Combinato di microscopia Intravital e l'ecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina

Riepilogo

Vasodilatazione indotta da insulina regola perfusione muscolare e aumenta la microvascolare superficie (reclutamento microvascolare) disponibili per lo scambio di soluti tra sangue e tessuti interstizio. Ecografia contrapporre-aumentata e microscopia intravital combinata è presentato per valutare simultaneamente l'azione dell'insulina alle imbarcazioni più grandi e la microcircolazione in vivo.

Abstract

È stato dimostrato che azioni vascolari dell'insulina contribuiscano alla regolazione della sensibilità dell'insulina. Gli effetti dell'insulina sulla perfusione muscolare regolano postprandiale consegna delle sostanze nutrienti e gli ormoni per tessuti insulino-sensibili. Qui descriviamo una tecnica per la combinazione di microscopia intravital (IVM) e l'ecografia contrapporre-aumentata (CEUS) del vano adduttore del hindlimb del mouse per visualizzare contemporaneamente le arterie di resistenza muscolare e perfusione della microcircolazione in vivo. Valutare contemporaneamente effetto dell'insulina a più livelli dell'albero vascolare è importante studiare le relazioni tra molteplici effetti vasoattivi dell'insulina e l'aspersione del muscolo. In questo studio sono stati esperimenti in topi. In primo luogo, la cannula della vena della coda viene inserita per l'infusione di anestesia, composti vasoattivi e agente di contrasto di ultrasuono (lipido-incapsulato microbolle). In secondo luogo, una piccola incisione è fatta nella zona dell'inguine per esporre l'albero arterioso del compartimento di muscolo adduttore. La sonda di ultrasuono è quindi posizionata il hindlimb superiore controlaterale per visualizzare i muscoli in sezione trasversale. Per valutare i parametri della linea di base, viene valutato il diametro arterioso e microbolle sono successivamente infuso ad un tasso costante di stimare il flusso sanguigno del muscolo e del volume sanguigno microvascolare (MBV). Quando applicato prima e durante un morsetto euglycemic hyperinsulinemic, combinato IVM e CEUS consentire la valutazione dei cambiamenti indotti da insulina di diametro arterioso, perfusione microvascolare del muscolo e la sensibilità dell'insulina del corpo intero. Inoltre, il rapporto temporale tra le risposte della microcircolazione e le arterie di resistenza all'insulina può essere quantificato. È anche possibile follow-up il tempo longitudinalmente in topi, che lo rende uno strumento prezioso per studiare i cambiamenti nella sensibilità dell'insulina vascolare e al corpo intero.

Introduzione

In risposta ad un aumento nel livello di glucosio nel sangue, il pancreas secerne insulina nel flusso sanguigno dove viene rapidamente distribuita ai suoi tessuti bersaglio, come muscolo scheletrico, via resistenza arterie e capillari. Il muscolo scheletrico è responsabile ~ 80% di assorbimento di glucosio postprandiale¹. La consegna dell'insulina nell'interstizio del muscolo scheletrico ha dimostrata di essere un tasso che limita il passaggio delle azioni metaboliche dell'insulina che promuovono glucosio smaltimento^2,3,4. Entro 10-15 min, l'insulina aumenta il volume di sangue capillare (reclutamento microvascolare), un effetto che si verifica prima che il flusso sanguigno totale aumenta di^5,6. Microvascolare reclutamento si espande l'area della superficie endoteliale disponibile per scambio di sostanze nutrienti (e insulina)^7,8. Insulina-mediato microvascolare reclutamento precede ed è indipendentemente associata con i cambiamenti in muscolo scheletrico del glucosio assorbimento^8,9. L'effetto dell'insulina sul sistema vascolare è stata definita 'la sensibilità dell'insulina vascolari'.

