JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Vasodilation הנוצרות על-ידי אינסולין מווסת את השריר זלוף ומגביר את microvascular על פני השטח אזור (גיוס microvascular) זמין לחילופי ממס בין interstitium דם ורקמות. מיקרוסקופ intravital משולב, בדיקת אולטרה סאונד משופרת לעומת זאת מוצג להעריך בו זמנית של אינסולין פעולה בכל כלי גדול יותר, את microcirculation ויוו.

Abstract

זה הוכח, כי פעולות כלי הדם של אינסולין לתרום רגולציה של הרגישות לאינסולין. ההשפעות של אינסולין על השריר זלוף לווסת postprandial אספקת חומרים מזינים והורמונים רקמות הרגישים אינסולין. נתאר כאן טכניקה לשילוב מיקרוסקופ intravital (IVM) ואת משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד (CEUS) של התא המתוויך הגדול של hindlimb העכבר בו-זמנית להמחיש שריר התנגדות העורקים זלוף של מנתחי מיקרו ויוו. במקביל הערכת ההשפעה של אינסולין ברמות מרובות של העץ כלי הדם חשוב ללמוד את קשרי הגומלין בין אפקטים vasoactive מרובים של אינסולין זלוף שריר. הניסויים במחקר זה בוצעו בעכברים. קודם כל, הצינורית וריד הזנב נוסף עבור העירוי של הרדמה, תרכובות vasoactive, אולטרסאונד הסוכן ניגוד (encapsulated השומנים microbubbles). שנית, חתך קטן עשוי באזור המפשעה לחשוף את עץ עורקי של תא השריר המתוויך. החללית אולטרסאונד ממוקם אז-contralateral hindlimb העליונה כדי להציג את השרירים חתך הרוחב. להערכת פרמטרים בסיסית, שקובעת את קוטר העורקים, microbubbles מעורבבים לאחר מכן בקצב קבוע כדי להעריך את זרימת הדם שריר ונפח הדם microvascular (MBV). בעת החלת לפני ובמהלך מלחציים hyperinsulinemic-euglycemic, המשולב IVM CEUS לאפשר הערכה של אינסולין-induced שינוי קוטר העורקים, שריר microvascular זלוף, הרגישות לאינסולין לכל הגוף. יתר על כן, הקשר טמפורלית בין התגובות של microcirculation העורקים עמידות לאינסולין ניתן לכמת. אפשרי גם מעקב עכברים longitudinally בתוך הזמן, שהופך אותו כלי חשוב ללמוד שינויים ברגישות לאינסולין וסקולרית, לכל הגוף.

Introduction

בתגובה לעלייה ברמת הגלוקוז בדם, הלבלב מפריש אינסולין לזרם הדם ומשם במהירות למחזור לרקמות היעד שלה כגון שרירי השלד, באמצעות התנגדות העורקים, הנימים. שרירי השלד אחראית ~ 80% של ספיגת הגלוקוז postprandial1. המסירה של אינסולין כדי interstitium שרירי השלד הוכח להיות שיעור הגבלת שלב עבור הפעולות מטבולית של אינסולין המקדמים גלוקוז סילוק2,3,4. בתוך 10-15 דקות, אינסולין מגדילה את האחסון נימי דם (microvascular גיוס), אפקט המתרחשת לפני מגביר זרימת דם הכולל5,6. גיוס microvascular מרחיבה אנדותל שטח זמין עבור חילופי חומרים מזינים (ו אינסולין)7,8. גיוס microvascular בתיווך אינסולין מקדים והיא קשורה באופן עצמאי עם שינויים שרירי השלד גלוקוז ספיגת8,9. ההשפעה של אינסולין על להערכת כינה 'הרגישות לאינסולין כלי הדם'.

הוכח, כי גיוס microvascular בתיווך אינסולין, אינסולין-induced vasodilation לקוי שמנים צוקר חולדות10,11. יתר על כן, עכברים רזה עם צפיפות מופחתת נימי להציג שריר אינסולין ההתנגדות12. בעבודתם השפעה, ל"באנ. et al. הראה כי לקוי אינסולין איתות בתאי האנדותל נגרם צמצום בגיוס הנוצרות על-ידי אינסולין microvascular, אשר נוכה ספיגת הגלוקוז בשריר השלד כ 40%13. ליקויים אלו בתפקוד microvascular לא להתרחש רק בשריר, אלא גם ב מרובים רקמות ואיברים אחרים כגון הלב, כליות ואת הרשתית14,15,16. אלה דוגמאות אחרות מחקרים17,18,19,20 להציע כי ההשפעות כלי הדם של אינסולין הם מנגנון חשוב בפיזיולוגיה (פתו) של תנגודת לאינסולין שלה סיבוכים.

