התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Summary

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Abstract

מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB ^hi1045, ו ^hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו ') ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו') הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.

Introduction

מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ"א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase ^1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase ^2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני ^4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, ^7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם ^10-16.

עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה ¹⁷ (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis ^18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה ^20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות ^21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase ^23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית ^24,25. בשל הזמינות, auroraB ^hi1045, ו ^hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB ^{מ / מ} 'esco2 ^{מ / מ',} בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו ^25-27.

מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה ^25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים ^30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש ^31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית ^33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה ^31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא ^35.

בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.

Protocol

תמלול 1. במבחנה

1. Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל ^31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 'כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן.
2. לטהר את ה- mRNA כתרים באמצעות ערכת טיהור. עקוב אחר ההוראות של היצרן. Elute עם H RNase ללא ₂ O.
3. קבע את הריכוז של RNA על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. (OD ₂₆₀ x דילול x 40 מיקרוגרם / מ"ל).
4. לדלל את RNA ל 100 ng / μl עבור כל H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX עם RNase ללא H ₂ O. אם ריכוז RNA הוא נמוך מדי, את הקרינה תפחת או נעדר. דגימות בהירות תקטנה את חשש phototoxicity ואת photobleaching. מצד השני, גם RNA הרבה יכול להיות רעיל ו / או לגרום מחוץ תופעות יעד.
   הערה: אחסן את הנותריםmRNA מטוהר במקפיא -80 מעלות צלזיוס.

2. גידול דג זברה, אוסף עובר, הזרקת mRNA ^36-38

1. הרכב טנקי רבייה עם מחסום להפריד הטנק לשני אזורים וממלאים כל אקווריום רבייה במי מערכת מדגה בשימוש במתקן דג הזברה.
2. כדי למנוע רבייה בטרם עת, הנח שני דג זכר בצד אחד של המחסום ושני דגים נקבה בצד השני אמש רבייה.
3. למחרת, להפשיר את התערובת mRNA הכין בעבר על הקרח. החלף את המים במיכלים רבייה במי מערכת מדגה טריים להסיר את המחסומים. מייד לאחר המחסומים נמשכים, לחמם עובש הזרקה ל -28.5 מעלות צלזיוס, להגדיר את הציוד עבור microinjection.
   הערה: לקבלת מידע על תבניות להזרקה, עיין גרלך ^36.
4. איסוף ביצים כל 10 - 15 דקות באמצעות מסננת תה ולשטוף את הביצים לתוך צלחת 100 x 15 מ"מ פטרי נקי באות E3 כחול (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ"מ, 0.33 מ"מ ₂ CaCl, 0.33 מ"מ ₄ MgSO, 10 ^-5% מתילן כחול). E3 הכחול משמש למניעת גידול פטרייתי ולהבטיח התפתחות תקינה של דגי זחל. לקבלת מידע נוסף על הזדווגות ואיסוף עובר, עיין גרלך ³⁶ ו Porazinkski ^37.
5. השבץ חד-תאים מבוימים עוברת בתוך תבנית הזרקה חממה ולהזריק את הרנ"א בחלמון בסך הרצוי של עוברים (איור 1 א). חשבון למוות עוברי טבעי עוברים מופרים על ידי ביצוע זריקות עובריות ב -15% יותר עובר מדרוש לצורך הניסוי. לפרטים נוספים על microinjection של עוברי דג הזברה, עיין גרלך ³⁶ ו Porazinkski ^37.
   הערה: לשימוש לראשונה של mRNA, מבצע ניתוח מנה-עקום כדי לקבוע את המינון האופטימלי עבור קרינה ואת הכדאיות (המוגדרת אין פגמים התפתחותיים ברוטו עד 5 DPF) לפני ביצוע הדמית 5D. 150 - 200 ng / μlמוזרק לעוברים הוא לעתים קרובות הריכוז האופטימלי, ולכן הוא נקודת התחלה טובה עבור הריכוז הסופי.
6. בזהירות לחלץ את העוברים המוזרקים מהתבנית בעזרת פיפטה פסטרה זכוכית 9 "שונה. כדי לשנות את פיפטה, להמס את הסוף באמצעות מבער בונזן עד שנוצר כדור.
7. מניחים עוברים מוזרקים בצלחת 100 x 15 מ"מ פטרי ב E3 הכחול ובית C חממת 28.5 °.
8. שש שעות לאחר הזרקה, להסיר כל עוברים מתים או מופרים מהצלחות ולהוסיף נקי E3 הכחול. בית העוברים על 28.5 ° C.