È stato dimostrato che l'insulina-mediata assunzione microvascolare e vasodilatazione indotta da insulina sono alterati in obese Zucker ratti^10,11. Inoltre, topi magri con ridotta densità capillare visualizzazione muscolo insulino resistenza¹². Nel loro lavoro influente, Kubota et al ha dimostrato che alterata dell'insulina in cellule endoteliali di segnalazione causato riduzione nell'assunzione microvascolare indotta da insulina, che ha ridotto l'assorbimento del glucosio in muscolo scheletrico di circa 40%¹³. Queste anomalie nella funzione microvascolare non solo si verificano nel muscolo, ma anche in più altri tessuti e organi come il cuore, retina e rene^14,15,16. Questi esempi e altri studi^17,18,19,20 suggeriscono che gli effetti vascolari di insulina sono un meccanismo importante in fisiologia (patho) di insulino-resistenza e la sua complicazioni.

Mentre ci è prova notevole che l'insulina aumenta volume sanguigno microvascolare (MBV) nel muscolo scheletrico^5,6, i meccanismi con cui questo accade non sono completamente capito⁹. Vasodilatazione endotelio-dipendente è essenziale in molti aspetti della vascolare insulino sensibilità^21,22,23 a diversi livelli del sistema vascolare. La sensibilità dell'insulina vascolare può manifestarsi da insulina-indotta di rilassamento delle arterie di resistenza e di rilassamento delle arteriole pre-capillari per aumentare il cambio microvascolare irrorato superficie^{7,24, 25}.

La microscopia intravital (IVM) è stata utilizzata in una varietà di preparazioni di tessuto comprese le camere dello skinfold il mouse dorsum²⁶, il mesentere del topo e ratto²⁷, modelli di ischemia dell'arto il mouse²⁸ e il sacchetto di guancia del criceto ²⁹. l'ecografia contrapporre-aumentata (CEUS) è un'altra tecnica di imaging che permette la valutazione del microcircolo in cardiaco³⁰ così come il muscolo scheletrico³¹. Utilizza microbolle riempito di gas inerte che si comportano reologicamente come globuli rossi e rimangono interamente all'interno del lume vascolare. Queste microbolle sono infusi per via endovenosa a velocità costante per raggiungere uno stato stazionario. Un'onda di ultrasuoni ad alta energia, quindi, può essere utilizzata per distruggere le microbolle. Velocità di riempimento dei microbolle nella regione di interesse (ROI) rappresenta la velocità di flusso (MFV). L'intensità del segnale totale dell'immagine contrasto rappresenta il MBV. CEUS può essere eseguita più volte (anche in esseri umani) e ha avanzato la comprensione della disfunzione vascolare che si verifica in Stati di insulino-resistenza (discussi in Barrett et al. ³²).

In questo studio, descriviamo una nuova tecnica per lo studio della regolazione della perfusione del muscolo, attraverso l'uso simultaneo di IVM e CEUS. Qui ci concentriamo su azioni vascolari dell'insulina nel vano adduttore del hindlimb mouse. Questo vano è uno dei più grandi gruppi del muscolo scheletrico nel topo, permettendo studi dell'assorbimento del glucosio locale in un muscolo rappresentativo. Questo comparto è ideale per IVM in quanto la preparazione e la visualizzazione delle arterie sono facilmente accessibili da una procedura chirurgica standardizzata²⁸. Inoltre, il nostro gruppo e altri hanno mostrato CEUS può essere utilizzato in questo compartimento^33,34.

Un vantaggio per la tecnica combinata di IVM e CEUS è la possibilità di valutare l'effetto dell'insulina a livello delle arteriole più grandi (arterie feed o resistenza) e la microcircolazione (letti capillari) nello stesso gruppo muscolare. Inoltre, l'applicazione simultanea di due metodi fornisce insight into the azione temporale dell'insulina a livello delle arterie di resistenza e microcircolazione. Questo combinato IVM e CEUS tecnica può anche essere implementata in altri campi di biologia vascolare. Ad esempio, il ruolo delle varie proteine e determinate condizioni fisiopatologiche che interessa l'endotelio possa essere studiato utilizzando modelli ad eliminazione diretta. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere utilizzate in un mouse a più punti di tempo, riducendo i tempi e i costi della ricerca.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico e cura degli animali locale. L'intero protocollo di induzione dell'anestesia nel topo fino alla fine del morsetto euglycemic hyperinsulinemic impiegano circa 2 ore.