אמנם יש עדויות משמעותיות אינסולין מגדילה את נפח הדם microvascular (MBV) שרירי השלד5,6, המנגנון שבו זה יקרה אינם לגמרי מובן9. תלויי-אנדותל vasodilation חיוני בהיבטים רבים של כלי הדם אינסולין רגישות21,22,23 ברמות שונות של להערכת. הרגישות לאינסולין כלי הדם יכול להתבטא על ידי אינסולין-induced הרפיה של התנגדות העורקים על ידי הרפיה של רבים נימי מראש כדי להגדיל את perfused microvascular exchange שטח7,24, 25.

מיקרוסקופ intravital (IVM) שימש במגוון רקמות ההכנות כולל צ'יימברס skinfold של העכבר dorsum26, מצע המעי של עכבר, חולדה27, מודלים של איסכמיה איבר של העכבר28 ו כיס לחי של אוגר 29. בדיקת אולטרה סאונד משופרת לעומת זאת (CEUS) היא טכניקת הדמיה אחרת המאפשר להערכת microcirculation הלב30 , כמו גם שרירי השלד31. הוא מנצל microbubbles גז אינרטי מלא אשר מתנהגים rheologically כמו תאי דם אדומים ולהישאר לחלוטין בתוך כלי הדם לומן. Microbubbles אלה מעורבבים לווריד בקצב קבוע להשגת מצב יציב. גל אולטרסאונד אנרגיה גבוהה, לאחר מכן, יכול לשמש כדי להרוס את microbubbles. מהירות חידוש המלאי של microbubbles באזור של הריבית (ROI) מייצגת מהירות הזרימה (MFV). עוצמת אות סה של חדות התמונה מייצגת את MBV. CEUS יכול להתבצע שוב ושוב (גם אצל בני אדם), כולל מתקדמת את ההבנה של תפקוד כלי הדם המתרחשת במדינות אינסולין עמידים (שעלון בארט. et al. 32).

במחקר הנוכחי אנו מתארים שיטה חדשה ללימוד ויסות זלוף שריר, באמצעות שימוש בו-זמני של IVM והן CEUS. כאן אנו מתמקדים פעולות כלי הדם של אינסולין בתא המתוויך הגדול של hindlimb העכבר. אחת מקבוצות הגדולות שרירי השלד העכבר, הפעלת מחקרים של ספיגת הגלוקוז המקומי ב שריר נציג את התא. תא זה הוא אידיאלי עבור IVM כפי ההכנה הדמיה של העורקים נגישים בקלות באמצעות הליך כירורגי מתוקננת28. יתר על כן, קבוצה משלנו ואחרים הראו כי ניתן להשתמש CEUS זה33,תא34.

יש יתרון הטכניקה IVM ו CEUS המשולב הוא האפשרות להעריך את ההשפעה של אינסולין ברמה של רבים גדולים יותר (הזנה או התנגדות העורקים), את microcirculation (מיטות נימי) באותה קבוצת שרירים. בנוסף, היישום בו זמנית של שתי השיטות מספק תובנה הפעולה הזמנית של אינסולין ברמות של התנגדות העורקים, מנתחי מיקרו. זה בשילוב IVM, ניתן ליישם טכניקה CEUS גם בתחומים אחרים לביולוגיה. לדוגמה, התפקיד של חלבונים שונים בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological המשפיעים על אנדותל שניתן ללמוד באמצעות מודלים נוקאאוט. יתר על כן, ניתן להשתמש בשתי הטכניקות עכבר אחד בנקודות זמן מרובים לצמצם את זמן ועלות של מחקר.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מקומיים ועל ועדה אתית. פרוטוקול כולו מן אינדוקציה של הרדמה העכבר עד תום המלחציים hyperinsulinemic-euglycemic לוקח כ 2 h.

