Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine

Özet

İnsülin kaynaklı vazodilatasyon kas perfüzyon düzenleyen ve mikrovasküler artırır kan ve doku interstitium arasında yüzey alanı (mikrovasküler işe alım) çözünen değişimi için kullanılabilir. Kombine intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi sunulan aynı anda insülin'ın eylem daha büyük gemiler ve mikro değerlendirmek için içinde vivo.

Özet

İnsülin'ın vasküler eylemler için düzenleme, insülin duyarlılığı katkıda kanıtlanmıştır. İnsülin'ın etkileri kas perfüzyon insülin duyarlı dokulara besin ve hormonlar tokluk teslim düzenleyen. Biz burada intravital mikroskobu (IVM) ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi (CEUS) aynı anda kas direnci arterler görselleştirmek için fare hindlimb adductor bölmesinin ve perfüzyon, birleştirme tekniği tarif mikro içinde vivo. Aynı anda birden çok düzeyde vasküler ağacının insülin'ın etkisi değerlendirilmesi insülin'in birden çok vazoaktif etkileri ve kas perfüzyon arasındaki ilişkileri incelemek önemlidir. Bu çalışmada deneyler farelerde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, kuyruk ven kanülü anestezi, vazoaktif bileşikler ve ultrason kontrast Aracısı (lipid kapsüllü microbubbles) infüzyonu için eklenir. İkinci olarak, küçük bir insizyon attım kasık bölgesinde adductor kas yuvası arteriyel ağaç ortaya çıkarmak için yapılır. Ultrason sonda sonra kasları kesit içinde görüntülemek üzere kontralateral üst hindlimb de yer alıyor. Temel parametrelerini değerlendirmek için arter çapı değerlendirildiğini ve microbubbles daha sonra kas kan akımı ve mikrovasküler kan hacmi (MBV) tahmin etmek için sabit bir oranda aşılanmış. Öncesi ve sırasında bir hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe uygulandığında, kombine IVM ve CEUS insülin kaynaklı değişiklikler arter çapı, mikrovasküler kas perfüzyon ve tüm vücut insülin duyarlılığı değerlendirmesini sağlar. Ayrıca, yanıt mikrosirkülasyon ve insülin direnci arterler zamansal ilişkisi sayısal. Fareler boyuna içinde zaman içinde damar ve tüm vücut insülin duyarlılık değişiklikleri incelemek için değerli bir araç yapma takip olanağı da sağlar.

Giriş

Kan şekeri düzeyini bir artış yanıt olarak, pankreas nerede o hızla direnç damarları ve kılcal damarlar yoluyla kas iskelet gibi onun hedef dokulara yayılabilen kana insülin salgılar. Kas iskelet tokluk glukoz alımını¹~ %80 için sorumludur. İskelet kası interstitium insülin teslimini adım glikoz elden çıkarma^2,3,4teşvik metabolik eylemler insülin için sınırlama bir oran olması göstermiştir. 10-15 dk içinde insülin kılcal kan hacmi (mikrovasküler işe alım),^5,6toplam kan akışını artırır önce oluşan bir etkisi artar. Mikrovasküler İşe Alım Satım besin (ve insülin)^7,8için kullanılabilir endotel yüzey alanı genişler. İnsülin-aracılı mikrovasküler işe alım öncesinde ve bağımsız olarak değişiklikler kas iskelet glikoz alımı^8,9ile ilişkilidir. İnsülin etkisi damarlara 'vasküler insülin duyarlılık' olarak adlandırdığı.

İnsülin-aracılı mikrovasküler işe alım ve insülin kaynaklı vazodilatasyon obez Zucker fareler^10,11' Engelliler gösterilmiştir. Ayrıca, azaltılmış kapiller yoğunluk ile yalın fareler kas insülin direnci¹²görüntüler. Etkili işlerinde Kubota vd. endotel hücrelerinde sinyal bozulmuş insülin glukoz alımını iskelet kası tarafından yaklaşık^%1340 azaltılmış, insülin kaynaklı mikrovasküler işe azaltma neden gösterdi. Bu anormallikler mikrovasküler işlevinde sadece kas, ama aynı zamanda içinde birden çok diğer doku ve organlar kalp gibi retina ve böbrek^14,15,16meydana gelmez. Bu örnekleri ve diğer çalışmalar^17,18,19,20 vasküler insülin etkileri (patho) fizyolojisi insülin direnci önemli bir mekanizma olduğunu göstermektedir ve onun komplikasyonlar.

İnsülin mikrovasküler kan hacmi (MBV) kas iskelet^5,6artar önemli kanıtlar varken, hangi tarafından bu olur mekanizmaları tamamen anlaşılır⁹değildir. Endotel bağımlı vazodilatasyon damarlara farklı düzeylerinde damar insülin duyarlılığı^21,22,23 birçok yönleriyle esastır. Kendisi insülin kaynaklı gevşeme direnç arter ve gevşeme derin mikrovasküler Satım yüzey alanı^{7,24artırmak için önceden kapiller arteriyoller tarafından meydana gelen vasküler insülin duyarlılığı, 25}.

