Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Resumo

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Resumo

O isolamento do vírus gigantes é de grande interesse nesta nova era de virologia, especialmente desde que estes vírus gigantes estão relacionados com protistas. vírus gigantes podem ser potencialmente patogênicos para muitas espécies de protistas. Eles pertencem à ordem descrita recentemente de Megavirales. A nova linhagem Faustovirus que foi isolado a partir de amostras de esgoto está distantemente relacionado com o agente patogénico de mamífero suíno Africano vírus da peste. Este vírus também é específico para o seu hospedeiro amébica, vermiformis Vermamoeba, um protista comuns em sistemas de água de cuidados de saúde. É crucial para continuar a isolar novos genótipos Faustovirus, a fim de ampliar sua coleção genótipo e estudar a sua pan-genoma. Nós desenvolvemos novas estratégias para o isolamento de estirpes adicionais, melhorando a utilização de combinações de antibióticos e antifúngicos, a fim de evitar as contaminações bacterianas e fúngicas da co-cultura ameba e favorecendo a multiplicação do vírus. Além disso, implementamos um novo starvation forma a manter V. vermiformis em condições óptimas para vírus co-cultura. Finalmente, utilizou-se citometria de fluxo em vez de observação microscópica, o que é moroso, para detectar o efeito citopatogénico. Obtivemos dois isolados de amostras de esgoto, comprovando a eficiência deste método e alargando, assim, a coleção de Faustoviruses, para entender melhor seu ambiente, especificidade do hospedeiro e conteúdo genético.

Introdução

A descoberta de vírus gigantes, especialmente aquelas que pertencem à ordem Megavirales, mudou completamente o mundo dos vírus em termos de tamanho de partícula e a complexidade do genoma. Os vírus foram previamente pensado para ser pequenas entidades, ea Mimivírus apareceu para quebrar todas as regras. ¹ dados metagenômica sugere a ubiquidade dos vírus gigantes não só no ambiente, ^2-5, mas também em seres humanos. ⁶ Portanto, ainda há uma necessidade de pesquisa para estes vírus em grande escala. A diversidade destes vírus gigantes foi avaliada por amostragem não só uma variedade de ambientes aquáticos e dos seus sedimentos associados em todo o mundo, ^7-11, mas também por rastreio de uma variedade de amostras humanas ^12,13 e amostras ambientais. Os ^7,9 Mimivírus Polyphaga foi Acanthamoeba isolado por co-cultura utilizando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. ^14-16 Uma coleção inteira de vírus gigantes eram, então, tambémisolado a partir deste host protista especificado, o que fez a comunidade científica restringir o seu procedimento de pesquisa e isolamento de Acanthamoeba spp. É evidente que esta dependência de uma única espécie de hospedeiro resultou em uma grande fração de vírus que está sendo negligenciado. O fato de que o vírus gigante, CroV, foi isolado com o altamente móveis marinho roenbergensis protozoários Cafeteria, ^17,18 demonstra a necessidade de usar uma ampla gama de protozoários, a fim de descobrir novas linhagens ou famílias de vírus gigantes. Reteno et al. Conseguiram selecionar outros protozoários como hospedeiros celulares que nunca tinha sido utilizado anteriormente, e isolado da nova linhagem relacionados com Asfar de vírus gigantes (o recém-nomeado Faustovirus). ¹⁹

Em uma tentativa para isolar novos genótipos Faustovirus a fim de expandir os membros desta linhagem viral, modificamos nossos procedimentos de isolamento e os usou para selecionar amostras ambientais capazes de colher novas Faustoviruses. Nós entãodescrito todo o protocolo para caracterizar os novos isolados. Foram avaliados vermiformis Vermamoeba, o protista de vida livre mais comum encontrado em ambientes humanos, ^20-22 que já é utilizado no isolamento do primeiro protótipo Faustovirus E12. ¹⁹ Esta protista está ainda hospedar-específico para Faustovirus. Sabíamos que nenhum dos vírus gigantes conhecidos foi patogênico para esta ameba, porque nenhuma tentativa para crescer outros vírus gigantes em nosso laboratório mostraram lise ameba ou o crescimento viral. Por esta razão, nós acreditamos que V. vermiformis é o melhor e mais original suporte de células conhecidas para isolar novos Faustoviruses.