1. הכנה השתלה

  1. לגרום הרדמה יחד עם שיכוך כאבים ב עכבר זכר במשקל של 20-25 גרם לאחר ה 14 או לילה צום עם זריקה בקרום הבטן של פנטניל (0.31 מ"ג/ק"ג), Midazolam (6.25 מ"ג/ק"ג), איזופרומאזין (6.25 מ"ג/ק"ג) (FMA הרדמה) ומניחים אותו על כרית החימום homeothermic רקטלי-מבוקרי טמפרטורה השומרת על טמפרטורת הגוף 37 מעלות צלזיוס.
  2. לחטא את הטבלה מבצע ציוד מספר פעמים באמצעות פתרון מבוסס-אלכוהול.
  3. לצרף מחט 27 G צינור פוליאתילן ארוך 10 ס מ (PE-20) ולצרף את הצינור מחבר 4-way. את המחט את תקחי את הזנב, שמלמדות אותו באמצעות רקמות דבק ג'ל. בצינורית הזה ישמש עבור אינפוזיה של הרדמה גלוקוז, אינסולין, microbubbles.
    הערה: הוספת הפרין (5 U/mL) בתוך תמיסת מלח סטרילית במהלך תעלות התהליך לשטוף את הווריד זנב (µL כ 10) מקטין את האפשרות של קנולות סתומות.
  4. ברחבי ניתוחים בפרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי תקינות תוך ורידי של FMA הרדמה דרך הצינורית וריד הזנב בקצב של 33.75 µL/kg/min.
  5. את המקום את העכבר עם הצד הבטני ולתקן את כפות הרגליים באמצעות קלטת thermostable לחשוף את האזור הירך. להשתמש exorotation קלה של מפרק הירך (paws hindlimb פונה כלפי מעלה), זווית 40-60 מעלות בברך משותפת כדי לתקנן את המתיחה של השריר-תא המתוויך הירך.
  6. להסיר את שיער המפשעה, הירך אזורים מבקיעים בעזרת קרם depilatory. לאסוף את כל השיער רפוי באמצעות מקלון צמר גפן לח.
  7. הנח את העכבר תחת stereomicroscope, בצע את השלבים הבאים כירורגי באמצעות 10 X 16 X הגדלה.
  8. עושים חתך 2 ס מ בעזרת מספריים לעור פועל במקביל רצועה המפשעתית, לרוחב רק העקמומיות בטן (איור 1). החל המתיחה בצד דיסטלי של החתך יש באמצעות מלחציים בולדוג (איור 1D). זה יעזור כדי להתאים את החלון לפי הצורך לעזור להחזיק את שמן פראפין (המתוארים ב- 1.12).
  9. לנתח את רקמת שומן קיר הבטן. כדי למנוע דימום, הפרד בעדינות כרית השומן מהקיר במקום לנתח ישירות דרך משטח. המתיחה בעדינות על משטח שמן לכיוון דיסטלי יקל על התהליך (איור 1C).
  10. לזהות את עורק הירך, ולכו עד הענפים העיקריים הראשון (העורק הצפק, העורק העדין) (איור 2). העורק העדין הוא הענף העיקרי הראשון של עורק הירך מפעיל את השריר המתוויך הגדול ולאחר מכן מפעיל עמוק השריר העדין. העורק העדין ישמש עבור IVM.
  11. לזהות את החיבור העמוקה שקוף המכסה את השרירים ואת כלי. בעזרת מלקחיים חדה, משוך fascia כלפי מעלה, לחתוך אותו באמצעות של microscissor.
  12. לכסות את השריר חשוף עם טיפה (200 µL) של צמחי מרפא שמן פראפין (טמפרטורת החדר, או מראש התחמם עד 37 ° C) כדי למנוע את הרקמה מוכן ממנו להתייבש. ודא כי הירידה שמן לא ידלוף משם. התאם את קפלי העור של החתך שימוש את המלחציים בולדוג ליצירת חור קטן כדי להחזיק את שמן פרפין מתרחץ בכלי הדם.
  13. הנח את העכבר תחת מיקרוסקופ מכוילת בעבר (16 X הגדלה אופטית) כך כי העורק העדין הוא אנכי על מסך המחשב. לצרף את המיקרוסקופ המצלמה והמחשב מבוסס מערכת ניתוח יכול לחלץ הקוטר כלי הקיבול של ערכת נתוני תמונה. הקוטר הוא המרחק בין שני הצדדים luminal של כלי השיט. ניטור רציף ומדידה של הקוטר עורק רצוי.
  14. למקם את מקור האור במרחק מספיק (מינימום 20 ס מ) hindlimb כדי להקטין ראש הולכה מן האור.
  15. חלות ג'ל התמרה חושית אולטרסאונד prewarmed hindlimb contralateral העליון. מקם את החללית אולטרסאונד בניצב לציר הארוך של עצם הירך.
  16. בזהירות להתאים את הזווית ואת הכיוון של החללית אולטרסאונד כדי לקבל תצוגה חתך הרוחב של קבוצת השריר המתוויך. לטפל כדי לשמור על המיקום של החללית אולטרסאונד ביחס העכבר יציבה לשמור על אותו מישור הדמיה למדידות בסיסית ו- hyperinsulinemic.
  17. תן את העכבר לייצב למשך 30 דקות. הקוטר של העורק העדין צריך להיות יציבים במשך 10 דקות לפני המתעדים את הקוטר בסיסית.