1. microsurgical preparazione

1. Inducono anestesia con analgesia in un topo maschio 20-25 g di peso dopo un 14 h o durante la notte di digiuno con un'iniezione intraperitoneale di Fentanyl (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) e acepromazina (6,25 mg/kg) (anestesia FMA) e posizionarlo su un rilievo di riscaldamento omeotermi rettale a temperatura controllata che mantiene la temperatura corporea a 37 ° C.
2. Disinfettare la tabella di funzionamento e le attrezzature più volte utilizzando una soluzione a base di alcool.
3. Fissare un ago 27G un tubo di 10 cm lungo di polietilene (PE-20) e fissare il tubo al raccordo a 4 vie. Inserire l'ago nella vena caudale e fissarsi utilizzando gel adesivo del tessuto. Questa cannula verrà utilizzato per l'infusione di microbolle, insulina, glucosio e anestesia.
   Nota: L'aggiunta di eparina (5 U/mL) in soluzione salina sterile durante l'inserimento di una canula processo per irrigare la vena caudale (circa 10 µ l) riduce la possibilità di cannule intasati.
4. Durante le procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l'anestesia da un'infusione endovenosa continua di anestesia FMA tramite cannula vena della coda al tasso di 33,75 µ l/kg/min.
5. Inserire il mouse con il lato ventrale verso l'alto e fissare i piedi utilizzando un nastro termostabile per esporre l'area superiore della coscia. Utilizzare un lieve exorotation del giunto dell'anca (paws del hindlimb rivolto verso l'alto) e un angolo di 40-60° all'articolazione del ginocchio per standardizzare il tratto del muscolo il vano adduttori della coscia.
6. Rimuovere i peli all'inguine e nelle aree coscia superiore bilateralmente usando una crema depilatoria. Raccogliere tutti i capelli sciolti con un batuffolo di cotone umido.
7. Posizionare il mouse sotto un microscopio stereoscopico e attenersi alla seguente procedura chirurgica utilizzando 10x di ingrandimento X 16.
8. Fare un'incisione di 2 cm utilizzando forbici pelle che corre parallela al legamento inguinal, appena laterale alla curvatura addominale (Figura 1). Applicare la trazione sul lato distale dell'incisione distalmente utilizzando un bulldog morsetto (Figura 1). Questo vi aiuterà a regolare la finestra in base alle esigenze e contribuire a tenere l'olio di paraffina (descritto in 1.12).
9. Sezionare il tessuto adiposo dalla parete addominale. Per evitare il sanguinamento, separare delicatamente il cuscinetto di grasso dalla parete invece di dissezione direttamente attraverso il pad. Lieve trazione presso il cuscinetto di grasso in direzione distale faciliterà il processo (Figura 1).
10. Identificare l'arteria femorale e seguirla fino ai primi rami principali (l'arteria epigastrica e l'arteria gracilis) (Figura 2). L'arteria gracilis è il primo ramo principale dell'arteria femorale in esecuzione sul muscolo grande adduttore e poi corre profonda per il muscolo gracile. L'arteria gracilis verrà utilizzato per IVM.
11. Identificare la fascia profonda trasparente che copre i muscoli ed i vasi. Utilizzando pinze taglienti, tirare la fascia verso l'alto e tagliarlo usando una MICROFORBICE.
12. Coprire il muscolo esposto con una goccia (200 µ l) di medicinale paraffina liquida (temperatura ambiente, o pre-riscaldato a 37 ° C) per evitare che il tessuto preparate dall'asciugarsi. Assicurarsi che la goccia d'olio non perdita di distanza. Regolare le pieghe di pelle dell'incisione utilizzando il bulldog morsetto per creare una piccola cavità per contenere l'olio di paraffina che bagna i vasi.
13. Posizionare il mouse al microscopio (ingrandimento ottico 16 X) precedentemente calibrato in modo tale che l'arteria gracilis è verticale sullo schermo del computer. Collegare il microscopio a una telecamera e un computer basato su sistema di analisi che può estrarre il diametro dei vasi dal set di dati di immagine. Il diametro è la distanza tra i due lati luminal della nave. Continuo monitoraggio e la misurazione del diametro dell'arteria è auspicabile.
14. Posizionare la sorgente di luce a una distanza sufficiente (minimo 20 cm) dall'arto posteriore per ridurre la testa conduzione dalla luce.
15. Applicare il gel di trasduzione di ultrasuono preriscaldati l'arto posteriore controlaterale superiore. Posizionare la sonda ad ultrasuoni perpendicolare all'asse lungo del femore.
16. Regolare con attenzione l'angolo e la direzione della sonda ecografica per ottenere una vista di sezione trasversale del gruppo del muscolo adduttore. Fare attenzione a mantenere la posizione della sonda ecografica in relazione al mouse stabile per mantenere sullo stesso piano di formazione immagine per le misure della linea di base e hyperinsulinemic.
17. Lasciare che il mouse si stabilizzi per 30 min. Il diametro dell'arteria gracilis dovrebbe essere stabile per 10 min prima che documentano il diametro della linea di base.

