Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Resumo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Resumo

A mitose é essencial para o crescimento do organismo e diferenciação. O processo é muito dinâmico e requer ordenou eventos para realizar a condensação adequada cromatina, o apego microtúbulos-kinetochore, segregação cromossômica, e citocinese em um pequeno período de tempo. Erros no delicado processo pode resultar em doenças humanas, incluindo defeitos de nascença e câncer. As abordagens tradicionais investigam estados de doença mitótico humanos muitas vezes dependem de sistemas de cultura celular, que não têm a fisiologia natural e contexto de desenvolvimento / específicas do tecido vantajoso quando estudar doenças humanas. Este protocolo supera muitos obstáculos, fornecendo uma forma de visualizar, com alta resolução, a dinâmica de cromossomos em um sistema de vertebrados, o peixe-zebra. Este protocolo irá detalhar uma abordagem que pode ser usada para obter imagens dinâmicas de células em divisão, que incluem: a transcrição in vitro, produção de peixe-zebra / registo, a incorporação de embrião e de imagem time-lapse. Otimização e modifications deste protocolo também são explorados. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas cromatina) e mCherry-CAAX (membrana celular etiquetas) embriões com injecção de mRNA, mitose em AB-tipo selvagem, auroraB ^{hi1045 e hi2865} ESCO2 peixe-zebra mutante é visualizado. Alta resolução de imagem ao vivo no peixe-zebra permite observar várias mitoses quantificar estatisticamente defeitos mitóticas e tempo de progressão da mitose. Além disso, a observação de aspectos qualitativos que definem processos inadequados de mitose (ou seja, defeitos congression, segregação errada dos cromossomas, etc.) e os resultados cromossômicas imprópria (isto é, a aneuploidia, poliploidia, micronúcleos, etc.) são observados. Este ensaio pode ser aplicado para a observação de tecido diferenciação / desenvolvimento e é receptivo à utilização de peixe-zebra mutante e agentes farmacológicos. Visualização de como defeitos na mitose levar a distúrbios de câncer e de desenvolvimento será muitomelhorar o entendimento da patogênese da doença.

Introdução

A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões ao fim-on fixação dos microtúbulos e forças de tensão orientar os cromossomos que formam uma placa metafásica ^1. Se todos os cromossomos estão ligados corretamente, o ponto de verificação de montagem do fuso é satisfeito, anéis coesina segurando as cromátides irmãs em conjunto são clivados, e microtúbulos encurtar a puxar irmãchromatids para pólos opostos durante anaphase ^2,3. A fase final, telofase, envolve o alongamento da célula e reformação do envelope nuclear em torno dos dois novos núcleos. A citocinese completa o processo de divisão, separando o citoplasma das duas células filhas novas ^4-6. Alteração das vias principais de mitose (ou seja, ponto de verificação de montagem do fuso, a duplicação centrossoma, irmã chromatid coesão, etc.) Pode resultar em prisão metaphase, segregação errada dos cromossomas e instabilidade genômica ^7-10. Em última análise, os defeitos nas vias mitose controle pode causar distúrbios do desenvolvimento e câncer, necessitando de visualização de mitose e seus defeitos em um, animal vertebrado, organismo multicelular vivo ^10-16.

embriões de peixe-zebra servir como um grande organismo modelo para imagens ao vivo devido ao tecido transparente, facilidade de microinjeção, e desenvolvimento rápido. Usando peixes-zebra, o objetivo geral deste artigo é o dedescrevem um método de 5D vivo (dimensões X, Y, Z, tempo, e comprimento de onda) imagiologia de mitose ¹⁷ (Figura 1C). O uso de peixe-zebra mutante defeituoso em diferentes vias mitóticas demonstram a consequência de tais defeitos. Para este protocolo, Aurora B e ESCO2 mutantes foram escolhidos para ilustrar esses defeitos. Aurora B é uma cinase que é parte do complexo do cromossoma de passageiros (CPC) envolvida na formação do fuso e do acessório de microtúbulos. Ele também é necessário para a formação de clivagem sulco na citocinese ^18,19. Em peixe-zebra, a deficiência de Aurora B leva a defeitos de indução sulco, citocinese, e segregação cromossomo ^20. ESCO2, por outro lado, é uma acetiltransferase que é essencial para a irmã cromatídeos coesão ^21,22. Ele acetila cohesin na parte SMC3 do anel estabilizando assim cohesin para garantir a segregação cromossômica adequada na transição metaphase-anaphase ^23. Perda de ESCO2 no peixe-zebra leva ao chsegregação errada romosome, irmã separação prematura chromatid, instabilidade genômica e dependente de p53 e apoptose independente ^24,25. Devido à disponibilidade, auroraB ^{hi1045 e hi2865} ESCO2 peixe-zebra mutante (doravante referida como aurB ^{m / m} e ESCO2 ^{m / m,} respectivamente) será usada para ilustrar esta técnica ^25-27.

