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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Résumé

La mitose est critique pour la croissance de organismal et la différenciation. Le processus est très dynamique et nécessite ordonné des événements pour accomplir la condensation appropriée de la chromatine, l'attachement des microtubules-kinétochore, la ségrégation des chromosomes, et la cytokinèse dans un petit cadre de temps. Des erreurs dans le délicat processus peut entraîner des maladies humaines, y compris des malformations congénitales et le cancer. Les approches traditionnelles de l'enquête états pathologiques mitotique humains reposent souvent sur des systèmes de culture cellulaire, qui manquent de la physiologie naturelle et contexte de développement / tissu-spécifique avantageux lors de l'étude des maladies humaines. Ce protocole permet de surmonter de nombreux obstacles en fournissant un moyen de visualiser, avec une haute résolution, la dynamique des chromosomes dans un système de vertébrés, le poisson zèbre. Ce protocole détaille une approche qui peut être utilisée pour obtenir des images dynamiques de cellules en division, qui comprennent: la transcription in vitro, l' élevage du poisson zèbre / collecte, embryon plongement et imagerie time-lapse. Optimisation et modifications de ce protocole sont également explorées. Utilisation de H2A.F / Z-EGFP (étiquettes chromatine) et mCherry-CAAX (de la membrane cellulaire des étiquettes) des embryons d'ARNm-injecté, mitose dans de type sauvage AB, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant est visualisé. Imagerie haute résolution en direct chez le poisson zèbre permet d'observer plusieurs mitoses à quantifier statistiquement défauts mitotiques et le timing de la progression mitotique. En outre, l' observation des aspects qualitatifs qui définissent les processus inappropriés mitotiques ( par exemple, des défauts de congression, de chromosomes mauvaise ségrégation, etc.) et les résultats chromosomiques incorrecte (ie, aneuploïdie, polyploïdie, micronoyaux, etc.) sont respectées. Cet essai peut être appliqué à l'observation de la différenciation tissulaire / développement et se prête à l'utilisation du poisson zèbre mutant et agents pharmacologiques. Visualisation de la façon dont les défauts en mitose conduisent à des troubles du cancer et de développement sera grandementaméliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie.

Introduction

La mitose est un processus essentiel du cellulaire critique pour la croissance, la différenciation et la régénération dans un organisme vivant. Lors de la préparation précise et la réplication de l'ADN en interphase, la cellule est amorcée à se diviser. La première phase de la mitose, la prophase, est initiée par l'activation de la cycline B / Cdk1. Prophase est caractérisé par la condensation de la matière de la chromatine dans les chromosomes. répartition de l'enveloppe nucléaire se produit à la transition entre prophase et prométaphase. Dans prométaphase, centrosomes, le centre de nucléation pour la formation du fuseau, commencent à migrer vers les pôles opposés tout en étendant microtubules à la recherche de l'attachement kinétochore. Lors de la fixation, les conversions pour mettre fin sur l' attachement des microtubules et des forces de tension orientent les chromosomes formant une plaque de métaphase 1. Si tous les chromosomes sont correctement fixés, le point de contrôle de l'ensemble de la broche est satisfaite, les anneaux de cohésine tenant les chromatides sœurs ensemble sont clivés et microtubules raccourcir pour tirer soeurchromatides à des pôles opposés pendant anaphase 2,3. La phase finale, télophase, implique un allongement de la cellule et de la réforme de l'enveloppe nucléaire autour des deux nouveaux noyaux. Cytokinèse achève le processus de division en séparant le cytoplasme des deux nouvelles cellules filles 4-6. Altération des principales voies mitose (c. -à- broche ensemble checkpoint, duplication centrosome, soeur chromatides cohésion, etc.) Peut entraîner la métaphase arrestation, de chromosomes mauvaise ségrégation, et de l' instabilité génomique 7-10. En fin de compte, les défauts dans les voies de la mitose contrôle peuvent provoquer des troubles du développement et cancer, nécessitant la visualisation de la mitose et ses défauts dans un vertébré, organisme multicellulaire en direct 10-16.

