라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

요약

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

초록

유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 ^{hi1045 및} 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 ^hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

서문

유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 ^(1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 ^{말기), 3} 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 ^4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집, 등.)의 변경은 중기 체포, 염색체의 missegregation 및 게놈 불안정 ^7-10 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 경로 제어 유사 분열에 결함이 발달 장애 및 암, 유사 분열의 필요로 시각화 및 라이브, 척추, 다세포 유기체 ^{10-16에서의} 결함의 원인이 될 수 있습니다.

제브라 피쉬 배아 인해 투명한 조직, 미세 주입의 용이성, 빠른 발전에 라이브 영상을위한 훌륭한 모델 생물의 역할을한다. 제브라 피쉬를 사용하여,이 원고의 전반적인 목표는이다라이브 5D 분열 ⁽¹⁷⁾ (도 1C)의 (차원 X, Y, Z, 시간 및 파장) 이미징하는 방법을 설명한다. 다른 유사 분열 경로에 결함이있는 돌연변이 제브라 피쉬의 사용은 이러한 결함의 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜의 경우, 오로라 B와 Esco2 돌연변이는 이러한 결함을 설명하기 위해 선택되었다. 오로라 B는 스핀들 형성 및 미세 소관의 부착에 관여하는 염색체 승객 복잡 (CPC)의 일부인 키나제이다. 또한 세포질 분열 ^18,19 분열 고랑 형성을 위해 필요하다. 제브라 피쉬에서 오로라 B 결핍은 밭고랑 유도, 세포질 분열과 염색체 분리 ^(20)의 결함으로 이어집니다. Esco2 반면에, 자매 염색 분체의 응집 ^21,22 필수 인 아세틸이다. 그것은 이렇게 중기-anaphase (핵분열 말기) 천이 ²³ 적절한 염색체 분리를 보장하기 cohesin 안정화 링 SMC3 부에 cohesin을 아세틸 레이트. 제브라 피쉬의 Esco2의 손실으로 Ch 리드romosome missegregation, 조기 자매 염색 분체 분리, 게놈의 불안정성 및 p53의 종속 및 독립적 인 세포 사멸 ^{(24, 25).} 인해 가용성 auroraB의 ^{hi1045 및} esco2의 ^hi2865 돌연변이 제브라 ^{25-27이 기술을} 설명하기 위해 사용될 것이다 (이하 aurB ^{m / m} 및 ^m 개의 esco2 ^{/ m 각각이라} 함).

형광 태그 셀 기계와 커플 링 공 초점 현미경은 유사 분열 ^25,28,29 동안 크로 마틴과 세포막 역학을 시각화하는 연구자 수있었습니다. 형광 태그가 히스톤은 역사적으로 염색질을 시각화하는 데 사용되었다. 히스톤은 염색체 ^(30)를 구성하는 뉴 클레오 구조에 대한 책임이 있습니다 네 가지 쌍 (H2A, H2B, H3 및 H4)로 구성된 핵 단백질이다. H2B는 틀림없이 형광 단백질을 가장 많이 사용되는 히스톤 동안마우스와 세포 배양, 히스톤 2A의 사용, 가족 Z (H2A.F / Z)는 제브라 피쉬 ^{(31, 32)에} 사용하기 위해 잘 입증하고있다. 콘 카나 발린 A와 카제인 키나제 1-γ는 예를 들어, 세포막에 지역화 및 이전 성게 초파리 ^{(33, 34)의} 세포막을 시각화 효과적인 것으로 나타났다. 다른 연구는 CAAX 형광 표지 된 단백질이 세포막 라벨 것을 도시 제브라 ^31에 성공했다. CAAX는 farnesyltransferases 및 geranylgeranyltransferases로 번역 후 수정 효소에 의해 인식되는 주제이다. 이 효소에 의해 변형 단백질 따라서 세포막 ⁽³⁵⁾ 라벨, 멤브레인 관련되는 원인.

때문에 제브라 피쉬에서 사용하기 전에,이 프로토콜은 염색질과 세포막에 라벨을 H2A.F / Z와 CAAX를 사용하기로 결정했습니다. 이 방법의 응용 프로그램은 각각의 염색체를 관찰하는 연구자가 개별 세포 수준에서 유사 분열을 모니터링 할 수 있습니다역학뿐만 아니라, 동시에 조직 분화 및 발달에 영향을 미칠 수있는 여러 세포 분열을 모니터링한다. 이 문서는 개별 세포 수준에서 유사 분열시 염색체 분리의 역학 이미징에 초점을 맞출 것이다. 이 논문 내에서 여러 분열 분열 관찰 분할 시간을 계산하고, 유사 분열 표현형을 해독 할 수있는 능력은 도시되고 논의 될 것이다. 이러한 매개 변수를 사용하여 생리적으로 관련된 데이터가 수집 될 수 있고, 유사 분열 결함의 영향을 여러 질환 상태에 적용 하였다.