Acoplamento microscopia confocal com maquinaria da célula fluorescente marcado com permitiu visualizar os investigadores a cromatina e a dinâmica da membrana celular durante a mitose ^25,28,29. histonas fluorescentes etiquetadas têm sido historicamente usado para visualizar cromatina. As histonas são proteínas nucleares compostas por quatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, e H4), que são responsáveis ​​pela estrutura do nucleossoma que compõe ³⁰ cromossomas. Enquanto H2B é indiscutivelmente a histona mais utilizado para proteínas fluorescentes emrato e a cultura de células, a utilização de Histona 2A, Z Família (H2A.F / Z) revelou-se bem para o uso em peixes-zebra ^31,32. Concanavalina A e de caseína-quinase 1-gama por exemplo, localizar na membrana celular e que tenham sido previamente mostrado eficaz em visualizar a membrana celular em Drosophila e ouriços-do-mar ^33,34. Outros estudos têm mostrado que a proteína fluorescente marcado com CAAX rotula a membrana celular e foi bem sucedido em peixes-zebra ^31. CAAX é um motivo que é reconhecida por enzimas modificadoras de pós-traducionais tais como farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modificações por estas enzimas proteínas causar a tornar-se associada a membrana, rotulagem, assim, a membrana da célula ^35.

Devido ao uso prévio no peixe-zebra, este protocolo escolheu usar H2A.F / Z e CAAX para rotular cromatina e da membrana celular. A aplicação do presente método permitirá que o investigador para monitorar a mitose ao nível da célula individual ao observar cromossomadinâmica, como monitorar bem como, simultaneamente múltiplas divisões celulares que podem afetar a diferenciação e desenvolvimento do tecido. Este artigo irá se concentrar em imagiologia a dinâmica da segregação dos cromossomos durante a mitose no nível da célula individual. Dentro deste manuscrito, a capacidade de observar várias divisões mitóticas, calcular o tempo de divisão, e decifrar os fenótipos mitóticas serão ilustradas e discutidas. Ao usar estes parâmetros, fisiologicamente relevantes de dados pode ser recolhido e aplicado a vários estados de doenças afectadas por defeitos mitóticas.

Protocolo

1. transcrição in vitro

1. Linearizar pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / ou vetores pCS2-mCherry-CAAX por restrição NotI enzima digerir ^31. Utilizando um kit de ARN in vitro a transcrição, gerar produtos 5 'de ARNm tapados de cada molde, de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Purifica-se o ARNm utilizando um kit tapados purificação. Siga as instruções do fabricante. Eluir com livre de RNase H ₂ O.
3. Determinar a concentração de ARN por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. (OD ₂₆₀ x diluição x 40 ug / ml).
4. Diluir o RNA a 100 ng / mL para cada H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX com RNase ₂ O. Se a concentração de ARN é muito baixa, a fluorescência será diminuído ou ausente. amostras brilhantes vai diminuir as preocupações sobre a fototoxicidade e fotodegradação. Por outro lado, o excesso de ARN podem ser tóxicos e / ou causar efeitos fora do alvo.
   Nota: guarde o restantemRNA purificado de -80 ° C congelador.