2. linea di base e misure Hyperinsulinemic

1. Assicurarsi che il diametro dell'arteria di baseline gracilis è salvato dal programma per computer utilizzato per la IVM.
2. Preparare le microbolle in anticipo come descritto³⁵ e conteggio con Coulter counter ad una concentrazione di 2.5 x 10⁹ bolle/mL appena prima dell'esperimento.
3. Come microbolle possono essere visualizzati solo in modalità a contrasto della macchina ad ultrasuoni, controllare i parametri che influenzano l'immagine e il contrasto dati raccolti (descritto in 2.3.1) e uso costantemente durante l'acquisizione.
   1. Utilizzare le seguenti impostazioni della macchina di ultrasuono: aumento di contrasto a 35 decibel; il tempo ottenere compensazione su OFF; Densità di linee ad alta; Numero di zone focali di WIDE; Potenza di trasmissione di 4%; Trasmettere la larghezza del fascio standard; SV Gate a 4; Sensibilità a 1; Persistenza su OFF. Livello la posizione delle zone di focale al centro della regione di interesse.
4. Salvare un breve (5 s) clip. Questo utilizzerà per calcolare il segnale di fondo.
5. Agitare il flaconcino contenente microbolle a mano per avere una sospensione uniforme. Iniziare l'infusione di microbolle utilizzando la cannula della vena della coda a un tasso di 5 µ l/min. Posizionare il tubo di infusione su una vibrante vortex (200 x / min) per mantenere una sospensione uniforme di microbolle.
6. Lasciare 5 min di infusione continua di microbolle che viene raggiunto un livello stazionario. Procedere con ottenendo le curve di tempo-intensità delle bolle utilizzando la funzione di distruzione di microbolle (MBD) sulla macchina ultrasuoni a 5 min e a 10 min dopo l'inizio dell'infusione di microbolle (Figura 3A). Prendere il segnale medio di queste due misure per ottenere i dati di aspersione della linea di base.
7. Dopo aver ottenuto i dati di previsione, è necessario avviare il morsetto euglycemic hyperinsulinemic come descritto³⁴. Utilizzare la cannula di coda (posizionata in 1.3) per amministrare l'insulina e glucosio (e anestesia).
   1. In breve, indurre uno stato di hyperinsulinemic introducendo un bolo di insulina 200 mU/kg seguito da infusione continua di insulina (7,5 mU/kg/min) per 60 min. uso un'infusione variabile del 20% D-glucosio per mantenere il euglycemia.
   2. Valutare la glicemia da vena caudale ogni 5 min con un dispositivo di monitoraggio del glucosio e mantenere a 5 mM regolando il tasso di infusione del glucosio variabile. Per determinare la sensibilità dell'insulina, in media il tasso di infusione del glucosio media durante gli ultimi 30 minuti.
8. Assicurarsi che il diametro dell'arteria gracilis è documentato presso i periodi di tempo desiderato (ad esempio a 10, 30 e 60 min) dell'inizio del morsetto euglycemic hyperinsulinemic con il programma del computer.
9. Dopo 25 min e/o 55 min del morsetto dell'insulina, iniziare la seconda misurazione (hyperinsulinemic) CEUS per documentare il MBV a 30 o 60 min, rispettivamente. Seguire la stessa procedura descritta in 2.4 e 2.5. Staccare e utilizzare la porta di anestesia del connettore 4 vie per infondere microbolle. Ricollegare il tubo di anestesia dopo la fine dell'infusione di microbolle.
10. Dopo il completamento di IVM e le misurazioni CEUS 60 min dopo l'inizio dell'infusione di insulina, prelevare sangue dal mouse da una procedura di puntura del cuore per un'analisi successiva. Questo sarà anche eutanasia il mouse. Accuratamente sezionare il gracilis e arterie femorali e conservarli per ulteriori esperimenti desiderati (per es., Western blot, immunoistochimica, ex vivo pressione myography esperimenti^{36,37, 38}).