Protocolo

Coleção 1. Amostra

1. Colete 70 amostras de diferentes ambientes e regiões. Neste caso, use os seguintes: 5 amostras de água sujas da aldeia de Saint Pierre de Meyzoargues (França), 15 amostras do lago em Parc Borély em Marselha (França); 15 amostras de água do mar com sedimentos das enseadas rochosas em Samena em Marselha (França), 25 amostras de água do rio dos Alpes (França), e, finalmente, 10 amostras de esgoto em La Ciotat (França).
2. amostras vortex por homogeneização antes de inocular, durante um minuto à temperatura ambiente, sem qualquer tratamento.

2. Processo de isolamento

1. Hospedar Preparação para procedimentos de cultura cego e Inoculação Amostra
   1. Use V. vermiformis (estirpe CDC19) na forma de um suporte celular para a co-cultura.
   2. Manter as amebas a 28 ° C, num balão de cultura de 75 centímetros de células ² com 30 ml de protease peptona-extracto de levedura-glicose médio (PYL). Por favor, verifique a composição PYG na Tabela 1.
      Nota: Após 48 horas, as amebas são quantificados por uma contagem usando lâminas de contagem normais (por exemplo, Kovaslides).
   3. Células colheita a uma concentração de 5 x ^maio 10-junho 10 células / ml, e sedimento amebas por centrifugação a 720 xg durante 10 min.
   4. Remover o sobrenadante por aspiração, e re-suspender o sedimento amebas em 30 ml de solução salina estéril amébica da página (PAS) Tabela 1. Repetir este procedimento de lavagem.
   5. Re-suspender amebas em 30 ml de meio de privação com uma mistura antibiótica e antifúngica numa concentração de cerca de 10 ⁶ / ml amiba. O meio de inanição é um meio de sobrevivência para a ameba, permitindo-lhe manter vivo sem encistamento ou multiplicação. Verificar composição na Tabela 1.
      Nota: A mistura de agente antimicrobiano continha 10 ug / ml de vancomicina, 10 ug / ml de imipenem, 20 ug / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, e 20 ug / ml de voriconazol. Esta mistura serviu para reduzir a contaminação bacteriana e fúngica, que pode diminuir ou alterar a multiplicação virai.
   6. Directamente inocular 25 uL de cada amostra sobre a ameba monocamada de 200 ul num fundo plano de 96 poços da placa favorecendo a adesão ameba e incubar a 30 ° C num ambiente húmido (num ambiente húmido consiste na colocação de uma compressa molhada no interior do saco que contém o placa, a fim de evitar a evaporação). Este é o primo-cultura. Deixar dois poços de amebas sem qualquer inoculação da amostra; este actua como o controlo negativo. Incubar esta cultura primo por três dias.
   7. Três dias após a primeira inoculação, sub-cultura da placa primo-cultura em amebas fresco como descrito acima, sem qualquer observação microscópica. Incubar a placa de novo por três dias, sob as mesmas condições que o primo-cultura.
   8. Realizar a cultura final após três dias de incubação da mesma forma que para the primo- e sub-cultura. Incubar a cultura final para dois dias. Em seguida, proceder à detecção.
2. Detecção de lise por Citometria de Fluxo automatizado
   Nota: cultura cego acoplado com a citometria de fluxo difere do sistema padrão anterior de isolamento. É mais sensível, preciso e automatizado. Para fins de detecção, aplicou-se uma nova técnica desenvolvida para detectar lise na maior velocidade e sem observação microscópica. Esta técnica é vantajosa para amostras de triagem e tem melhor sensibilidade do que técnicas mais antigas ^7-9.
   1. Utilizar a placa de 96 poços de co-cultura final para detectar lise.
   2. Ligue o citômetro e executar um ciclo de limpeza e lavagem, a fim de obter menor ruído de fundo de acordo com o protocolo do fabricante.
   3. Inicie o High Throughput Sampler (HTS) combinados com citômetro de fluxo para carregar automaticamente amostras da placa de 96 poços e realizar uma aquisição totalmente automatizado dentro de 40 min according com o protocolo do fabricante.
   4. Configure os HTS da seguinte forma: o volume de amostra de 150 mL, misturando volume de 50 ul, de mistura de velocidade 180, número de misturas 5, o volume de lavagem entre cada mL da amostra 400, taxa de fluxo de 2,5 l / s, número de eventos registrados 10.000.
   5. Avaliar os poços de controlo negativos da co-cultura de micro-placa final, em primeiro lugar, a fim de portão da população ameba e para determinar a percentagem destas células hospedeiras de acordo com as suas características físicas. Certifique-se de ter uma população homogênea ameba e uma segunda população de um eventos inferiores correspondentes a resíduos e ruído.
      Nota: Este procedimento gating distingue detritos subcelular e aglomerados de células individuais por tamanho, estimados pela dispersão para a frente. Portanto, é importante para determinar com precisão a percentagem de cada população usando o melhor procedimento gating possível. Estas percentagens podem variar, especialmente se são utilizados diversos tipos de protozoários, por isso, é importante sempre ter um negative controlo, que podem ser utilizados como a população referência para o resto das amostras.
   6. Comece o gating clicando amostra de aquisição.
   7. Grave o número de eventos não menos de 10.000 eventos.
   8. Localizar a população ameba de interesse usando a seta. Esta é a forma de definir as portas.
   9. Depois de gating, deixe o local HTS ou localizar a placa clicando em 'Home', em seguida, executar toda a placa automaticamente. Execute aquisição e análise de dados de acordo com o tamanho ea estrutura parâmetros (respectivamente, FSC (dispersão para a frente) e SSC (dispersão lateral)).
      Nota: A detecção da perda da população gated-amiba sinaliza a presença de um agente patogénico responsável pela lise amiba. lise protozoários associada com a infecção pelo vírus é detectado com um limiar arbitrariamente concebido de 50% de lise da população ameba fechado pelo analisador e comparada com a mesma população não-infectado utilizado como um controlo negativo fiável.

3. Caracterização dos novos isolados após a detecção de Lise

1. Coloração preliminar para revelar a presença de vírus gigantes
   1. Após a detecção de lise por citometria de fluxo, Pipeta as co-culturas lisadas para suspender as amebas restantes. Em seguida, directamente Cytocentrifuge 50 ul da suspensão a 800 xg durante 10 min.
   2. Após a centrifugação, corrigir as lâminas com uma solução de metanol puro. Manchar os slides usando uma coloração comercial rápida de Eosina / azul Azur e DAPI coloração e observar ao microscópio óptico de 1000X ampliação, a fim de verificar a presença de vírus fábricas.
      1. Para a coloração rápida, mergulhar as lâminas para a primeira solução de eosina (4 s repetidos três vezes), em seguida, passar directamente para mergulhar as lâminas para a segunda solução de fixação contendo azul Azul durante 6 seg, e, finalmente, enxaguar as lâminas durante 45 s com uma solução tampão de fosfato pH 7,2. Deixe os slides para secar em temperatura ambiente, em seguida, proceder à observatiem.
      2. Para a coloração DAPI, depósito de 15 ul da solução-mãe comercial DAPI sobre a lâmina fixa seco. Proteger da luz, em seguida, proceder à observação.
2. Microscópio eletrônico
   1. Após a primeira identificação nos slides, avaliar a presença do vírus gigante através da observação microscopia eletrônica de culturas sobrenadante.
   2. Depósito de 5 ul da amostra positiva para a grade descarregada-brilho. Esperar durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente.
   3. Seca-se a grelha com cuidado e depósito em que uma pequena gota de 1% de molibdato de amónio durante 10 seg. Deixar a grelha secar durante 5 min.
   4. Proceder à microscopia eletrônica em 200 keV.
   5. Coloque a grelha no suporte; introduzir o suporte no microscópio. Verificar a visão geral de vácuo, clicando no ícone correspondente. Feche as válvulas e começar a observação em um tamanho de ponto 5, e ampliação de x 25.000.
   6. Meça o vírus gigante usando ImageJ ou diretaLY no microscópio usando a ferramenta de medida do microscópio localizado na tela de aquisição.
      Nota: classificar a amostra para o grupo Faustovirus com um tamanho da cápside de aproximadamente 200 nm.
3. Biologia molecular
   Nota: Após essa identificação, testes de biologia molecular foram cruciais para a confirmação para distinguir Faustovirus de marseillevirus, que tem o mesmo tamanho do capsídeo e aparência em microscopia eletrônica, embora eles não têm a mesma especificidade de acolhimento. O marseillevirus não pode crescer em Vermamoeba, o Faustovirus é específico para Vermamoeba e todas as tentativas para ele crescer em outros ameba como Acanthamoeba falharam até agora. A concepção e aplicação dos sistemas específicos iniciador / sonda listadas nas obras de Reteno et al. permitiu uma classificação preliminar mais precisa dos vírus recentemente isolados através de amplificação e sequenciamento dos genes virais.
   1. ExADN trato a partir das amostras de cultura positiva usando um sistema de extracção automática de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Realizar-PCR em tempo real utilizando um termociclador, tal como descrito em Reteno et al. ¹⁹
   3. Sequência usando os mesmos iniciadores que foram usados ​​para a amplificação. Use os iniciadores de segmentação subunidade da polimerase de ARN dirigida por ADN 1 gene: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(para a frente) e Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (reverso) com a sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.

4. Virus produção, purificação e Genome Sequencing

1. Subcultura da cultura ameba único vírus para clonagem de diluição de ponto final.
2. Para a produção de: preparar 20 frascos contendo 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba e 5 ml de vírus isolado a partir de poços já transferido para frascos pequenos.
3. Incubar a 30 ° C até estar completalise da amiba. Observar todos os dias por microscopia óptica invertida até que todos os ameba são lisadas.
4. Após a lise completa, reunir todos os frascos para um destinatário. Filtrar com um filtro de 0,45 um para eliminar os detritos.
5. Comece a purificação por ultracentrifugação a 89.800 xg durante 75 min. Certifique-se para calibrar o peso dos tubos antes de iniciar centrifugação.
6. Após centrifugação, remover o sobrenadante a partir de cada tubo por aspiração e re-suspender o sedimento em PAS com o mesmo volume utilizado para a calibração, antes da repetição da centrifugação.
7. Tal como referido acima, remover o sobrenadante e re-suspensão de todas as pastilhas em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS).
8. Purifica-se o vírus que é produzido, utilizando 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 ml de PBS, filtrado num filtro de 0,22 nm).
   1. Use 8 ml de sacarose e 2 ml de suspensão viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS. Armazenar a -80 ° C.

Resultados

O sistema estudado neste manuscrito validado a sua prova de conceito, isolando dois novos Faustoviruses. Das 70 amostras testadas, dois episódios de lise foi detectada, em contraste com os controlos negativos fiáveis. O controlo negativo para a lise continha uma população ameba 86%. Em contraste, as amostras positivas (ST1 para Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 para a amostra de La Ciotat 9) mostraram um declínio dramático no amebas fechado; mais de 60% de amebas foram lisadas c...

Discussão

A possibilidade de que poderia ser Faustovirus o primeiro membro de uma nova família Megavirales perto de VPSA foi primeiro sugerida por Reteno et al., ^19, mas algumas diferenças ainda pode ser distinguida. Parece claro se Faustovirus deve se juntar à família Asfarviridae ou se deve, em vez formar uma nova família viral putativo. Este problema vai exigir uma investigação mais aprofundada, em particular, uma caracterização mais abrangente de sua morfologia, gama de hospedeiros, o ciclo de rep...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020