2. Criação de peixe-zebra, colheita de embriões, e mRNA Injection ^36-38

1. Montar tanques de criação com uma barreira para separar o tanque em duas regiões e encher cada tanque de criação com água sistema de aquicultura utilizados na instalação de peixe-zebra.
2. A fim de evitar a reprodução prematura, coloque dois peixes machos em um lado da barreira e dois peixes feminina do outro lado da noite antes de produzir.
3. No dia seguinte, descongelar a mistura previamente preparada de ARNm em gelo. Substitua a água em tanques de criação com água sistema de aquicultura frescos e remover as barreiras. Imediatamente após as barreiras são puxados, aquecer um molde de injecção de 28,5 ° C e configurar o equipamento para microinjecção.
   Nota: Para obter informações sobre moldes de injeção, consulte Gerlach ^36.
4. Recolher os ovos a cada 10 - 15 minutos utilizando um coador de chá e lavar os ovos em um 100 x 15 mm de prato limpo Petri com E3 Azul (5 mM de NaCl, KCl 0,17 mM, _CaCl2 0,33, _MgSO4 0,33 mM, 10 ^-5% azul de metileno). E3 azul é utilizado para evitar o crescimento de fungos e garantir o correcto desenvolvimento de larvas de peixes. Para mais informações sobre o acasalamento e de colheita de embriões, consulte Gerlach ³⁶ e Porazinkski ^37.
5. Incorporar uma célula-encenado embriões num molde de injecção aquecido e injectar o ARN na gema no valor desejado de embriões (Figura 1A). Conta de morte embrionária natural e embriões não fertilizados por realizar injeções embrionárias em 15% mais embriões do que o necessário para o experimento. Para detalhes adicionais sobre a microinjeção de embriões de peixe-zebra, consulte Gerlach ³⁶ e Porazinkski ^37.
   NOTA: Para uso pela primeira vez de mRNA, realizar uma análise de dose-curva para determinar a dose ideal para a fluorescência e viabilidade (definida como ausência de defeitos de desenvolvimento brutas até 5 dpf) antes da realização de imagiologia 5D. 150-200 ng / ulinjectado em embriões é muitas vezes a concentração óptima, portanto, é um bom ponto de partida para a concentração final.
6. Cuidadosamente extrair os embriões injectados desde o molde usando uma versão modificada 9 "pipeta de Pasteur de vidro. Para modificar a pipeta, derreter a fim usando um bico de Bunsen até formar uma bola.
7. Coloque embriões injetados em um prato de 100 x 15 mm Petri na E3 azul e casa em um C incubadora de 28,5 °.
8. Seis horas após a injecção, retire todos os embriões mortos ou não fertilizados das placas e adicionar E3 azul limpo. Casa dos embriões em 28,5 ° C.