2. הבסיס לבין מידות Hyperinsulinemic

  1. ודא הקוטר עורק העדין בסיסית נשמר על ידי תוכנית מחשב המשמש את IVM.
  2. להכין את microbubbles מראש כפי שתואר35 ו- count עם קולטר מונה ריכוז של 2.5 x 109 בועות/mL לפני הניסוי.
  3. כפי שניתן להציג את microbubbles רק במצב של הניגוד של מכונת אולטראסאונד, לשלוט על פרמטרים אשר משפיעים על התמונה חדות בנתונים שנאספו (שמתואר 2.3.1) לבין שימוש עקבי במהלך הרכישה.
    1. השתמש בהגדרות הבאות על מכונת אולטראסאונד: ניגודיות רווח ב 35 דציבלים; הזמן לקבל פיצוי כבוי; קו צפיפות גבוהה; מספר מוקד אזורי כדי רחב; לשדר כוח ל- 4%; לשדר רוחב הקרן תקן; SV לשער 4; רגישות 1; התמדה לחסל. רמה את המיקום של מוקד אזורי במרכז של האזור בעל עניין.
  4. לחסוך זמן קצר (5 s) קליפ. זה ישמש כדי לחשב את האות רקע.
  5. מנערים את הצנצנת המכילה את microbubbles ביד כדי לקבל השעיה אחיד. להתחיל למלא את microbubbles באמצעות את הצינורית וריד הזנב בקצב µL/דקה 5. מניחים את צינור העירוי על מערבולת הרטוט (200 x כל דקות) כדי לשמור על השעיה אחידה של microbubbles.
  6. אפשר 5 דקות של תקינות של microbubbles כך מגיעים לרמה מצב יציב. להמשיך עם קבלת את עקומות זמן בעצימות הבועות באמצעות הפונקציה השמדה microbubble המוביל (מבד) על מכונת אולטרסאונד ב 5 דקות ו ב 10 דקות לאחר תחילת microbubbles אינפוזיה (איור 3 א). קח את האות הממוצע של אלה שתי מדידות כדי לקבל את הנתונים זלוף בסיסית.
  7. לאחר קבלת הנתונים הבסיסית, להתחיל את המלחציים hyperinsulinemic-euglycemic כמו שמתואר34. השתמש את הצינורית הזנב (להציב 1.3) כדי להזריק את האינסולין, הגלוקוז (ואת הרדמה).
    1. בקיצור, הפקת מצב hyperinsulinemic על ידי החדרת מנת אינסולין מו/kg 200 ואחריו אינסולין רציפה אינפוזיה (7.5 מו/kg/min) עבור 60 דקות שימוש של אינפוזיה משתנה של 20% D-גלוקוז כדי לשמור על euglycemia.
    2. להעריך את רמת הסוכר בדם מן הווריד הזנב של כל 5 דקות עם מכשיר ניטור גלוקוז, ולתחזק בבית 5 מ מ על-ידי התאמת קצב העירוי משתנה גלוקוז. לקבוע הרגישות לאינסולין על ידי חישוב ממוצע שיעור עירוי גלוקוז רשע במהלך האחרון 30 דקות.
  8. ודא כי הקוטר של העורק העדין מתועדת בפרקי הזמן הרצוי (לדוגמה-10, 30, 60 דקות) של תחילת של המלחציים hyperinsulinemic-euglycemic עם התוכנית במחשב.
  9. אחרי 25 דקות ו/או 55 דקות של המלחציים אינסולין, להתחיל את המדידה (hyperinsulinemic) CEUS השני כדי לתעד את MBV ב 30 או 60 דקות, בהתאמה. בצע את הפעולות המתוארות 2.4 ו- 2.5. ניתוק ולהשתמש הנמל הרדמה של המחבר 4-way כדי להשרות את microbubbles. לחבר את צינור ההרדמה בתום החדרת microbubbles.
  10. לאחר השלמת IVM ומידות CEUS 60 דקות לאחר התחלת אינסולין אינפוזיה, תיסוג דם מן העכבר לפי נוהל דקירה בלב לניתוח בשלב מאוחר יותר. זה גם המתת חסד העכבר. בזהירות לנתח את העדין ואת שמנקזים ולאחסן אותם לניסויים נוספים הרצוי (עבור למשל, שהכלים המערבי, אימונוהיסטוכימיה, שמחוץ לחץ myography ניסויים36,37, 38).