3. analisi offline

Nota: L'analisi di IVM e CEUS misurazioni devono essere effettuate non in linea da un ricercatore accecato. CEUS offre la possibilità di distinguere la microcircolazione dai vasi maggiori di temporaneamente destructing microbolle di onde di ultrasuoni ad alta intensità utilizzando la funzione MBD. Il segnale (misurato in unità arbitrarie (AGU)) in vasi più grandi viene ripristinato più velocemente rispetto a quelli a livello del microcircolo a causa della velocità di microbolle nei vasi corrispondente.

1. Utilizzare una workstation non in linea o il software sulla macchina ad ultrasuoni per fare le analisi.
2. Disegnare un'area di interesse (ROI) per includere la microcircolazione. Disegnare un ROI separato per includere i più grandi vasi femorali (Figura 3A).
3. Duplicare ROIs il di microcircolazione e più grandi vasi per le misurazioni di sfondo, baseline e hyperinsulinemic utilizzando la funzione di copia ROI costruita nel software.
4. Sottrarre il segnale di intensità la misurazione di sfondo dalla linea di base e le misure di hyperinsulinemic.
5. Dividere il segnale di intensità della microcircolazione dal segnale di intensità dei vasi femorali. MBVs basale e hyperinsulinemic ora possono essere confrontati.

Risultati

Tasso di infusione del glucosio durante il morsetto euglycemic hyperinsulinemic (la sensibilità dell'insulina) era 180,21 ± 19,81 µmol/kg/min applicazione locale di olio di paraffina nello scomparto del muscolo adduttore per stabilizzare la nave non ha cambiato il diametro medio della linea di base delle arterie (73,6 ± 29,0 µm vs 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58) ma ha contribuito a ridurre la variazione degli animali testati (Figura 4A). Insulina costantemente aumentati il diametro dell'arteria gracilis (14,58 ± 6,2% a 60 min; N = 9) che era significativamente differente (p < 0,0001) dal cambiamento di diametro causati dall'infusione salina (-6,3 ± 4,9%; N = 6). Vasodilatazione indotta da insulina era apprezzabile dopo 10 min (10,09 ± 5,1%; p = 0,002) e raggiunge circa il 95% della sua capacità massima dilatorio dopo 30 min.

Utilizzando CEUS, insulina costantemente aumentati del muscolo MBV (Figura 5A) 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0,0009) rispetto all'infusione salina (-10.63 ± 27,87%, N = 6) (figura 5B). I dati presentati sono le intensità di segnale del muscolo MBV che diviso in vasi femorali. Questo riduce la variazione sperimentale tra diverse misure e tra diversi topi (dati non mostrati). L'intensità di segnale in vasi femorali corrisponde linearmente con la concentrazione di microbolle in circolazione (Figura 3). Correzione per il segnale dei vasi femorali teoricamente corregge le differenze nelle concentrazioni di microbolle utilizzato (Figura 3D). I dati sono presentati in questa sezione come media ± deviazione standard.

Figura 1: Esposizione chirurgica del compartimento adduttore del Hindlimb. (A) un'incisione è fatta all'inguine, parallela alla direzione del legamento inguinale. (B) lieve trazione presso il cuscinetto di grasso in direzione distale (frecce nere) presenterà il tessuto connettivo (*) tra il cuscinetto di grasso e la parete addominale. (C) la pelle pieghe dell'incisione possono essere regolate utilizzando il bulldog morsetto per creare una piccola cavità per contenere l'olio di paraffina che bagna i vasi. (D), l'ultrasuono sonda viene posizionato sull'arto posteriore superiore controlaterale dopo l'arteria gracilis preparato viene visualizzato tramite un microscopio calibrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Microscopia intravital del Hindlimb Mouse. L'arteria femorale (A) dà luogo all'arteria epigastrica (B) e l'arteria gracilis (C) che corre sopra il gruppo di muscoli adduttori (D). L'arteria gracilis è utilizzato per la IVM usando un microscopio calibrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Segnale di intensità dell'ecografia contrapporre-aumentato in Volume sanguigno microvascolare del muscolo e vasi femorali. (A) vista il contrasto non lineare modalità della piattaforma di imaging digitale di imaging durante l'infusione costante di microbolle in un arto posteriore superiore di topo maschio. Pannello di destra: due ROIs sono disegnati per rappresentare il muscolo MBV e vasi femorali. Solo la parte superficiale del comparto muscolo adduttore è inclusa nel ROI come segnale di intensità diminuisce con la profondità. Pannello di sinistra: curva tempo-intensità dal muscolo MBV ROI. Linee verticali rappresentano la distruzione delle microbolle (MBD) con onde ad alta energia. Immediatamente dopo il MBD, nessun agente di contrasto è presente nel piano imaging che inizia a riempirsi di microbolle gradualmente. Dopo 10-15 s, è stato raggiunto il picco del miglioramento del contrasto. (B-D) Dopo un segnale allo steady-state è stato raggiunto, è stata raddoppiata la velocità di infusione di 2,5 x 10⁹ bolle/mL (5, 10, 20 µ l/min). L'intensità del segnale da muscolo MBV (B) e vasi femorali (C) ha messo in parallelo il raddoppiamento della concentrazione microbolle in circolazione. (D) Correcting muscolare MBV per il segnale di vasi femorali rimuove la variabilità nell'intensità del segnale causato da microbolle diverse concentrazioni (N = 9; barre di errore rappresentano la deviazione standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misure di microscopia intravital dell'arteria Gracilis. (A) l'olio di paraffina riduce la variazione delle arterie gracilis di diversi animali (ovvero 29.0 µm senza paraffina vs 17,9 µm dopo aver applicato l'olio) mantenendo il diametro medio della linea di base stabile (73,6 µm vs 68,8 µm; p = 0,58). Diametri arteriosa (B) al basale e dopo 60 min di infusioni di insulina o di soluzione fisiologica. Insulina dopo 60 min infusione costantemente dilatata l'arteria gracilis (p < 0,0001) rispetto all'infusione salina. (C) la vasodilatazione indotta da insulina si verifica a 10 min dopo l'inizio dell'infusione (p = 0,002) e raggiunge il 95% del massimo a 30 min. barre di errore rappresentano deviazione standard; test T di Student spaiato è utilizzato per le statistiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Misure di Volume sanguigno microvascolare usando l'ecografia contrapporre-aumentata del compartimento di muscolo adduttore del Hindlimb Mouse. (A) insulina ha provocato un aumento consistente in MBV 30 min dopo l'inizio dell'infusione di insulina. (B) la differenza tra il hyperinsulinemic e le misurazioni di base (cambiamento MBV) è indicato come il reclutamento microvascolare insulina-mediato. Insulina indotto un 33,5% (± 31.04%, p = 0,016; N = 7) reclutamento microvascolare rispetto all'infusione salina (-10.63 ± 27,87%, N = 6). Barre di errore rappresentano la deviazione standard; test T di Student spaiato è utilizzato per le statistiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Abbiamo sviluppato una tecnica per stimare contemporaneamente azioni vascolari dell'insulina sui più grandi arterie (utilizzando IVM) e il microcircolo del muscolo scheletrico (utilizzando CEUS). I passaggi critici per misurazioni affidabili e di successo sono: 1) esporre correttamente l'arteria gracilis senza sanguinamento; 2) prevenire perdite di olio di paraffina balneazione l'arteria; 3) avendo un accesso venoso brevetto (cannula per vena della coda) per infusione di composti vasoattivi (insulina) e agente di contrasto (microbolle).

Lo studio della disfunzione microvascolare nel muscolo è stato guadagnando attenzione nel contesto dell'obesità e insulino resistenza^14,25,39,40. L'impatto negativo dell'obesità e l'insulino-resistenza sulla funzione vascolare si manifesta a diversi livelli dell'albero vascolare. D'ora in poi, diversi approcci sono richiesti per valutare questi cambiamenti. L'uso combinato delle tecniche IVM e CEUS nel topo stesso fornisce un potente strumento per quantificare gli effetti dell'insulina a diversi livelli del sistema vascolare. IVM permette la visualizzazione diretta e analisi quantitativa dell'arteria resistenza e CEUS consente per la valutazione dei cambiamenti indotti da insulina nell'aspersione del muscolo.

Studiando il vano del muscolo adduttore ha diversi vantaggi. Le arterie sono facilmente accessibili e la natura superficiale dell'incisione permette di chiudere l'incisione cutanea con un 5,0 sutura riassorbibile sterile dopo l'esperimento è finito. Gli animali sono stati iniettati per via sottocutanea con buprenorfina dopo gli esperimenti come analgesico ad una dose di 0,1 mg/kg e ha permesso di recuperare in un ambiente caldo. I topi tollerato molto bene la procedura e abbiamo sperimentato senza perdita di animali né infezioni del hindlimb in più di 35 animali studiati. Questo rende possibile al follow-up o studiare gli animali in modo longitudinale. Gli animali utilizzati in questi esperimenti, tuttavia, sono stati anestetizzati con isoflurano 1,8% inalato bilanciato con l'ossigeno che scorre a 0,4 L/min, anche se una maschera di anestesia. In contrasto con isoflurano anestesia^41,42, anestesia FMA non interferisce con la sensibilità periferica dell'insulina. Un progetto per il futuro è quello di studiare quanto bene i topi recupero dall'anestesia FMA.

Il vano di muscolo adduttore è utile anche da vari composti vasoattivi mediazione locale e possono essere valutati gli effetti vascolari a valle. Ad esempio, l'applicazione topica di questi composti per il tessuto bersaglio è fattibile utilizzando tecniche sopraffusione²⁸ o manipolazione chirurgica e l'impianto di polsini medicati che circondano i vasi⁴³. Inoltre, l'arteria gracilis può essere isolato e studiato nel myograph di pressione. Il nostro gruppo e gli altri si sono riuniti evidenze sperimentali utilizzando il myograph di pressione per documentare gli effetti di insulina e di altri composti vasoattivi su questa arteria ex vivo^36,37,38.

Una limitazione inerente all'uso della tecnica IVM è l'esposizione chirurgica del muscolo e l'applicazione di olio di paraffina per stabilizzare i vasi. Non è chiaro se queste azioni impattano l'ambiente nativo dell'arteria. Figura 3A Mostra tuttavia che il diametro della linea di base dell'arteria gracilis immerso in olio di paraffina non cambia considerevolmente. È stato anche dimostrato che l'olio minerale inibisce con successo la diffusione dell'ossigeno, proteggendo il tessuto da hyperoxic condizioni⁴⁴. Inoltre, l'olio aiuta a ridurre la variazione del diametro basale delle arterie. Ecco perché sosteniamo da usare olio di paraffina e lasciate riposare la preparazione per almeno 30 min. Di nota, l'uso di soluzione salina tamponata invece di olio – o non provocato a tutti – diametri altamente variabili e la costrizione della nave (dati non mostrati). Inoltre, alla fine degli esperimenti, abbiamo isolato le arterie gracilis - bagnate in olio di paraffina - e testato la loro reattività nella myograph pressione ex vivo. Le arterie di bagno d'olio di paraffina ha reagito allo stesso modo per controllare le arterie quando stimolati con insulina e acetilcolina (un vasodilatatore) (dati non mostrati). La vasodilatazione indotta da insulina coerenza dimostra chiaramente che il protocollo IVM descritto in questo studio produce risultati affidabili.