3. Preparação e incorporação da Vivo embriões Zebrafish for Imaging (Figura 1B)

1. Duas horas antes de imagem, a tela de embriões injectados para GFP, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente. Coloque embriões verdes brilhantes que expressam GFP em uma nova placa de 100 mm x 15 Petri com E3 Azul.
2. Levar à ebulição uma solução de stock de 1% de agarose de baixa de fusão através da adição de 1 g de agarose a baixo ponto de fusão a 100 ml de E3 azul. Depois de usar a agarose, cobrir o balão com folha de alumínio. A solução permanece útil para até um mês.
3. Aliquota de 3 ml de agar derretido em um tubo de cultura de 17 x 100 mm. Manter a quente de agarose, colocando o tubo de cultura em um banho de água a 42 ° C até que esteja pronto para uso. Preparar uma solução de 15 tricaina mM em água deionizada para anestesiar os embriões de peixe-zebra ^36.
   NOTA: Se imagiologia em pontos de tempo anteriores é desejada, a concentração de ágar pode ser diminuída tão baixo quanto 0,3% ^39.
4. Trazer o mM tricaina 15, embriões selecionados, baixo agarose fundido, E3 Azul, e uma 35 milímetros lamela de vidro cultura fundo prato para um microscópio de luz dissecção. Remova cuidadosamente córion do embrião com # 5 pinças. Faça isso por três embriões.
5. Colocar os embriões dechorionated num recipiente separado a ser anestesiado. A tampa da placa de fundo lamela é frequentemente utilizado para este fim. Usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas (cerca de 150 mL)tricaina de 15 mM para o prato de 5 ml E3 azul (se utilizar a tampa da lamela prato inferior) ou até os embriões foram suficientemente anestesiados. Além disso, adicionar 3-4 gotas (cerca de 150-200 ul) de 15 mM de solução tricaina ao tubo de agarose fundida a 1%.
6. Usando uma pipeta de p200 com 1 cm da ponta da pipeta cortada; transferir os embriões anestesiados para o prato de fundo lamela. Remova qualquer E3 Azul excesso: solução tricaina.
7. Lentamente, adicionar 5 - 10 jul de agarose de baixo ponto de fusão: solução tricaina ao longo dos embriões, mantendo cada gota separada para assegurar que os embriões não acidentalmente deriva perto um do outro.
   Aviso: Se a agarose é muito quente, ele irá danificar o embrião. Uma boa temperatura para manter o agar é a 42 ° C.
8. Usando uma agulha de 21 G 1 ½, gentilmente orientar o embrião no agarose para a posição desejada. Ao usar um microscópio invertido para geração de imagens de lapso de tempo, oriente a região de interesse (ROI) tão perto da lamela como possible.
   Nota: Para fins gerais, a região da cauda oferece facilidade de orientação e clareza devido ao tecido relativamente fino (Figura 1A). Outros tecidos, tais como a camada epitelial em torno das pregas de gema e de aleta, pode ser utilizada ^28,29. Estes tecidos oferecem grande clareza, no entanto estas regiões são apenas algumas camadas de células de espessura. Para o propósito deste protocolo, é benéfico para a imagem região da cauda para adquirir como muitas divisões celulares quanto possível.
9. Permitir que um min poucos para a solidificação parcial do ágar. Usar a agulha para separar um pequeno pedaço de ágar para testar a sua solidificação. Quando um pedaço de agar pode ser puxado para fora da gota, prossiga para a próxima etapa.
10. Cobrir toda a lamela com baixa agar fundido formando uma cúpula sobre os embriões embutidos. Permitir que o agar solidificar antes de mover o prato para imagiologia confocal (Figura 1A).
11. Durante o processo de solidificação de agar (demora cerca de 10 min), 3 ml de o prepararf E3 solução azul com cinco gotas de (aproximadamente 250 ul) tricaina 15 mM a ser colocada sobre os embriões incorporados durante o exame.

4. 5D Imagem Confocal de US Jogos de embriões Zebrafish ^40,41

NOTA: Ver Ariga ⁴⁰ e O'Brien ⁴¹ para detalhes sobre como realizar imagem 5D usando outros sistemas confocal. Para Z-intervalo, Z-pilha, profundidade Z, intervalo de tempo, e definições 5D ver Figura 1C.