3. ניתוח מנותק

הערה: הניתוחים של מדידות IVM, CEUS צריכה להתבצע במצב לא מקוון על-ידי חוקר עיוור. CEUS מציעה את האפשרות להבחין את microcirculation מכלי גדול יותר על ידי באופן זמני להם להשמדה של microbubbles על ידי גלי אולטרסאונד בעוצמה גבוהה באמצעות הפונקציה מבד. האות (נמדד ביחידות שרירותי (a.u)) בכלי גדול משוחזר מהר יותר מאשר אלו microcirculation בשל המהירות microbubbles של כלי המתאים.

  1. השתמש של תחנת עבודה במצב לא מקוון או בתוכנה על מכונת אולטרסאונד לביצוע הבדיקות.
  2. צייר אזור אינטרסים (ROI) כדי לכלול את microcirculation. צייר של רועי נפרד כדי לכלול כלי גדול הירך (איור 3 א).
  3. לשכפל ROIs של מנתחי מיקרו של כלי שיט גדולים יותר עבור המדידות רקע, בסיסית, hyperinsulinemic באמצעות הפונקציה copy רועי מובנה בתוכנה.
  4. להחסיר את האות בעוצמה של המדידה הרקע מקו הבסיס, את המידות hyperinsulinemic.
  5. לחלק את עוצמת אות של microcirculation ע י האות בעוצמה של כלי הירך. ניתן כעת להשוות MBVs בסיסית ו- hyperinsulinemic.

תוצאות

גלוקוז קצב העירוי במהלך המלחציים hyperinsulinemic-euglycemic (רגישות לאינסולין) היה 180.21 ± 19.81 µmol/ק ג/מינימלית יישום מקומי של שמן פרפין על תא השריר המתוויך לייצב את הספינה לא שינתה את קוטר בסיס ממוצע של העורקים (73.6 ± 29.0 מיקרומטר לעומת מיקרומטר ± 17.9 68.8; p = 0.58) אבל עזר להפחית את הווריאציה החיות נבדק (איור 4A). אינסולין בעקביות גדל הקוטר עורק העדין (± 14.58 6.2%-60 דקות; N = 9) אשר היה שונה באופן משמעותי (p < 0.0001) משינוי קוטר הנגרמת על ידי אינפוזיה מלוחים (-6.3 ± 4.9%; N = 6). אינסולין-induced vasodilation היה ניכר אחרי 10 דקות (5.1 ± 10.09%; p = 0.002) והגיעו כ- 95% מהקיבולת המרבית שלה dilatory לאחר 30 דקות.

שימוש CEUS, אינסולין באופן עקבי עלה שריר MBV (איור 5A) ב- 33.5% (± 31.04%, N = 7; p = 0.0009) בהשוואה אינפוזיה מלוחים (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (איור 5B). הנתונים המוצגים הם עוצמות האות של שריר MBV לחלק זה של כלי הירך. זה מפחית וריאציה ניסיוני בין מדידות שונות ובין עכברים שונים (מידע לא מוצג). עוצמת האות של כלי הירך באופן ליניארי תואמת ריכוז microbubbles במחזור (איור 3C). תיקון לסימן של כלי הירך תיאורטית מתקן הבדלים בריכוזים של microbubbles בשימוש (דמות תלת-ממד). הנתונים מוצגים במקטע זה אומר ± סטיית התקן.

