Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Riepilogo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Abstract

La mitosi è fondamentale per la crescita e la differenziazione organismal. Il processo è altamente dinamico e richiede ordinato eventi per realizzare una corretta condensazione della cromatina, l'attaccamento ai microtubuli cinetocoro, segregazione dei cromosomi, e citocinesi in un piccolo lasso di tempo. Errori nel delicato processo può portare a malattie umane, tra cui difetti di nascita e il cancro. Gli approcci tradizionali che indagano stati di malattia mitotico umani spesso si basano su sistemi di coltura cellulare, che non hanno la naturale fisiologia e contesto di sviluppo / tessuto-specifica vantaggiosa quando si studia la malattia umana. Questo protocollo supera molti ostacoli, fornendo un modo per visualizzare, ad alta risoluzione, la dinamica dei cromosomi in un sistema di vertebrati, il pesce zebra. Questo protocollo saranno i dettagli di un approccio che può essere usato per ottenere immagini dinamiche di cellule in divisione, che comprendono: la trascrizione in vitro, allevamento zebrafish / raccolta, embrione embedding, e time-lapse imaging. Ottimizzazione e modifications di questo protocollo sono anche esplorati. Utilizzando H2A.F / Z-EGFP (etichette cromatina) e mCherry-CAAX (etichette cella a membrana) embrioni mRNA-iniettato, mitosi in AB wild-type, auroraB ^hi1045, e ^hi2865 ESCO2 zebrafish mutante viene visualizzato. Ad alta risoluzione delle immagini dal vivo in zebrafish permette di osservare più mitosi per quantificare statisticamente difetti mitotici e tempi di progressione mitotico. Inoltre, si osservano osservazione di aspetti qualitativi che definiscono i processi impropri mitosi (ad esempio, difetti congressione, missegregation di cromosomi, ecc) e gli esiti cromosomiche improprio (ad esempio, aneuploidia, poliploidia, micronuclei, etc.). Questo test può essere applicato alla osservazione di tessuti differenziazione / sviluppo ed è suscettibile all'uso di zebrafish mutante e agenti farmacologici. Visualizzazione di come difetti di mitosi portare a disturbi del cancro e di sviluppo sarà notevolmentemigliorare la comprensione della patogenesi della malattia.

Introduzione

La mitosi è un essenziale processo cellulare fondamentale per la crescita, la differenziazione e la rigenerazione in un organismo vivente. Dopo accurata preparazione e la replicazione del DNA in interfase, la cella è innescato per dividere. La prima fase della mitosi, profase, viene avviata dall'attivazione della ciclina B / Cdk1. Prophase è caratterizzata dalla condensazione del materiale cromatina in cromosomi. Nucleare ripartizione busta avviene al passaggio tra profase e prometafase. In prometafase, centrosomi, il centro di nucleazione per la formazione del fuso, cominciano a migrare verso poli opposti, estendendo microtubuli in cerca di attaccamento cinetocore. Al momento di attacco, le conversioni al fine di applicare il sistema dei microtubuli e forze di tensione orientano i cromosomi che formano una piastra di metafase ^1. Se tutti i cromosomi sono collegati correttamente, il punto di controllo di assemblaggio del mandrino è soddisfatto, anelli cohesin tengono i cromatidi fratelli insieme sono spaccati, e microtubuli accorciare a tirare sorellacromatidi ai poli opposti durante anaphase ^2,3. La fase finale, telofase, comporta l'allungamento della cella e riforma della membrana nucleare attorno ai due nuovi nuclei. Citochinesi completa il processo di divisione separando citoplasma delle due nuove cellule figlie ^4-6. L'alterazione delle vie principali mitosi (cioè, posto di blocco di assemblaggio del mandrino, la duplicazione dei centrosomi, sorella cromatidi coesione, ecc.) Può provocare l'arresto metafase, missegregation dei cromosomi, e instabilità genomica ^7-10. In ultima analisi, difetti nei percorsi di controllo mitosi possono causare disturbi dello sviluppo e il cancro, che richiede la visualizzazione della mitosi e dei suoi difetti di un live, vertebrato, organismo pluricellulare ^10-16.

embrioni di zebrafish servire come un grande organismo modello per l'imaging dal vivo grazie al tessuto trasparente, la facilità di microiniezione e rapido sviluppo. Utilizzando zebrafish, l'obiettivo generale di questo manoscritto è quello didescrivere un metodo di 5D vivo (dimensioni X, Y, Z, tempo e lunghezza d'onda) di imaging di mitosi ¹⁷ (Figura 1C). L'uso di zebrafish mutante difettoso in diversi percorsi mitotici dimostrare la conseguenza di tali difetti. Per questo protocollo, Aurora B ESCO2 mutanti sono stati scelti per illustrare questi difetti. Aurora B è una chinasi che fa parte del complesso cromosoma passeggeri (CPC) coinvolte nella formazione del fuso e l'attaccamento microtubuli. E 'anche necessario per la formazione di scissione solco nel cytokinesis ^18,19. In zebrafish, la carenza di Aurora B porta a difetti di induzione solco, citocinesi, e la segregazione cromosoma ^20. ESCO2, d'altra parte, è un acetiltransferasi che è essenziale per sorella cromatidi coesione ^21,22. Si acetila cohesin sulla parte SMC3 dell'anello stabilizzando così cohesin per garantire una corretta segregazione cromosomica al passaggio metafase-anafase ^23. Perdita di ESCO2 in zebrafish porta a chmissegregation romosome, prematura sorella separazione cromatidi, instabilità genomica, e p53-dipendente apoptosi e indipendenti ^24,25. Grazie alla disponibilità, auroraB ^hi1045, e ^hi2865 ESCO2 zebrafish mutante (di seguito denominato aurB ^{m / m} ed ESCO2 ^{m / m,} rispettivamente) verrà utilizzato per illustrare questa tecnica ^25-27.

Accoppiamento microscopia confocale con macchinari cellule fluorescenti-tag ha permesso ai ricercatori di visualizzare cromatina e della membrana cellulare dinamiche durante la mitosi ^25,28,29. istoni fluorescenti-tag sono stati storicamente utilizzati per la visualizzazione della cromatina. Gli istoni sono proteine ​​nucleari composti da quattro diverse coppie (H2A, H2B, H3, H4 e) che sono responsabili della struttura nucleosomi che compone i cromosomi ^30. Mentre H2B è probabilmente il più usato per istone proteine ​​fluorescenti amouse e colture cellulari, l'uso di istone 2A, Famiglia Z (H2A.F / Z) ha dimostrato bene per l'uso in zebrafish ^31,32. Concanavalina A e caseina chinasi 1-gamma per esempio, localizzare alla membrana cellulare e sono stati precedentemente dimostrato efficace nel visualizzare membrana cellulare in ricci e drosophila ^33,34. Altri studi hanno dimostrato che la proteina fluorescente-tag CAAX etichette la membrana cellulare e ha avuto successo in zebrafish ^31. CAAX è un motivo che è riconosciuto da enzimi di modificazione post-traduzionali quali farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modifiche di questi enzimi causano proteine ​​di diventare associata alla membrana, etichettatura così la membrana cellulare ^35.

A causa del precedente uso di zebrafish, questo protocollo ha scelto di utilizzare H2A.F / Z e CAAX di etichettare cromatina e la membrana cellulare. L'applicazione di questo metodo permetterà al ricercatore di monitorare mitosi a livello di cella singola osservare singolo cromosomadinamiche, come monitorare e allo stesso tempo più divisioni cellulari che possono influire differenziazione dei tessuti e lo sviluppo. Questo articolo si concentrerà su l'imaging le dinamiche di segregazione dei cromosomi durante la mitosi a livello singola cella. All'interno di questo manoscritto, la capacità di osservare diverse divisioni mitotiche, calcolare il tempo di divisione, e decifrare i fenotipi mitotiche verrà illustrato e discusso. Utilizzando questi parametri, fisiologicamente dati rilevanti possono essere raccolti e applicati a diversi stati di malattia affetti da difetti mitotico.

Protocollo

1. in vitro Trascrizione

1. Linearizzare pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / o vettori pCS2-mCherry-CAAX per restrizione NotI enzima digerire ^31. L'utilizzo di un RNA nel kit di trascrizione in vitro, generare 5 'prodotti mRNA ricoperti da ogni modello, secondo il protocollo del produttore.
2. Purificare i mRNA innevate con un kit di purificazione. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire con RNasi-free H ₂ O.
3. Determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. (OD ₂₆₀ x diluizione x 40 mcg / ml).
4. Diluire l'RNA a 100 ng / mL per ogni H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX con RNase-free ₂ O. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, la fluorescenza sarà diminuita o assente. campioni Brighter diminuirà le preoccupazioni sulla fototossicità e photobleaching. D'altra parte, troppo RNA può essere tossico e / o causare effetti off bersaglio.
   Nota: Conservare il rimanentemRNA purificato in -80 ° C freezer.

2. Allevamento Zebrafish, Embrione Collection, e mRNA iniezione ^36-38

1. Assemblare vasche di allevamento con una barriera per separare il serbatoio in due regioni e riempire ciascun serbatoio di allevamento con l'acqua sistema di acquacoltura utilizzato nella struttura zebrafish.
2. Per evitare l'allevamento prematura, posizionare due pesci maschio su un lato della barriera e due pesci femmina dall'altro lato la notte prima di allevamento.
3. Il giorno successivo, scongelare la miscela mRNA precedentemente preparato sul ghiaccio. Sostituire l'acqua in vasche di allevamento con acqua sistema di acquacoltura fresca e rimuovere le barriere. Subito dopo le barriere sono tirati, riscaldare uno stampo ad iniezione di 28,5 ° C e impostare l'apparecchiatura per la microiniezione.
   Nota: Per informazioni su stampi ad iniezione, si rimanda al Gerlach ^36.
4. Raccogliere uova ogni 10 - 15 minuti utilizzando un colino da tè e sciacquare le uova in un ambiente pulito 100 x 15 mm piastra di Petri con E3 Blu (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl _2, 0,33 mm MgSO _4, 10 ^-5% blu di metilene). E3 blu è usato per prevenire la crescita di funghi e garantire il corretto sviluppo delle larve. Per maggiori informazioni su l'accoppiamento e la raccolta degli embrioni, fare riferimento a Gerlach ³⁶ e ³⁷ Porazinkski.
5. Incorporare una cella scena embrioni in uno stampo ad iniezione riscaldato ed iniettare l'RNA nel tuorlo nella quantità desiderata di embrioni (Figura 1A). Conto per naturale morte embrionale ed embrioni non fecondate eseguendo iniezioni embrionali, il 15% in più rispetto embrioni necessario per l'esperimento. Per ulteriori dettagli su microiniezione di embrioni di zebrafish, si prega di fare riferimento a Gerlach ³⁶ e ³⁷ Porazinkski.
   NOTA: Per il primo utilizzo di mRNA, eseguire un'analisi dose di curva per determinare la dose ottimale per la fluorescenza e la vitalità (definita come assenza di difetti di sviluppo lordi fino a 5 dpf) prima di eseguire l'imaging 5D. 150 - 200 ng / mliniettate in embrioni è spesso la concentrazione ottimale, quindi è un buon punto di partenza per la concentrazione finale.
6. estrarre delicatamente gli embrioni iniettati dallo stampo utilizzando una versione modificata del "vetro pipetta Pasteur 9. Per modificare la pipetta, sciogliere il finale utilizzando un becco Bunsen fino a formare una palla.
7. Mettere embrioni iniettati in un 100 x 15 mm piastra di Petri in E3 blu e la casa in un incubatore a 28.5 °.
8. Sei ore dopo l'iniezione, rimuovere eventuali embrione è morto o non fecondate dai piatti e aggiungere pulita E3 blu. Casa gli embrioni a 28,5 ° C.

3. Preparazione e Embedding a Live embrioni di zebrafish per Imaging (Figura 1B)

1. Due ore prima di imaging, lo screening degli embrioni iniettati per GFP utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza. Luogo luminoso embrioni che esprimono GFP-verdi in una nuova mm piatto 100 x 15 Petri con E3 blu.
2. Far bollire una soluzione stock di 1% a basso agarosio fusione con l'aggiunta di 1 g di basso punto di fusione agarosio a 100 ml di E3 Blu. Dopo aver utilizzato il agarosio, coprire il pallone con un foglio di alluminio. La soluzione madre può essere utile per un massimo di un mese.
3. Aliquotare 3 ml di agar fuso in una provetta 17 x 100 mm. Mantenere la calda agarosio collocando la provetta in un bagno d'acqua a 42 ° C fino al momento dell'uso. Preparare una soluzione di 15 mm Tricaine in acqua deionizzata per anestetizzare gli embrioni di zebrafish ^36.
   NOTA: Se l'imaging in punti temporali precedenti è desiderato, la concentrazione di agar può essere diminuita a partire da 0,3% ^39.
4. Portare il 15 MM Tricaine, gli embrioni a screening, bassa agarosio fusione, E3 Blu, e da 35 mm di vetro coprioggetto cultura fondo piatto per un microscopio ottico dissezione. Rimuovere con attenzione corion dell'embrione con # 5 pinzette. Fare questo per tre embrioni.
5. Mettere gli embrioni dechorionated in un contenitore separato per essere anestetizzati. Il coperchio del piatto coprioggetto fondo viene spesso utilizzato per questo scopo. Usando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce (circa 150 ml)15 mM Tricaine al piatto 5 ml E3 blu (se utilizzando il coperchio del piatto inferiore coprioggetto) o fino embrioni sono stati sufficientemente anestetizzato. Inoltre, aggiungere 3-4 gocce (circa 150 - 200 microlitri) di 15 mM soluzione Tricaine al tubo agarosio fuso 1%.
6. Usando una pipetta P200 con 1 cm dalla punta della pipetta tagliare; trasferire gli embrioni anestetizzati al piatto coprioggetto fondo. Rimuovere qualsiasi eccesso E3 Blu: soluzione Tricaine.
7. Aggiungere lentamente 5 - 10 ml di agarosio a bassa fusione: soluzione Tricaine negli embrioni, mantenendo ogni goccia separato per garantire gli embrioni non accidentalmente deriva vicini l'uno all'altro.
   Attenzione: se l'agarosio è troppo caldo, si danneggia l'embrione. Una buona temperatura per mantenere l'agar a è 42 ° C.
8. Utilizzando un 21 ago G 1 ½, orientare delicatamente l'embrione nel agarosio nella posizione desiderata. Quando si utilizza un microscopio invertito per l'imaging time-lapse, orientare la regione di interesse (ROI) più vicino possibile al vetrino come possibLe.
   Nota: Per scopi generali, la regione coda offre la facilità di orientamento e chiarezza a causa della relativamente sottile di tessuto (Figura 1A). Altri tessuti, come lo strato epiteliale che circonda le pieghe tuorlo e pinne, possono essere usati ^28,29. Questi tessuti offrono grande chiarezza, tuttavia queste regioni sono spessi solo pochi strati di cellule. Ai fini di questo protocollo, è vantaggioso per un'immagine regione coda di acquisire quante divisioni cellulari possibili.
9. Attendere qualche minuto per la solidificazione parziale del agar. Utilizzare l'ago di spezzare un piccolo pezzo di agar per testare la sua solidificazione. Quando un pezzo di agar può essere tirato dalla goccia, procedere al passo successivo.
10. Coprire l'intero vetrino con una bassa agar fusione formando una cupola sopra gli embrioni incorporati. Lasciare che l'agar solidificare prima di spostare il piatto per l'imaging confocale (Figura 1A).
11. Durante il processo di solidificazione agar (dura circa 10 minuti), preparare da 3 ml osoluzione f E3 blu con cinque gocce di (circa 250 ml) 15 mm Tricaine per essere posizionato sopra gli embrioni incorporati durante l'imaging.

4. 5D confocale Imaging Live embrioni di zebrafish ^40,41

NOTA: Vedere Ariga ⁴⁰ e O'Brien ⁴¹ per i dettagli su come eseguire l'imaging 5D utilizzando altri sistemi confocale. Per Z-intervallo, Z-stack, Z-profondità, intervallo di tempo, e definizioni 5D si veda la Figura 1C.