프로토콜

1. 시험 관내 전사

1. 효소 ^(31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 'mRNA의 캡 제품을 생성한다.
2. 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H ₂ O로 용출
3. 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD ₂₆₀ X 희석 × 40 μg의 / ㎖).
4. 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H ₂ O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다.
   참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA.

2. Zebrafish의 사육, 배아의 수집 및 mRNA의 주입 ^36-38

1. 두 개의 영역으로 탱크를 분리 제브라 피쉬 시설에 사용되는 양식 시스템 물 각각의 사육 탱크를 채우기 위해 장벽 사육 탱크를 조립합니다.
2. 사육 전날 밤, 불의의 번식을 방지하기 위해 다른면에 배리어의 일측 두 개의 암컷 어류 수컷을 배치하기 위해.
3. 다음 날, 얼음에 이전에 제조 된 mRNA의 혼합물을 해동. 신선한 양식 시스템 물 사육 탱크에 물을 교체하고 장벽을 제거합니다. 장벽이 가져온 후 즉시, 28.5 ° C로 사출 금형을 따뜻하게하고 미세 주입을위한 장비를 설정합니다.
   참고 : 사출 금형에 대한 자세한 내용은 라흐 ^(36)을 참조하십시오.
4. 차 여과기를 사용하여 15 분, E와 깨끗한 100 × 15mm 페트리 접시에 계란을 씻어 - 계란마다 10 수집3 블루 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 _CaCl2를, 0.33 mM의 _황산, 10 ^-5 % 메틸렌 블루). E3은 푸른 곰팡이 성장을 방지하고, 물고기 유충 적절한 발전을 위해 사용된다. 결합 및 배아 컬렉션에 대한 자세한 내용은 라흐 ³⁶ Porazinkski ^(37)을 참조하십시오.
5. 삽입 한 셀은 가온 사출 금형에서 배아를 단계적 배아 (도 1a)의 목적하는 양으로 난황에 RNA를 주입. 자연 배아 죽음과 실험에 필요한 것보다 15 % 더 많은 배아에서 배아 주사를 수행하여 미 수정 배아를 차지한다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대한 자세한 내용은 라흐 ³⁶ Porazinkski ^(37)을 참조하십시오.
   주 : mRNA를 처음으로 사용하기 위해서는 종래 5D 촬상을 수행하는 (최대 5 DPF없이 총 발달 결함으로 정의)의 형광과 생존에 대한 최적 투여 량을 결정하기 위해 용량 - 곡선 분석을 수행한다. 150-200 NG / μL수정란 내로 주입 따라서는 최종 농도를위한 좋은 출발점이 종종 최적 농도이다.
6. 조심스럽게 수정 된 9 "유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 금형에서 주입 된 배아를 추출합니다. 피펫을 수정하려면,이 공을 형성 할 때까지 분젠 버너를 사용하여 끝을 용융.
7. 28.5 ° C 배양기에서 100 × 15mm 페트리 E3 블루에서 요리와 집에서 주입 된 배아를 놓습니다.
8. 포스트 분사 여섯 시간은 플레이트에서 죽은 또는 미 수정 배아를 제거하고 깨끗한 E3 블루를 추가합니다. 28.5 ° C에서 하우스 배아.

3. 준비 및 이미징에 대한 라이브 Zebrafish의 태아의 포함 (그림 1B)