figure-results-1445
איור 1: תערוכות כירורגי של תא המתוויך הגדול של Hindlimb. (א) חתך על המפשעה, במקביל הכיוון של רצועה במפשעה. המתיחה עדין (B)-משטח שמן בכיוונים הדיסטלי (חיצים שחורים) יציג את רקמת החיבור (*) בין משטח שמן לקיר הבטן. (ג) העור קיפולים של החתך יכול להיות מותאם בעזרת המלחציים בולדוג ליצירת חור קטן כדי להחזיק את שמן פרפין מתרחץ כלי. בדיקה (D) סאונד ממוקם על hindlimb העליון contralateral לאחר העורק העדין מוכן מוצג באמצעות מיקרוסקופ מכוילת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2263
איור 2: Intravital מיקרוסקופיה של Hindlimb העכבר. עורק הירך (A) הולידה את העורק הצפק (B), עורק העדין (C) אשר עובר על הקבוצה השריר המתוויך הגדול (D). העורק העדין משמש את IVM באמצעות מיקרוסקופ מכוילת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2846
איור 3: אות עוצמת משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד בנפח הדם Microvascular שרירים וכלי הירך. (א) מבט הניגוד לא לינארית הדמיה במצב של פלטפורמת הדמיה דיגיטלית במהלך microbubbles אינפוזיה קבוע ב- hindlimb העליון עכבר זכר. לוח נכון: שני ROIs נמשכים לייצג את השריר MBV ולכלי הירך. רק החלק שטחית של תא השריר המתוויך נכלל ברועי כאות האינטנסיביות פוחתת עם עומק. פאנל שמאלי: עקומת זמן בעצימות של השריר MBV ROI. קווים אנכיים מייצגים חורבן microbubbles (מבד) עם גלי אנרגיה גבוהה. מיד לאחר מבד, ללא סוכן ניגודיות נוכחת המטוס הדמיה אשר מתחיל למלא עם microbubbles בהדרגה. לאחר 10-15 s, הגיעה לשיא שיפור הניגודיות. (B-D) אחרי אות מצב יציב הושג, הוכפל שיעור אינפוזיה של 2.5 x 109 בועות/mL (5, 10, 20 µL/min). עוצמת האות של שריר MBV (B), כלי הירך (C) הוקרב על הכפלת ריכוז microbubble המוביל במחזור. (ד) Correcting שריר MBV לפי האות כלי הירך מסיר ההשתנות בעוצמת האות נגרמת על ידי ריכוזים שונים microbubble המוביל (N = 9; שגיאה-ברים לייצג סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4209
איור 4: מיקרוסקופ intravital מדידות של העורק העדין. (א) שמן פראפין מפחית את הווריאציה של העורקים העדין של בעלי חיים שונים (וזה מיקרומטר 29.0 ללא פרפין vs 17.9 מיקרומטר לאחר החלת את השמן) תוך שמירה על קוטר ממוצע בסיסית יציבה (מיקרומטר 73.6 לעומת מיקרומטר 68.8; p = 0.58). (B) קטרים עורקי בנקודת ההתחלה, לאחר 60 דקות של חליטות אינסולין או תמיסת מלח. אינסולין לאחר 60 דקות אינפוזיה מורחבים באופן עקבי את העורק העדין (p < 0.0001) בהשוואה אינפוזיה מלוחים. (ג) הנוצרות על-ידי אינסולין vasodilation מתרחשת ב- 10 דקות לאחר תחילת אינפוזיה (p = 0.002) ומגיע 95% מהערך המרבי ב-30 דקות קווי שגיאה לייצג סטיית תקן; מבחן T של סטודנט אינטראקצית משמש עבור סטטיסטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5254
איור 5: Microvascular מדידות נפח הדם, שימוש משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד של תא השריר המתוויך הגדול של Hindlimb העכבר. אינסולין (A), גרמו גידול עקבי MBV 30 דקות לאחר תחילת עירוי אינסולין. (B) ההבדל בין hyperinsulinemic את המדידות בסיסית (שינוי MBV) זה מסומן כמו גיוס microvascular בתיווך אינסולין. אינסולין המושרה של 33.5% (± 31.04%, p = 0.016; N = 7) גיוס microvascular בהשוואה אינפוזיה מלוחים (-10.63 ± 27.87%, N = 6). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן; מבחן T של סטודנט אינטראקצית משמש עבור סטטיסטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פיתחנו שיטה להערכת בו-זמנית פעולות כלי הדם של אינסולין על העורקים גדול יותר (באמצעות IVM), את microcirculation שרירי השלד (באמצעות CEUS). השלבים הקריטיים למדידות מוצלחת ואמינה הם: 1) בצורה נכונה לחשוף את העורק העדין ללא דימום; 2) מניעת דליפה של שמן פרפין רוחצים את העורק; 3) יש גישה ורידית פטנטים (בצינורית וריד הזנב) עבור אינפוזיה של תרכובות vasoactive (אינסולין) ושל סוכן ניגודיות (microbubbles).

המחקר של תפקוד microvascular בשריר יש כבר צובר תשומת לב בהקשר של השמנת יתר, אינסולין ההתנגדות14,25,39,40. ההשפעה השלילית של השמנת יתר, תנגודת לאינסולין על תפקוד כלי הדם מתבטאת ברמות שונות של העץ כלי הדם. מעתה ואילך, גישות שונות נדרשים להעריך שינויים אלה. שימוש בשילוב של טכניקות IVM ו CEUS העכבר באותו מספק כלי רב עוצמה כדי לכמת את ההשפעות של אינסולין ברמות שונות של להערכת. IVM מאפשרת פריט חזותי ישיר וניתוח כמותי של העורק ההתנגדות, CEUS מאפשר הערכה של אינסולין-induced לשינויים שריר זלוף.