1. Abra o software de imagem e definir o microscópio para 60X NA 1.4 lente objetiva. Aplicar óleo de imersão para a lente objetiva e coloque o prato de cultura no compartimento de slides no palco microscópio. Usando o controlador de eixo, o centro do embrião de interesse acima da lente objectiva e trazer a lente objectiva para cima ao encontro do prato de cultura.
2. Clique no ícone da parte do olho e mudar para o filtro GFP no microscópio. Concentre-se no ROI. Centrando-se no tecido mais próximo da lamela será offer os melhores resultados de imagem.
3. Remova o encravamento. Selecionar os canais de GFP e mCherry (comprimentos de onda pré-estabelecidos em software) e definir a linha de opção ao normal média.
4. Use "Controles de Ver / Aquisição / A1 Área de Digitalização" comando para abrir a ferramenta A1 Área de Digitalização.
5. Iniciar a digitalização. Usando o eixo-controlador, posicionar o embrião de modo que a área de leitura é preenchido com tanto do peixe-zebra quanto possível. A potência do laser não precisa de ser óptima a este ponto. Diminuir a potência do laser para evitar a fotodegradação desnecessário.
6. Use os "Controles de Ver / Aquisição / aquisição ND" comando para abrir o painel de controle de aquisição da ND.
7. Iniciar a digitalização para definir os parâmetros Z-stack. Defina o limite superior Z-stack para onde as células não estão em foco e limite inferior para onde as células não são mais visíveis. Permitir um espaço de 3 micrómetros acima da amostra para o crescimento e o movimento celular, o que pode expandir-se para o campo de imagem. O Z-stack para as figuras mostradas neste proprotocolo cobriu uma Z-profundidade de 40 mm na cauda do embrião.
8. Defina o tamanho do Z-interval passo para 2 mm. Em média, uma célula é de 10 um de diâmetro; portanto, 2 m vai produzir cinco intervalos de dados de imagem a ser analisada para cada célula.
   NOTA: A profundidade da imagem que pode ser adquirida depende do intervalo Z. resolução Z é sacrificado para ganhar profundidade total na dimensão Z, a fim de imagem como muitas células que sofrem mitose possível (grande profundidade Z). O inverso é verdadeiro, na medida em que, ao diminuir o tamanho do passo, a resolução Z é adquirida, enquanto Z profundidade é sacrificado (pequena profundidade Z).
9. Ajustar a potência do laser de imagem, HV, e compensar os níveis. Para os experimentos demonstraram neste protocolo, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar níveis fixados nos níveis correspondentes, respectivamente, para o canal de GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Para o canal mCherry, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar os níveis, respectivamente; 3-6, 120-140, e -3 para-8. Uma vez que os parâmetros são definidos, desligue a varredura para evitar a exposição a laser desnecessário que pode causar fototoxicidade e fotodegradação da amostra.
10. Selecione o ícone de média linha de 2x. "Não média" produz uma imagem granulada enquanto "linha 4x média" aumenta drasticamente o tempo de verificação. Uso de linha 2x média proporciona a melhor qualidade de imagem e tempo mais rápido de digitalização.
11. Seleccione a duração do intervalo de tempo e tempo adequados necessários para o experimento. Para divisões de tipo selvagem, os intervalos de tempo de dois minutos durante 2 horas é o melhor para determinar a duração mitótico (utilizados nas Figuras 1, 2, 3A e 3B). Divisões que activam o ponto de verificação para a montagem do eixo mais longo do que 30 minutos são mais adequados para intervalos de cinco minutos, durante quatro horas, a fim de preservar a fluorescência como demonstrado na Figura 3C.
12. Marque a caixa "salvar em arquivo" e nome do arquivo para salvar automaticamente o arquivo tal como ele está sendo adquirido. verifique todos os patros estão definidos corretamente e clique em "começar a correr".
13. Após a aquisição for concluída, para exibir o arquivo em um formato tridimensional, clique no ícone do limiar de volume.

Resultados

A Figura 2 demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares utilizando uma ampla visão de campo de um tipo selvagem de cauda de peixe-zebra AB. Mais de sete células mitóticas são gravadas em um prazo de 14 min (Filme 1). Dentro de duas horas tempo de curso, mais de 40 eventos de mitose foram capturados. Em média, 50 células em divisão foram observados no AB e 30 células que se dividem em AUR B ^{M / m} embri...

Discussão

A utilização deste método permite inferir colapso nuclear de envelope, a formação de uma placa de metafase por anexos microtubule-cinetocoro, e a segregação de cromatídeos irmãos para formar duas novas células in vivo e de um modo dependente do tempo. A capacidade de observar a mitose no peixe-zebra é vantajosa em relação a amostras fixadas e sistemas de cultura de células porque as células estão a ser trabalhada na fisiologia natural, o tecido é transparente, o que permite que as proteínas fl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCS2 vectors	Gift from K. Kwan		For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3189S	For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	For in vitro transcription
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	For housing embryos
microinjection mold	homemade		For holding embryos during microinjection
Agarose II	Amresco	0815-25G	For embedding embryos
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	For anesthetizing embryos
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C8106	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M7506	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube	Fisher Scientific	50-819-812	For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish	MatTek Corp	P35G-0-20-C	No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers	Dumont	72701-D	For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle	Becton Dickinson	305167	For positioning embryos in agar
Dissecting microscope	Nikon AZ100		For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope	Nikon A1+		For time-lapse imaging
Confocal software	NIS Elements AR 4.13.00		For image acquisition and processing