1. 두 시간 이미징 전에 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP에 대한 주입 된 배아를 화면. E3 블루와 새로운 100 × 15mm 페트리 접시에 밝은 녹색 GFP 발현 배아를 놓습니다.
2. 아가 E3 블루 100 ml의 낮은 용융 1g을 첨가하여 1 % 저 용융 아가 로스의 스톡 용액을 끓여. 아가로 오스를 사용한 후 알루미늄 호일로 플라스크를 커버한다. 원액 한 달까지 유용 남아있다.
3. 분취 액을 17 X 100mm 배양 관 내로 용융 아가 3 ㎖. 사용할 준비가 될 때까지 42 ° C의 물을 욕조에 문화 튜브를 배치하여 아가 로스를 따뜻하게 유지합니다. 제브라 피쉬 배아 ⁽³⁶⁾ 마취 탈 이온수에 15 mM의 Tricaine 솔루션을 준비합니다.
   주 : 이전 시점의 영상을 원하는 경우, 한천의 농도가 0.3 %로 낮은 ^39으로 감소 될 수있다.
4. 15 mM의 Tricaine, 상영 배아, 낮은 용융 아가로 오스, E3 블루, 및 해부 광학 현미경에 35mm 유리 커버 슬립 바닥 배양 접시를 가져옵니다. 조심스럽게 # 5 핀셋으로 배아의 융모막을 제거합니다. 세 개의 배아에 대해이 작업을 수행합니다.
5. 별도의 용기에 dechorionated 배아를 마취 할 수 놓습니다. 커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑은 주로 이러한 목적으로 사용된다. 전송 피펫을 사용하여, 세 방울을 추가 (약 150 μL)나까지 배아 충분히 마취 된 (커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑을 사용하는 경우) 5 ml의 E3 블루의 접시에 15 mM의 Tricaine의. 1 % 용융 아가로 오스 튜브에 15 mM의 Tricaine 솔루션 - (200 ㎕를 약 150) 또한, 3 ~ 4 방울을 추가합니다.
6. 차단 피펫 팁 1 cm와 P200 피펫을 사용하여; 커버 슬립 바닥 접시에 마취 배아를 전송합니다. Tricaine 솔루션 : 초과 E3 블루를 제거합니다.
7. 배아 실수로 서로 가까이 표류하지 않도록하기 위해 별도의 각 드롭을 유지, 배아를 통해 Tricaine 솔루션 : 낮은 용융 아가로 오스 10 ㎕의 - 천천히 다섯을 추가합니다.
   경고 : 아가로 오스가 너무 따뜻 경우에는 배아를 손상시킬 수 있습니다. 42 °의 C이다에 좋은 온도는 한천을 유지합니다.
8. 21 G 1 ½ 바늘을 사용하여 부드럽게 원하는 위치로 오스에서 배아의 방향. 시간 경과 이미징을위한 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, possib로 커버 슬립에 가까운 관심 (ROI)의 영역의 방향르.
   주 : 일반 목적 꼬리 영역 인해 비교적 얇은 조직 (도 1a)에 배향하고 명료 용이성을 제공한다. 이러한 노른자 및 핀 폴드를 둘러싸는 상피층 등 기타 조직, ^{28, 29을} 이용할 수있다. 이 조직은 그러나이 지역은 불과 몇 세포층 두께이며, 좋은 선명도를 제공합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 가능한 한 많은 세포 분열을 취득 꼬리 영역은 이미지에 유익하다.
9. 한천의 부분 응고에 대한 몇 분을 허용합니다. 그 응고를 테스트하기 위해 한천의 작은 조각 떨어져 휴식 바늘을 사용합니다. 한천의 조각을 드롭에서 멀리 당겨 할 수있는 경우, 다음 단계로 진행합니다.
10. 낮은 용융 한천이 포함 된 배아를 통해 돔을 형성하는 전체 커버 슬립을 커버. 한천은 공 초점 영상 (그림 1A)의 요리를 이동하기 전에 응고하도록 허용합니다.
11. 한천 응고 공정 (약 10 분 소요) 동안, 3 ㎖ O 준비(약 250 μL) 15 mM의 Tricaine의 다섯 방울과 F E3 블루 솔루션은 영상 중에 포함 된 배아 위에 배치합니다.

라이브 Zebrafish의 배아 ^{40, 41의} 4 5D 공 촛점 이미징

참고 : 다른 공 초점 시스템을 사용하여 5D 영상을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 아리가 ⁴⁰ 오브라이언 ^(41)을 참조하십시오. Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격 및 5D의 정의는 그림 1C를 참조하십시오.