לומד תא השריר המתוויך יש מספר יתרונות. העורקים נגישים בקלות ומאפשר הטבע שטחית של החתך לסגור את העור החתך בתפר סטרילי שנספג 5.0 בסיום הניסוי. החיות היו הזריק subcutaneously הבופרנורפין לאחר הניסויים בתור מקבל במינון של 0.1 mg/kg, מותר לשחזר בסביבה חמה. העכברים נסבל היטב את ההליך, שחווינו אין איבוד חיות ולא זיהומים של hindlimb חיות יותר מ-35 למד. זה מאפשר מעקב או ללמוד החיות בצורה אורכית. החיים בניסויים אלה, עם זאת, היו ומורדמת באמצעות כ- 1.8% בשאיפה איזופלוריין מאוזן עם חמצן לזרום ב 0.4 L/דקה של מסיכת ההרדמה. בניגוד איזופלוריין הרדמה41,42, FMA הרדמה לא להפריע הרגישות לאינסולין היקפיים. תוכנית עתידית היא ללמוד כמה טוב העכברים להתאושש FMA הרדמה.

תא השריר המתוויך שימושי גם מאז vasoactive תרכובות שונות מתווכים מקומיים, ניתן להעריך השפעות וסקולרית במורד הזרם. לדוגמה, יישום מקומי של תרכובות אלו ברקמות היעד הוא ריאלי באמצעות טכניקות superfusion28 או השתלה של האזיקים משחררי המקיפים את כלי43מניפולציה כירורגי. יתר על כן, העורק העדין יכול להיות מבודדת ולמד ב myograph הלחץ. הקבוצה שלנו ואחרים נאספו ראיות משמעותי באמצעות myograph את הלחץ כדי לתעד את ההשפעות של אינסולין ותרכובות אחרות vasoactive על זה העורק שמחוץ36,37,38.

מגבלה הטמונה בשימוש של הטכניקה IVM הוא אקספוזיציה כירורגי של שריר ויישום של שמן פראפין לייצב את כלי הדם. . זה לא ברור אם פעולות אלה השפעה על הסביבה המקורית של העורק. עם זאת, איור 3A מראה כי הקוטר בסיסית של העורק העדין טובל בשמן פרפין אינו משתנה במידה ניכרת. גם הוכח כי שמן מינרלי מעכבים בהצלחה פעפוע של חמצן, הגנה על הרקמה מפני תנאים hyperoxic44. יתר על כן, השמן מסייע להפחית את הווריאציה קוטר הבסיס של העורקים. זו הסיבה מדוע אנו עו ד כדי להשתמש בשמן פרפין. ותן הכנה במשך לפחות 30 דקות. ראוי לציין, השימוש במאגר תמיסת. סאלין במקום שמן – או בלי שמן בכלל – הביא קטרים משתנה מאוד, כיווץ של כלי השיט (נתונים לא מוצג). יתר על כן, בסוף הניסויים, אנחנו מבודדים את העורקים העדין - טובל בשמן פרפין - ובדק תגובתיות שלהם ב- myograph הלחץ ex-vivo. העורקים שטוף שמן פרפין הגיבו באופן דומה כדי לשלוט העורקים אחרי גירוי עם אינסולין, אצטילכולין (מרחיב כלי דם) (נתונים לא מוצג). Vasodilation עקבית אינסולין-induced מראה בבירור כי הפרוטוקול IVM המתוארים במחקר זה מייצרת תוצאות אמינות.

היתרון של החלת בשתי הטכניקות העכבר באותו מתגבר על חלק מהמגבלות מהותי של טכניקה אחת בידי הצד השני: CEUS העריכה MBV ב השריר ללא הפרעה ויוו, אבל ניתן לראות כלי שיט פרטניים; IVM מאפשר לראות כלי בודדים, גם אם זה לא יכול להעריך MBV. תוכנית עתידית היא לנצל IVM מיקרוסקופיה של שריר cremaster בשילוב עם CEUS של השריר המתוויך בצד contralateral. שינוי זה יכול לספק הערכה של MBV (באמצעות CEUS), גישה ישירה אופטי הנימים (באמצעות IVM). הפרוטוקול ניתנות לשינוי נוסף; המחבר 4-way המשמש את הצינורית הזנב יכולים לפעול מחבר חמישה כיוונים. על ידי זה, נוכל להימנע ניתוק הצינור הרדמה תוך כדי ביצוע המדידה CEUS השני (המתוארים בפוינט 2.9). מניסיוננו, העכברים נסבל היטב את הפרוטוקול הנוכחי. שינוי אחר שניתן לעשות כדי פרוטוקול זה הוא הקצב קלאמפ אינסולין משמש. השתמשנו 7.5 קצב מו/kg/min קלאמפ הנחשב העל-פיזיולוגיים. המחקר, קצב קלאמפ אינסולין נמוך יותר (לדוגמה 3 מו/kg/min) יכול לשמש בהתאם.