Il vantaggio di applicare entrambe le tecniche nel topo stesso supera alcune delle limitazioni intrinseche di una tecnica da altra: CEUS stime MBV nel muscolo indisturbati in vivo, ma non si vede singole navi; IVM rende possibile vedere singole navi, anche se esso non può stimare MBV. Un progetto per il futuro è quello di utilizzare la microscopia IVM del muscolo cremastere in combinazione con CEUS del muscolo adduttore sul lato controlaterale. Questa modifica può fornire una stima di MBV (utilizzando CEUS) e un accesso ottico diretto ai capillari (utilizzando IVM). Il protocollo può essere ulteriormente modificato; il raccordo a 4 vie utilizzata per la cannula di coda può essere commutato a un connettore a 5 vie. In questo modo, possiamo evitare di staccare il tubo di anestesia durante l'esecuzione la seconda misurazione CEUS (descritta nel punto 2.9). Nella nostra esperienza, i topi ha tollerato bene l'attuale protocollo. Un'altra modifica che può essere fatto per questo protocollo è utilizzato il tasso del morsetto dell'insulina. Abbiamo usato 7,5 tariffa morsetto mU/kg/min, che è considerato sovra-fisiologiche. Secondo lo studio, un basso tasso di morsetto di insulina (per esempio 3 mU/kg/min) possa essere usato.

Mentre abbiamo trovato il protocollo descritto affidabile, ci sono limitazioni specifiche che richiedono attenzione. Ci sono situazioni in cui la misurazione del diametro arterioso non è ottima. L'esecuzione della procedura di preparazione richiede qualche esperienza con il modello. È fondamentale che l'olio di paraffina non ci siano perdite dall'ambiente nave come completandolo con olio nuovo sarà disturbare il vaso e cambiare il diametro, rendendo necessario lasciare riposare l'arteria per altri 30 min. Inoltre, la riflessione della luce (descritta al punto 1.14 del protocollo) sulla superficie dell'olio di paraffina a volte era troppo luminosa, rendendolo difficile visualizzare l'arteria. Questo può essere neutralizzato da dirigere la sorgente luminosa in modo che la luce cade ad angolo per l'olio di paraffina superficiale e parallela all'arteria.

In conclusione, la combinazione di tecniche IVM e CEUS descritti in questo studio rende possibile quantificare gli effetti differenti di insulina a diversi livelli del sistema vascolare. IVM dell'arteria gracilis offre informazioni approfondite i cambiamenti vascolari a Monte contribuendo alla perfusione microvascolare a valle misurato utilizzando CEUS. Sosteniamo che la combinazione di diverse tecniche sperimentali nel topo stesso per meglio valutare la funzione vascolare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mice	Charles river		Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system	VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer	VisualSonics inc.
Vevo 2100 software	VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009	Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex	VWR international	58815-234
Heating pad	Pantlab
Freestyle Precision Xceed	Abbott		To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid	Novo Nordisk
Glucose monohydrate	Merck Millipore	1083421000
Buffered saline solution	B. Braun	152118062
PE-20 medical tubing	Becton, Dickinson and Company	427405
Needle, 27 Gauge	Becton-Dickinson & Co	305109
Medical tape	3M
Ultrasound probe holder			Built In-house
Cotton swabs			Multiple Equivalent
Creme depilator			Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive	Derma+flex	GA30005-2222
Infusion pump	Harvard Apparatus	Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors	Fine Science Tools (FST)	14090-09
Needle holder	Fine Science Tools (FST)	12500-12
Straight forceps with fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-20
Stereomicroscope	Olympus	SZX12
Camera	Basler	scA1390-17gc
Image Grabber program	Built in-house		Image acquisition system
Timer	VWR	33501-418
Syringes, 1 mL	Fisher	14-817-25
Light source, fiber-optic	Schott	KL1500	Ideally has adjustable arms
Paraffin oil			Multiple Equivalent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850365C
polyoxyethylene stearate	Sigma	p3440
perfluorobutane gas	F2 Chemicals	C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath	Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515370-0810
Multisizer Coulter Counter	Beckman Coulter Inc