1. 이미징 소프트웨어를 열고 60X NA 1.4 대물 렌즈로 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈에 침지 기름을 적용하고 현미경 무대에 슬라이드 홀더에 배양 접시를 놓습니다. 축 제어기를 사용하여, 대물 렌즈를 상기 관심 배아 센터와 배양 접시에 맞게 상승 대물 렌즈를 가져온다.
2. 눈 조각 아이콘을 클릭하고 현미경에 GFP 필터로 전환합니다. 투자 수익 (ROI)에 초점을 맞 춥니 다. O를 coverslip에 가장 가까운 조직에 초점을 것입니다최적의 촬상 결과 ffer.
3. 연동을 제거합니다. (소프트웨어에서 사전 설정된 파장)에 GFP 및 mCherry 채널을 선택하고 정상에 옵션을 평균 라인을 설정합니다.
4. 사용 "보기 / 취득 컨트롤 / A1 스캔 영역"은 A1 스캔 영역 도구를 엽니 명령.
5. 스캔을 시작합니다. 스캔 영역이 가능한 제브라만큼 충전되도록 축 제어기를 이용하여 태아의 위치. 레이저 출력은이 점에서 최적으로 할 필요가 없다. 불필요한 광표백을 피하기 위해 레이저 파워를 낮 춥니 다.
6. ND 취득 제어판을 열고 "보기 / 취득 컨트롤 / ND 취득"명령을 사용하십시오.
7. Z 축 스택 매개 변수를 설정 스캔을 시작합니다. 세포가 더 이상 볼 수 있습니다 위치로 Z-스택 세포에 초점이없는 경우에 상한과 하한을 설정합니다. 촬상 영역으로 확장 할 수있다 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3 ㎛의 공간 허용한다. 이 프로에 도시 된 도면의 Z 스택로토콜은 배아의 꼬리에 40 ㎛의 Z-깊이 덮여있다.
8. 2 μm의에 Z-간격 스텝 크기를 설정합니다. 평균 셀 직경 10 ㎛의이며; 따라서, 2㎛는 촬상 데이터 다섯 간격은 각각의 셀에 대해 분석되도록 생성된다.
   참고를 취득 할 수있는 화상의 깊이는 Z 간격에 의존한다. Z 해결 가능한 (Z-큰 깊이)와 같은 유사 분열을 겪고 많은 세포로서 이미지를 위하여 Z 차원의 전체 깊이를 얻기 위해 희생된다. Z 깊이 (Z-작은 깊이)를 희생하는 동안 그 역으로, 사실, 스텝 사이즈를 감소시킴으로써, Z 해상도가 얻어진다.
9. 화상 레이저 파워, HV을 조정 레벨 오프셋. 실험이 프로토콜에서 설명 들어, 다음의 레이저 파워, HV를 사용하여 GFP 채널에 각각 상응하는 레벨로 설정된 레벨을 오프셋 (5), (120) - - 2 (140), 및 -11에 -9. mCherry 채널 들어, 다음 레이저 파워, HV를 사용하고, 각 레벨을 오프셋 3-6, 120-140, 및 -3-8. 매개 변수가 설정되면, 샘플의 광독성 및 광표백 될 수 있습니다 불필요한 레이저 노출을 방지하기 위해 스캔을 종료합니다.
10. 2 번 라인의 평균 아이콘을 선택합니다. "평균 4 배 라인은"크게 스캔 시간을 증가하는 동안 "아무 평균"는 거친 이미지를 생성합니다. 배 선 평균의 사용은 이미지 품질과 빠른 스캔 시간 최고의 제공합니다.
11. 실험에 필요한 적절한 시간 간격 및 시간 지속 기간을 선택한다. 야생형 구분 내용을 2 시간 2 분의 시간 간격 (도 1,도 2,도 3a 및도 3b에서 사용) 분열 기간을 결정하기위한 최선이다. 이상 30 분 동안 스핀들 조립 검사 점을 활성화 부문도 3c에 설명 된대로 형광을 유지하기 위해 네 시간 다섯 분 간격으로 더 적합하다.
12. "파일 저장"상자를 선택하고이 획득되고 자동으로 파일을 저장할 파일 이름을 지정합니다. 모든 파 더블 체크rameters 올바르게 설정하고 "실행을 시작합니다"충돌한다.
13. 인수가 완료되면, 세 차원 형식의 파일을 볼 볼륨 임계 값 아이콘을 클릭합니다.

결과

그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B ^{m / m...}

토론

이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCS2 vectors	Gift from K. Kwan		For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3189S	For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	For in vitro transcription
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	For housing embryos
microinjection mold	homemade		For holding embryos during microinjection
Agarose II	Amresco	0815-25G	For embedding embryos
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	For anesthetizing embryos
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C8106	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M7506	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube	Fisher Scientific	50-819-812	For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish	MatTek Corp	P35G-0-20-C	No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers	Dumont	72701-D	For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle	Becton Dickinson	305167	For positioning embryos in agar
Dissecting microscope	Nikon AZ100		For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope	Nikon A1+		For time-lapse imaging
Confocal software	NIS Elements AR 4.13.00		For image acquisition and processing