אמנם מצאנו את הפרוטוקול המתואר אמין, ישנם מגבלות מסוימות שדורשים תשומת לב. ישנם מקרים בהם המידה של קוטר העורקים אינה אופטימלית. מבצע ההכנה דורש קצת ניסיון עם הדגם. זה הכרחי כי שמן פרפין אינה דולפת מהסביבה כלי שכשהם אותו בשמן החדש להפריע את כלי הקיבול, לשנות את הקוטר, ולכן יש צורך קילדאש עורק למשך עוד 30 דקות. בנוסף, השתקפות האור (שמתואר בשלב 1.14 לפרוטוקול) על פני השטח של שמן פרפין היה לפעמים בהירים מדי, ולכן קשה להציג את העורק. זה יכול להיות counteracted על ידי הפניית מקור האור כך שהאור מגיע בזווית כדי שמן פרפין משטח, במקביל העורק.

לסיכום, השילוב של IVM וטכניקות CEUS המתוארים במחקר זה מאפשר לכמת אפקטים שונים של אינסולין ברמות שונות של להערכת. IVM של העורק העדין מספק תובנה לגבי השינויים בכלי הדם במעלה לתרום זלוף microvascular במורד הזרם נמדד באמצעות CEUS. אנחנו עו ד השילוב של מספר טכניקות ניסיוני העכבר אותו טוב יותר להעריך את תפקוד כלי הדם.

Disclosures

חזותי Sonics inc. כיסו את דמי גישה פתוחה, ואילו המבנה ואת התוכן של המאמר נשאר באחריות מלאה של המחברים.

Acknowledgements

אנו מודים Ing. דאנקן השמש ואן בתיכנות את תוכנת ניתוח התמונה (ImageGrabber) נעשה שימוש במחקר זה. מימון עבור מחקר זה סופק על ידי מענק להם מארגון הולנד למחקר מדעי (גרנט 016.136.372).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles riverMice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound systemVisualSonics inc.
MS250 non-linear transducerVisualSonics inc.
Vevo 2100 softwareVisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)CSP Medical133-1009Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
VortexVWR international58815-234
Heating pad Pantlab
Freestyle Precision Xceed AbbottTo measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin NovorapidNovo Nordisk
Glucose monohydrate Merck Millipore1083421000
Buffered saline solutionB. Braun152118062
PE-20 medical tubingBecton, Dickinson and Company427405
Needle, 27 Gauge Becton-Dickinson & Co305109
Medical tape3M
Ultrasound probe holderBuilt In-house
Cotton swabsMultiple Equivalent
Creme depilatorMultiple Equivalent
Gel tissue adhesiveDerma+flexGA30005-2222
Infusion pumpHarvard ApparatusHarvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissorsFine Science Tools (FST)14090-09
Needle holderFine Science Tools (FST)12500-12
Straight forceps with fine tipFine Science Tools (FST)11251-20
StereomicroscopeOlympusSZX12
CameraBaslerscA1390-17gc
Image Grabber programBuilt in-houseImage acquisition system
TimerVWR33501-418
Syringes, 1 mLFisher14-817-25
Light source, fiber-opticSchottKL1500Ideally has adjustable arms
Paraffin oilMultiple Equivalent
NameCompanyCatalog NumberComments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids850365C
polyoxyethylene stearate  Sigmap3440
perfluorobutane gas F2 ChemicalsC4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix Lantheus Medical Imaging515370-0810
Multisizer Coulter CounterBeckman Coulter Inc

References

  1. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
  2. Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
  3. Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
  4. Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
  5. Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
  6. Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
  7. Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
  8. Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
  9. Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
  10. Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
  11. Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
  12. Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
  13. Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
  14. Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
  15. Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
  16. Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
  17. Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
  18. Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
  19. Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
  20. Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
  21. de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
  22. Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
  23. Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
  24. Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
  25. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  26. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  27. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
  28. Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91 (2011).
  29. Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
  30. Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  31. Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
  32. Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
  33. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
  34. Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
  35. van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631 (2016).
  36. Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
  37. Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
  38. Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
  39. Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
  40. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
  41. Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
  42. Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519 (2014).
  43. Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
  44. Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121Intravital

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved