciales pour la confirmation afin de distinguer Faustovirus de Marseillevirus, qui a la même taille de la capside et l'apparence en microscopie électronique, bien qu'ils ne possèdent pas la même spécificité d'hôte. Le Marseillevirus ne peut pas se développer sur Vermamoeba le Faustovirus est spécifique à Vermamoeba et toutes les tentatives de se développer sur d' autres amibes tels que Acanthamoeba ont échoué à ce jour. La conception et l' application des systèmes d' amorce / sonde spécifiques énumérées dans les œuvres de Reteno et al. a permis une classification préliminaire plus précise des virus nouvellement isolés par amplification et le séquençage des gènes viraux.
   1. ExADN des voies à partir des échantillons de culture positifs en utilisant un système automatisé d'extraction selon le protocole du fabricant.
   2. Effectuez-PCR en temps réel en utilisant un thermocycleur comme décrit dans Reteno et al. ¹⁹
   3. Séquence en utilisant les mêmes amorces qui ont été utilisées pour l'amplification. Utilisez les amorces ciblant l'ARN polymérase sous-unité ADN-1 gène: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(avant) et-TTG de CAC CTC CGC Fstv_S2R AGT TAA A-3' (inverse) avec la sonde Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.

4. Virus Production, Purification et séquençage du génome

1. Repiquer la culture unique amibe virus pour point final clonage par dilution.
2. Pour la production: 20 préparer des flacons contenant 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba et 5 ml du virus isolé déjà transféré dans des puits à petits flacons.
3. Incuber à 30 ° C jusqu'à achèvementlyse de l'amibe. Observez tous les jours par microscopie optique inversée jusqu'à ce que tous les amibes sont lysées.
4. Après la lyse complète, la piscine tous les flacons en un seul destinataire. Filtrer avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les débris.
5. Commencez la purification par ultracentrifugation à 89.800 xg pendant 75 min. Assurez-vous de calibrer le poids des tubes avant de commencer la centrifugation.
6. Après centrifugation, éliminer le surnageant de chaque tube par aspiration et remettre en suspension le culot dans le PAS avec le même volume utilisé pour le calibrage, avant la répétition de la centrifugation.
7. Comme ci-dessus, éliminer le surnageant et remettre en suspension les culots dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS).
8. On purifie le virus qui est produit en utilisant 25% de saccharose (27,5 g de saccharose dans 100 ml de PBS, filtré sur un filtre de 0,22 um).
   1. Utiliser 8 ml de saccharose et de 2 ml de la suspension virale. Centrifuger à 89800 xg pendant 1 h 15 min. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS. Conserver à -80 ° C.

Résultats

Le système étudié dans ce manuscrit validé sa preuve de concept en isolant deux nouveaux Faustoviruses. Sur les 70 échantillons testés, deux épisodes de lyse ont été détectés, contrairement à nos contrôles négatifs fiables. Le contrôle négatif pour la lyse contenait une population amibe de 86%. En revanche, les échantillons positifs (ST1 pour Saint Pierre de Meyzoargues), et (LC9 pour l'échantillon La Ciotat 9) ont montré une baisse spectaculaire des amibes fermée...

Discussion

La possibilité que Faustovirus pourrait être le premier membre d'une nouvelle famille Megavirales près de ASFV a d' abord été suggérée par Reteno et al., ¹⁹ mais certaines différences peuvent encore se distinguer. Il semble difficile de savoir si Faustovirus devrait se joindre à la famille Asfarviridae ou si elle devrait plutôt former une nouvelle famille virale putative. Cette question nécessitera une enquête plus approfondie, notamment une caractérisation plus complète de sa m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020