3. הכנה והטבעה של עוברי דג הזברה חי הדמיה (איור 1B)

1. שתי שעות לפני ההדמיה, להקרין את העוברים המוזרקים עבור GFP באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון. מניחים עוברים GFP להביע ירוק בהיר בצלחת 100 x חדש 15 מ"מ פטרי עם E3 כחול.
2. מרתיחים פתרון המניות של agarose נמוכה להמיס 1% על ידי הוספת 1 גרם של נמוכה להמיס agarose ל -100 מ"ל של E3 כחול. לאחר שימוש agarose, מכסה את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. הפתרון המניה נשאר שימושי עד חודש.
3. Aliquot 3 מ"ל של אגר מומסת לתוך צינור תרבות 17 x 100 מ"מ. שמור על חם agarose על ידי הנחת צינור תרבות באמבט מים C ° 42 עד מוכן לשימוש. הכן פתרון 15 מ"מ Tricaine במים deionized כדי להרדים את עוברי דג הזברה ^36.
   הערה: אם ההדמיה קודמת זמן נקודות היא רצויה, הריכוז אגר ניתן ירד נמוך כמו 0.3% ^39.
4. תביאו את 15 מ"מ Tricaine, עוברים הוקרן, נמוכה להמיס agarose, E3 כחול, וצלחת תרבות התחתונה coverslip זכוכית 35 מ"מ עד מיקרוסקופ אור לנתיחה. מוציאים בזהירות את של סיסית העובר עם פינצטה 5 #. האם זה במשך שלושה עוברים.
5. מניחים את העוברים dechorionated במיכל נפרד כדי להיות מורדם. המכסה של המנה coverslip התחתונה משמשת לעתים קרובות למטרה זו. בעזרת פיפטה העברה, להוסיף שלוש טיפות (כ 150 μl)של 15 מ"מ Tricaine כדי בצלחת של כחול 5 מ"ל E3 (אם באמצעות המכסה של צלחת coverslip למטה) או עד עוברים כבר הרדים מספיק. בנוסף, להוסיף 3-4 טיפות (כ 150 - 200 μl) של 15 מ"מ פתרון Tricaine אל הצינור agarose מומסת 1%.
6. בעזרת פיפטה p200 עם 1 ס"מ של קצה פיפטה מנותקים; להעביר את העוברים בהרדמה כדי בצלחת coverslip בעל תחתית. הסר את כל עודפי E3 כחול: פתרון Tricaine.
7. לאט לאט מוסיף 5 - 10 μl של agarose הנמוכה להמס: פתרון Tricaine על עובר, שמירה על כל טיפה נפרדת כדי להבטיח את העוברים לא להיסחף בטעות קרובה אחד לשני.
   אזהרה: אם agarose חם מדי, זה יגרום נזק לעובר. טמפרטורה טובה כדי לשמור על אגרה היא C ° 42.
8. באמצעות מחט 21 G ½ 1, בעדינות לכוון את העובר ב agarose למיקום הרצוי. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה הדמיה זמן לשגות, כוון את האזור של עניין (ROI) קרוב coverslip כמו possible.
   הערה: כללית, באזור הזנב מציע וקלות ההתמצאות בהירות עקב (איור 1 א) יחסית רזה רקמות. רקמות אחרות, כגון שכבת האפיתל סביב קפלי חלמון סנפיר, ניתן להשתמש ^28,29. רקמות אלה מציעות בבהירות רבה, אולם האזורים אלה הם רק כמה שכבות תאים עבים. לצורך בפרוטוקול זה, זה מועיל לתמונה באזור הזנב לרכוש חלוקות תא רבות ככל האפשר.
9. המתן כמה דקות עבור מיצוק חלקי של אגר. השתמש מחט להתפרק פיסה קטנה של אגר כדי לבדוק מיצוק שלה. כאשר פיסה אגר ניתן התרחקה הטיפה, המשך לשלב הבא.
10. מכסה את coverslip כולו עם אגר נמוך להמס ויוצרים כיפה על העוברים המוטבעים. אפשר אגר לגבש לפני הזזת צלחת הדמיה confocal (איור 1 א).
11. במהלך תהליך ההתמצקות אגר (לוקח כ -10 דקות), להכין 3 מיליליטר of E3 כחול פתרון עם חמש טיפות של (כ 250 μl) 15 מ"מ Tricaine להציב על העוברים מוטבע במהלך ההדמיה.

4. הדמיה Confocal 5D של ^40,41 עוברים דג הזברה חי

הערה: ראה Ariga ⁴⁰ ו אובריאן ⁴¹ לפרטים על כיצד לבצע הדמית 5D באמצעות מערכות confocal אחרות. עבור Z-מרווח, Z- מחסנית, Z-עומק, מרווח הזמן, והגדרות 5D ראה תרשים 1C.

1. פתח את תוכנת ההדמיה ולהגדיר מיקרוסקופ כדי 1.4 עדשה אובייקטיבית 60X NA. החל שמן טבילה אל העדשה האובייקטיבית ומניח בצלחת התרבות מחזיקה שקופיות על במת מיקרוסקופ. באמצעות בקר הציר, למרכז את עובר עניין מעל העדשה האובייקטיבית ולהביא את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה כדי לפגוש את מנת התרבות.
2. הקש על סמל עין החתיכה ולעבור מסנן GFP על המיקרוסקופ. דגש על ROI. התמקדות הרקמה הקרובה ביותר coverslip יהיה offer תוצאות ההדמיה הטובות ביותר.
3. הסר את המשתלבים. בחר את ערוצי GFP ו mCherry (אורכי גל שנקבע מראש בתוכנה) ולהגדיר את הקו הממוצע אפשרות לקדמותו.
4. השתמש "צפה / בקרת רכישה / A1 שטח סריקה" פקודה כדי לפתוח את כלי שטח סריקת A1.
5. להתחיל בסריקה. באמצעות בקר הציר, עמדה עובר כך את אזור הסריקה מתמלא כמה שיותר דג הזברה ככל האפשר. כוח לייזר לא צריך להיות אופטימלי בשלב זה. מנמיכים את כוח לייזר כדי למנוע photobleaching מיותר.
6. השתמש "בקרות צפו / רכישה / רכישת ND" פקודה כדי לפתוח את לוח בקרת רכישת ND.
7. בגין סריקה כדי להגדיר את הפרמטרים מחסנית Z. קבע את הגבול העליון Z- מחסנית למקום שבו התאים הם לא בפוקוס גבול תחתון למקום שבו תאים אינם גלויים. לאפשר מרחב 3 מיקרומטר מעל המדגם לצמיחת תנועת תא, אשר עשוי להתרחב לתחום ההדמיה. The Z-ערימה עבור הדמויות המוצגים פרו זהtocol מכוסה בעומק-Z של 40 מיקרומטר הזנב העובר.
8. הגדר את גודל הצעד Z-מרווח 2 מיקרומטר. בממוצע, תא הוא 10 מיקרומטר קוטר; ולכן 2 מיקרומטר יפיקו חמישה במרווחים של נתוני הדמיה להיות מנותחים עבור כל תא.
   הערה: עומק התמונה שניתן לרכוש תלויה מרווח Z. רזולוצית Z הוא הקריב כדי להשיג עומק הכולל בממד Z כדי תמונה כמו תאים רבים עוברים מיטוזה כמו (Z- עומק גדול) אפשרי. המצב ההפוך הוא נכון, באותה, על ידי הפחתת גודל הצעד, ברזולוציה Z הוא זכה, תוך עומק Z הוא הקריב (Z- עומק קטן).
9. התאם את כוח לייזר תמונה, HV, וקיזזו רמות. עבור הניסויים הפגינו פרוטוקול זה, להשתמש בכוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות להגדיר ברמות המקבילות, בהתאמה, עבור ערוץ ה- GFP; 2 - 5, 120 - 140, ו -9 ל -11. עבור ערוץ mCherry, השתמש כוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות, בהתאמה; 3 - 6, 120 - 140, ו -3 כדי-8. לאחר הפרמטרים נקבעים, לכבות את הסריקה כדי למנוע חשיפת ליזר מיותרת שעלולות לגרום phototoxicity ואת photobleaching של המדגם.
10. בחר את סמל מיצוע קו 2x. "אין מיצוע" מייצר תמונה מגורענת בזמן "קו 4x הממוצע" מאריך את זמן הסריקה באופן דרסטי. השימוש מיצוע קו 2x מספק את איכות התמונה הגבוהה ביותר וזמן הסריקה המהירה.
11. בחר את משך המתאים מרווח זמן הזמן הדרוש לצורך הניסוי. עבור חטיבות wild-type, מרווחי זמן של שתי דקות במשך שעה 2. עדיף לקביעת משך mitotic (ששימשו איורים 1, 2, 3 א, ו 3B). חטיבות המפעילות את מחסום הרכבת ציר עבור יותר מ -30 דקות מתאימות יותר של חמש דקות במשך ארבע שעות על מנת לשמר קרינה כפי שמודגם באיור 3C.
12. סמן את תיבת "ולשמור את הקובץ" ואת שם הקובץ כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי כפי שהוא נרכש. בדוק היטב את כל parameters הוגדר כהלכה ופגע "התחל הפעלה".
13. לאחר הרכישה תושלם, כדי לראות את הקובץ בפורמט תלת ממדים, לחץ על סמל סף נפח.

תוצאות

איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק '(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו ...

Discussion

השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCS2 vectors	Gift from K. Kwan		For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3189S	For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	For in vitro transcription
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	For housing embryos
microinjection mold	homemade		For holding embryos during microinjection
Agarose II	Amresco	0815-25G	For embedding embryos
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	For anesthetizing embryos
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C8106	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M7506	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube	Fisher Scientific	50-819-812	For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish	MatTek Corp	P35G-0-20-C	No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers	Dumont	72701-D	For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle	Becton Dickinson	305167	For positioning embryos in agar
Dissecting microscope	Nikon AZ100		For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope	Nikon A1+		For time-lapse imaging
Confocal software	NIS Elements AR 4.13.00		For image acquisition and processing