1. Aprire il software di imaging e impostare il microscopio a 60X NA 1.4 lente dell'obiettivo. Applicare l'olio di immersione alla lente dell'obiettivo e posizionare il piatto cultura nel supporto diapositive sul palco microscopio. Utilizzando il controllore assi, centrare l'embrione di interesse al di sopra della lente dell'obiettivo e portare la lente obiettivo verso l'alto per incontrare il piatto cultura.
2. Fare clic sull'icona oculare e passare al filtro GFP sul microscopio. Focus sul ROI. Concentrandosi sul tessuto più vicino al vetrino sarà offer i migliori risultati di imaging.
3. Rimuovere il blocco. Selezionare i canali GFP e mCherry (lunghezze d'onda pre-impostati nel software) e impostare la linea opzione normale media.
4. Utilizzare "Controlli View / acquisizione / A1 Area di scansione" comando per aprire lo strumento A1 Area di scansione.
5. Avviare la scansione. Utilizzando l'asse-controllore, posizionare l'embrione in modo che l'area di scansione viene riempito con la maggior quantità di zebrafish possibile. La potenza del laser non deve essere ottimale a questo punto. Abbassare la potenza del laser al fine di evitare inutili photobleaching.
6. Utilizzare i "Controlli View / acquisizione / acquisizione ND" comando per aprire il pannello di controllo acquisizione ND.
7. Avviare la scansione per impostare i parametri di Z-stack. Impostare il limite superiore Z-stack per cui le cellule non sono a fuoco e limite inferiore per cui le cellule non sono più visibili. Lasciare uno spazio 3 micron sopra il campione per la crescita e il movimento delle cellule, che può espandersi nel campo di ripresa. La Z-stack per i dati riportati in questo proprotocollo copriva una Z-profondità di 40 micron di coda dell'embrione.
8. Impostare la dimensione del passo Z-intervallo di 2 micron. In media, una cella è 10 micron di diametro; quindi 2 micron produrrà cinque intervalli di dati di imaging da analizzare per ogni cella.
   NOTA: La profondità dell'immagine che può essere acquisito dipende dall'intervallo Z. risoluzione Z è sacrificato per ottenere profondità totale nella dimensione Z al fine di immagine come molte cellule in fase di mitosi possibile (grande Z-profondità). L'inverso è vero, nel senso che, diminuendo la dimensione del passo, la risoluzione Z si guadagna, mentre la profondità Z viene sacrificato (piccolo Z-profondità).
9. Regolare la potenza del laser immagine, HV, e offset livelli. Per gli esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli fissati ai livelli corrispondenti, rispettivamente, per il canale GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Per il canale mCherry, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli, rispettivamente; 3 - 6, 120 - 140, e -3 a-8. Una volta impostati i parametri, spegnere la scansione per evitare l'esposizione al laser inutili che possono causare fototossicità e photobleaching del campione.
10. Selezionare l'icona media linea di 2x. "No media" produce un'immagine sgranata mentre "linea 4x media" aumenta drasticamente il tempo di scansione. L'uso della linea di 2x media fornisce la migliore qualità di immagine e il tempo più veloce di scansione.
11. Selezionare l'intervallo di tempo e durata, necessarie per l'esperimento. Per le divisioni wild-type, intervalli di tempo di due minuti per 2 ore è meglio per la determinazione della durata mitotico (utilizzato nelle figure 1, 2, 3A e 3B). Divisioni che attivano il checkpoint del fuso per più di 30 minuti sono più adatti per cinque intervalli minuti per quattro ore al fine di preservare la fluorescenza come mostrato nella Figura 3C.
12. Selezionare la casella "Salva su file" e il nome del file per salvare automaticamente il file come si è in fase di acquisizione. Doppio controllo tutte le parametri siano impostate correttamente e ha colpito "start run".
13. Dopo l'acquisizione è stata completata, per visualizzare il file in un formato tridimensionale, cliccare sull'icona soglia di volume.

Risultati

La figura 2 mostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari che utilizzano un ampio panorama di un campo di tipo selvaggio coda zebrafish AB. Oltre sette cellule mitotiche vengono esposte in un arco di tempo 14 min (Film 1). Entro il corso di due ore, più di 40 eventi mitotico sono stati catturati. In media, 50 cellule in divisione sono stati osservati nel 30 AB e divisione delle cellule in AUR B ^{m / m} embrioni

Discussione

L'uso di questo metodo permette di dedurre ripartizione nucleare envelope, formazione di una piastra di metafase da allegati microtubuli cinetocoro, e la segregazione dei cromatidi fratelli per formare due nuove cellule in vivo e in un modo dipendente dal tempo. La capacità di osservare mitosi in zebrafish è vantaggioso su campioni fissati e sistemi di coltura cellulare perché le cellule vengono ripreso nella fisiologia naturale, il tessuto è trasparente che permette proteine ​​fluorescenti da utili...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCS2 vectors	Gift from K. Kwan		For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3189S	For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	For in vitro transcription
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	For housing embryos
microinjection mold	homemade		For holding embryos during microinjection
Agarose II	Amresco	0815-25G	For embedding embryos
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	For anesthetizing embryos
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C8106	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M7506	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube	Fisher Scientific	50-819-812	For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish	MatTek Corp	P35G-0-20-C	No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers	Dumont	72701-D	For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle	Becton Dickinson	305167	For positioning embryos in agar
Dissecting microscope	Nikon AZ100		For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope	Nikon A1+		For time-lapse imaging
Confocal software	NIS Elements AR 4.13.00		For image acquisition and processing