embryons de poisson zèbre servent comme un grand organisme modèle pour l'imagerie en direct en raison du tissu transparent, la facilité de microinjection, et le développement rapide. En utilisant zebrafish, l'objectif global de ce manuscrit est dedécrivent un procédé de 5D en temps réel (dimensions X, Y, Z, du temps et de longueur d' onde) d' imagerie de la mitose 17 (figure 1C). L'utilisation de zebrafish mutant défectueux dans différentes voies mitose démontrer la conséquence de tels défauts. Pour ce protocole, les mutants Aurora B et Esco2 ont été choisis pour illustrer ces défauts. Aurora B est une kinase qui fait partie du complexe chromosome de passagers (CPC) impliqués dans la formation du fuseau et de l'attachement des microtubules. Il est également nécessaire pour la formation de clivage de sillon dans cytokinesis 18,19. Chez le poisson zèbre, un déficit Aurora B conduit à des défauts dans l' induction sillon, cytocinèse, et la ségrégation des chromosomes 20. Esco2, d'autre part, est une acétyltransférase qui est essentiel pour la cohésion des chromatides sœurs 21,22. Il acétyle cohesin sur la partie SMC3 de l'anneau stabilisant ainsi cohesin pour assurer la séparation des chromosomes lors de la transition métaphase-anaphase 23. Perte de Esco2 chez le poisson zèbre conduit à chromosome mauvaise ségrégation, prématurée des chromatides sœurs séparation, l' instabilité génomique, et p53-dépendante et l' apoptose indépendante 24,25. En raison de la disponibilité, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant (ci - après dénommé aurB m / m et esco2 m / m, respectivement) sera utilisé pour illustrer cette technique 25-27.

Couplage microscopie confocale à fluorescence machinerie cellulaire étiquetée a permis aux chercheurs de visualiser la chromatine et la membrane cellulaire lors de la mitose dynamique 25,28,29. histones fluorescents marqués ont été historiquement utilisé pour visualiser la chromatine. Les histones sont des protéines nucléaires composées de quatre paires différentes (H2A, H2B, H3 et H4) qui sont responsables de la structure des nucléosomes qui compose les chromosomes 30. Alors que H2B est sans doute le histone le plus utilisé pour des protéines fluorescentes dansla souris et de la culture cellulaire, l' utilisation de Histone 2A, Z de famille (H2A.F / Z) a bien prouvé pour une utilisation dans zebrafish 31,32. Concanavaline A et la caséine kinase 1-gamma par exemple, à localiser la membrane cellulaire et ont été précédemment montré efficace pour la visualisation de la membrane cellulaire dans les oursins et 33,34 drosophile. D' autres études ont montré que la protéine fluorescente CAAX étiquetée étiquettes de la membrane cellulaire et a réussi à 31 zebrafish. CAAX est un motif qui est reconnu par les enzymes de modification post-traductionnelles telles que farnesyltransferases et geranylgeranyltransferases. Modifications par ces enzymes provoquent des protéines à devenir associées à la membrane, ainsi le marquage de la membrane cellulaire 35.

En raison de l'utilisation préalable zebrafish, ce protocole a choisi d'utiliser H2A.F / Z et CAAX pour marquer la chromatine et la membrane cellulaire. L'application de cette méthode permettra au chercheur de surveiller la mitose au niveau de la cellule individuelle pour observer le chromosome individueldynamique, comme le suivi ainsi que simultanément plusieurs divisions cellulaires qui peuvent influer sur la différenciation et le développement des tissus. Cet article se concentrera sur l'imagerie de la dynamique de la ségrégation des chromosomes lors de la mitose au niveau de la cellule individuelle. Dans ce manuscrit, la capacité d'observer plusieurs divisions mitotiques, calculer le temps de division, et de déchiffrer les phénotypes mitotiques sera illustrée et discutée. En utilisant ces paramètres, physiologiquement les données pertinentes peuvent être collectées et appliquées à plusieurs états pathologiques affectés par des défauts mitotiques.

Protocole

1. Transcription in vitro

  1. Linéariser pCS2-H2A.F / Z-EGFP et / ou vecteurs pCS2-mCherry-CAAX par restriction Notl enzyme digérer 31. L' utilisation d' un ARN dans le kit de transcription in vitro, de générer des produits 5 'd'ARNm coiffés à partir de chaque modèle, selon le protocole du fabricant.
  2. Purifier l'ARNm coiffés en utilisant un kit de purification. Suivez les instructions du fabricant. Eluer avec RNase-H 2 O.
  3. Déterminer la concentration d'ARN par absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. (DO 260 x dilution x 40 ug / ml).
  4. Diluer l'ARN à 100 ng / pl pour chaque H H2A.F / Z-EGFP et mCherry-CAAX avec RNase 2 O. Si la concentration en ARN est trop faible, la fluorescence sera diminuée ou absente. échantillons Brighter diminuera les inquiétudes sur phototoxicité et photoblanchiment. D'autre part, trop d'ARN peuvent être toxiques et / ou provoquer des effets hors cible.
    Remarque: Conservez le resteARNm purifié à -80 ° C congélateur.

2. Elevage Zebrafish, Embryon Collection, et l' ARNm Injection 36-38

  1. Assembler bassins d'élevage avec une barrière pour séparer le réservoir en deux régions et remplir chaque réservoir d'élevage avec de l'eau du système d'aquaculture utilisé dans l'établissement zebrafish.
  2. Afin d'éviter la reproduction prématurée, placer deux poissons mâles d'un côté de la barrière et deux poissons femelles de l'autre côté de la nuit avant la reproduction.
  3. Le lendemain, décongeler le mélange d'ARNm préparé précédemment sur la glace. Remplacer l'eau dans des réservoirs d'élevage avec de l'eau du système d'aquaculture fraîche et éliminer les obstacles. Immédiatement après les barrières sont tirés, réchauffer un moule d'injection à 28,5 ° C et mettre en place l'équipement pour la microinjection.
    Note: Pour plus d' informations sur les moules d'injection, s'il vous plaît se référer à Gerlach 36.
  4. Collecter les œufs tous les 10 - 15 min en utilisant une passoire à thé et rincer les œufs dans un 100 x 15 mm plat propre Petri avec E3 Bleu (5 mM de NaCl, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% bleu de méthylène). E3 bleu est utilisé pour empêcher la croissance fongique et d'assurer le bon développement des larves de poissons. Pour plus d' informations sur l' accouplement et la collecte d'embryons, voir Gerlach 36 et Porazinkski 37.
  5. Intégrer une cellule mise en scène d' embryons dans un moule d'injection chauffé et injecter de l'ARN dans le jaune d' oeuf dans la quantité souhaitée d'embryons (figure 1A). Compte pour la mort embryonnaire naturelle et d'embryons non fécondés en effectuant des injections embryonnaires sur 15% plus d'embryons que nécessaire pour l'expérience. Pour plus de détails sur microinjection d'embryons de poisson zèbre, s'il vous plaît se référer à Gerlach 36 et Porazinkski 37.
    NOTE: Pour la première utilisation de l'ARNm, effectuer une analyse dose-courbe pour déterminer la dose optimale pour la fluorescence et la viabilité (définie comme l'absence de défauts de développement bruts jusqu'à 5 dpf) avant d'effectuer l'imagerie 5D. 150-200 ng / ulinjecté dans des embryons est souvent la concentration optimale, il est donc un bon point de départ pour la concentration finale.
  6. extraire soigneusement les embryons injectés du moule à l'aide d'un 9 "pipette Pasteur en verre modifiée. Pour modifier la pipette, faire fondre l'extrémité à l'aide d'un brûleur Bunsen jusqu'à ce qu'elle forme une boule.
  7. Placez embryons injectés dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm à l'E3 Bleu et la maison dans un incubateur à 28,5 °.
  8. Six heures après l'injection, enlever les embryons morts ou non fécondés des plaques et ajouter propre E3 Bleu. Maison des embryons à 28,5 ° C.

3. Préparation et incorporation de Live Zebrafish Embryons Imaging (figure 1B)

  1. Deux heures avant l'imagerie, dépister les embryons injectés pour la GFP en utilisant un microscope à dissection fluorescent. Placer les embryons exprimant la GFP vert vif dans une nouvelle boîte de 100 mm x 15 Petri avec E3 Bleu.
  2. Faire bouillir une solution stock de 1% d'agarose à faible fusion en ajoutant 1 g de bas point de fusion d'agarose à 100 ml d'E3 Bleu. Après avoir utilisé l'agarose, couvrir le ballon avec une feuille d'aluminium. La solution mère reste utile pour jusqu'à un mois.
  3. Aliquote de 3 ml de la gélose fondue dans un tube de culture de 17 x 100 mm. Gardez au chaud agarose en plaçant le tube de culture dans un bain d'eau C 42 ° jusqu'à utilisation. Préparer une solution à 15 mM Tricaine dans de l' eau déminéralisée pour anesthésier les embryons de poisson zèbre 36.
    REMARQUE: si l' imagerie aux points de temps antérieurs est désiré, la concentration d'agar - agar peut être diminuée aussi faible que 0,3% 39.
  4. Amener le mM Tricaine 15, les embryons dépistés, agarose à faible fusion, E3 Bleu, et une lamelle de verre culture sur le fond plat de 35 mm pour un microscope optique de dissection. Retirez délicatement le chorion de l'embryon avec # 5 pinces. Pour ce faire, trois embryons.
  5. Placer les embryons dechorionated dans un récipient séparé pour être anesthésiés. Le couvercle de la cuvette du fond de lamelle couvre-objet est souvent utilisé à cette fin. En utilisant une pipette de transfert, ajouter trois gouttes (environ 150 pi)mM Tricaine 15 à l'antenne de 5 ml E3 bleu (si en utilisant le couvercle de la boîte de fond de lamelle) ou jusqu'à ce que les embryons ont été suffisamment anesthésiés. En outre, d'ajouter 3-4 gouttes (environ 150-200 pi) d'une solution 15 mM Tricaine au tube d'agarose fondu à 1%.
  6. En utilisant une pipette P200 avec 1 cm de la pointe de la pipette coupée; transférer les embryons anesthésiés à l'antenne de la lamelle à fond. Retirez tout excès E3 bleu: solution Tricaine.
  7. Ajouter lentement 5 - 10 pi d'agarose à faible fusion: solution Tricaine sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée pour assurer les embryons ne dérivent pas accidentellement près de l'autre.
    Attention: Si l'agarose est trop chaud, il va endommager l'embryon. Une bonne température pour maintenir la gélose à 42 ° C est.
  8. En utilisant une aiguille 21 G 1 ½, orienter doucement l'embryon dans l'agarose à la position désirée. Lors de l'utilisation d'un microscope inversé pour l'imagerie time-lapse, orienter la région d'intérêt (ROI) aussi proche de la lamelle comme possible.
    Remarque: Pour des fins générales, la région de queue offre une facilité d'orientation et de clarté en raison du tissu relativement mince (figure 1A). D' autres tissus, comme la couche épithéliale entourant le jaune d' oeuf et des plis d' ailettes, peuvent être utilisées 28,29. Ces tissus offrent une grande clarté, mais ces régions ne sont que quelques couches de cellules d'épaisseur. Aux fins de ce protocole, il est bénéfique pour l'image de la région de la queue pour acquérir autant de divisions cellulaires que possible.
  9. Attendez quelques minutes pour la solidification partielle de l'agar-agar. Utilisez l'aiguille pour briser un petit morceau de gélose pour tester sa solidification. Quand un morceau de gélose peut être arrachée de la goutte, passez à l'étape suivante.
  10. Couvrir l'ensemble lamelle avec de l'agar bas point de fusion formant un dôme sur les embryons embarqués. Laisser la gélose se solidifier avant de déplacer le plat pour l' imagerie confocale (figure 1A).
  11. Au cours du processus de solidification de la gélose (il faut environ 10 minutes), préparer 3 ml de of E3 solution bleue avec cinq gouttes (environ 250 pi) à 15 mM Tricaine être placé sur les embryons incorporés lors de l'imagerie.

4. 5D imagerie confocale de Live Zebrafish Embryons 40,41

NOTE: Voir Ariga 40 et O'Brien 41 pour plus de détails sur la façon d'effectuer l' imagerie 5D en utilisant d' autres systèmes confocaux. Pour Z-intervalle, Z-stack, Z-profondeur, intervalle de temps, et les définitions 5D voir la figure 1C.

  1. Ouvrez le logiciel d'imagerie et régler le microscope à 60x NA 1.4 objectif. Appliquer de l'huile d'immersion à l'objectif et placer la boîte de culture dans le porte-lame sur la platine du microscope. L'utilisation du contrôleur d'axe, l'embryon centre d'intérêt au-dessus de la lentille d'objectif et amener la lentille d'objectif vers le haut pour atteindre la boîte de culture.
  2. Cliquez sur l'icône de l'oculaire et de passer au filtre de la GFP sur le microscope. Focus sur le ROI. En se concentrant sur le tissu le plus proche de la lamelle sera offer les meilleurs résultats d'imagerie.
  3. Retirez le verrouillage. Sélectionnez les canaux GFP et mCherry (préétablies longueurs d'onde dans le logiciel) et définir la ligne option normale moyenne.
  4. Utilisez "Controls Voir / Acquisition / Zone de numérisation A1" commande pour ouvrir l'outil A1 Zone de numérisation.
  5. Commencez la numérisation. À l'aide de l'axe de commande, placer l'embryon de telle sorte que la zone de balayage est rempli avec autant de poisson-zèbre que possible. La puissance du laser n'a pas besoin d'être optimale à ce stade. Abaisser la puissance du laser pour éviter photoblanchiment inutile.
  6. Utilisez les «Contrôles Voir / Acquisition / acquisition ND" commande pour ouvrir le panneau de commande d'acquisition ND.
  7. Commencez le balayage pour définir les paramètres Z-stack. Réglez la limite supérieure Z-pile à l'endroit où les cellules ne sont pas au point et limite inférieure à l'endroit où les cellules ne sont plus visibles. Prévoir un espace de 3 pm au-dessus de l'échantillon pour la croissance et le mouvement des cellules, ce qui peut se développer dans le domaine de l'imagerie. Le Z-pile pour les chiffres présentés dans ce protocol couvrait une Z-profondeur de 40 um dans la queue de l'embryon.
  8. Définissez la taille de l'étape Z-intervalle à 2 pm. En moyenne, une cellule est de 10 um de diamètre; donc 2 um produira cinq intervalles de données d'imagerie à analyser pour chaque cellule.
    REMARQUE: La profondeur de l'image pouvant être acquise dépend de l'intervalle Z. résolution Z est sacrifié à gagner en profondeur globale dans la dimension Z pour l'image autant de cellules en mitose que possible (grande profondeur Z). L'inverse est vrai dans la mesure où, en diminuant la taille de l'étape, la résolution Z est acquise, alors que la profondeur Z est sacrifiée (petite profondeur Z).
  9. Réglez la puissance image laser, HV, et le décalage des niveaux. Pour les expériences ont démontré dans ce protocole, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux fixés aux niveaux correspondants, respectivement, pour le canal de la GFP; 2-5, 120-140, et de -9 à -11. Pour le canal mCherry, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux, respectivement; 3 - 6, 120-140 et -3-8. Une fois que les paramètres sont réglés, arrêtez le balayage pour éviter l'exposition au laser inutiles qui peuvent causer des phototoxicité et photoblanchiment de l'échantillon.
  10. Sélectionnez l'icône de la moyenne 2x ligne. "Aucune moyenne" produit une image granuleuse en "ligne de 4x en moyenne" augmente considérablement le temps de balayage. L'utilisation de 2x la ligne moyenne fournit la meilleure qualité d'image et le temps le plus rapide de balayage.
  11. Sélectionnez la durée appropriée de l'intervalle et le temps temps nécessaire pour l'expérience. Pour les divisions de type sauvage, des intervalles de temps de deux minutes pendant 2 heures est le meilleur pour la détermination de la durée mitotique (utilisé dans les figures 1, 2, 3A et 3B). Divisions qui activent le point de contrôle de l' ensemble de la broche pendant plus de 30 min sont plus appropriés pour des intervalles de cinq minutes pour quatre heures afin de préserver la fluorescence comme le montre la figure 3C.
  12. Cochez la case "enregistrer le fichier" et nommez le fichier pour enregistrer automatiquement le fichier tel qu'il est en cours d'acquisition. Double contrôle tous les paramètres sont réglées correctement et appuyez sur "démarrer run".
  13. Après l'acquisition est terminée, pour afficher le fichier dans un format en trois dimensions, cliquez sur l'icône du seuil de volume.

Résultats

La figure 2 montre la capacité d'observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant une large vue d'un AB de type sauvage queue de poisson zèbre champ. Plus de sept cellules en mitose sont imagés dans un laps de temps de 14 min (Movie 1). Dans les deux heures de temps bien sûr, plus de 40 événements mitotiques ont été capturés. En moyenne, 50 cellules en division ont été observées dans l'AB et 30 cellules qui se divisent en...

Discussion

L' utilisation de ce procédé permet de déduire une rupture de l' enveloppe nucléaire, la formation d'une plaque métaphase par des attaches microtubules kinétochore, et la ségrégation des chromatides sœurs pour former deux nouvelles cellules in vivo et d'une manière dépendante du temps. La capacité à observer mitose chez le poisson zèbre est avantageuse par rapport à des échantillons fixes et des systèmes de culture cellulaire, car les cellules sont imagées dans la physiologie n...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
pCS2 vectorsGift from K. KwanFor plasmid of interest
NotI-HF restriction enzymeNew England BioLabsR3189SFor restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kitLife TechnologiesAM1340For in vitro transcription
RNeasy Mini kitQiagen74104For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishesFisher ScientificFB0875712For housing embryos
microinjection moldhomemadeFor holding embryos during microinjection
Agarose IIAmresco0815-25GFor embedding embryos
TricaineSigma-AldrichE10521-10GFor anesthetizing embryos
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium ChlorideSigma-AldrichP3911For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride DihydrateSigma-AldrichC8106For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium SulfateFisher ScientificM7506For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue HydrateSigma-AldrichMB1For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tubeFisher Scientific50-819-812For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish MatTek CorpP35G-0-20-C No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezersDumont72701-DFor dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needleBecton Dickinson305167For positioning embryos in agar
Dissecting microscopeNikon AZ100For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscopeNikon A1+For time-lapse imaging
Confocal softwareNIS Elements AR 4.13.00For image acquisition and processing

Références

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