İntravital mikroskobu (IVM) doku hazırlıklar fare²⁸ ve hamster yanak kese içinde fare patolojisi²⁶, fare ve sıçan²⁷bıçaklanmasından, bacak iskemi modelleri deri kıvrım odaları da dahil olmak üzere çeşitli kullanılan ²⁹. kontrast-artırılmış Ultrasonografi (CEUS) olduğu başka bir görüntüleme tekniği kalp³⁰ kas iskelet³¹mikrosirkulasyon değerlendirme sağlar. Rheologically kırmızı kan hücreleri olarak davranır ve tamamen vasküler Lümen içinde kalır inert gaz dolu microbubbles kullanır. Bu microbubbles intravenöz kararlı bir duruma ulaşmak için sabit bir oranda aşılanmış bulunmaktadır. Yüksek enerji ultrason dalgası, daha sonra microbubbles yok etmek için kullanılabilir. Faiz (ROI) bölgesinde microbubbles stok yenileme hızı akış hızı (MFV) temsil eder. Kontrast görüntü toplam sinyal yoğunluğu MBV temsil eder. CEUS art arda (aynı zamanda insanlarda) gerçekleştirilebilir ve bu insülin dayanıklı devletler (Barrett ve ark. içinde ele oluşur vasküler disfonksiyon anlayışı gelişmiş ³²).

Geçerli çalışma odasında IVM ve CEUS eşzamanlı kullanımı yoluyla kas perfüzyon düzenlenmesi için yeni bir yüntem açıklar. Burada fare hindlimb adductor yerde insülin'ın vasküler eylemler ele. Bu bölümü çalışmaları yerel glikoz Alım temsilcisi bir kas etkinleştirme en büyük iskelet kas gruplarını Mouse, biridir. Bu bölme, IVM için hazırlık ve görselleştirme arter tarafından bir standart cerrahi işlem²⁸kolayca erişilebilir olarak idealdir. Ayrıca, kendi grubu ve diğerleri CEUS bu bölme^33,34kullanılabileceğini göstermiştir.

Olasılık insülin'ın etkisi büyük arteriyoller (yem ya da direnç arterler) ve aynı kas grubunda (kapiller yatak) mikro düzeyde değerlendirmek için kombine IVM ve CEUS tekniği için bir avantajdır. Buna ek olarak, iki yöntemden birini eşzamanlı uygulama insülin direnci arterler ve mikro düzeyde zamansal eylem içgörü sağlar. Bu IVM birlikte ve CEUS tekniği diğer vasküler Biyoloji alanlarında da uygulanabilir. Örneğin, çeşitli proteinlerin ve endotel etkileyen patofizyolojik belirli koşullar rolü nakavt modelleri kullanarak okudu. Ayrıca, her iki teknikleri zaman ve araştırma maliyetini azaltarak birden fazla zaman noktalarda bir fare kullanılabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri yerel hayvan bakımı ve Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Tüm iletişim kuralından fare anestezi indüksiyon hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe sonuna kadar yaklaşık 2 saat sürer.

1. mikrocerrahi hazırlık

1. Anestezi analjezi sonra 14 h 20-25 g ağırlığında bir erkek fare ile birlikte teşvik veya mayi iğne fentanil (0.31 mg/kg), Midazolam (6.25 mg/kg) ve Acepromazine (6.25 mg/kg) (FMA anestezi) oruç bir gecede ve yerleştirin bir vücut ısısı 37 ° C'de korur rektal ısı kontrollü homeothermic Isıtma yastığı
2. Operasyon Masası ve birkaç kez alkol bazlı çözümünü kullanarak donanımları dezenfekte edin.
3. 10 cm uzun polietilen boru (PE-20) 27 G iğne takın ve tüp 4 yönlü konektörüne takın. İğne kuyruğu damarda eklemek ve doku yapıştırıcı jel kullanarak bağlayacaktın. Bu kanül microbubbles, insülin, glikoz ve anestezi infüzyonu için kullanılacaktır.
   Not: Heparin ekleme (5 U/mL) cannulation sırasında steril serum fizyolojik içinde kuyruk ven (yaklaşık 10 µL) temizleme işlemi tıkanmış Kanüller olasılığını azaltır.
4. Cerrahi girişimler ve deneysel protokoller boyunca anestezi FMA anestezi ile kuyruk ven kanülü 33.75 µL/kg/dk hızında sürekli bir intravenöz infüzyon ile sürdürmek.
5. Fareyi ventral tarafı yukarı yerleştirin ve üst kalça alan ortaya çıkarmak için bir transfer bant kullanarak ayak düzeltin. Kalça eklemi (yukarı dönük olacak şekilde hindlimb pençeleri) ve 40-60 ° açı hafif bir exorotation diz eklem kas adductor bölmenin uyluğun, streç standartlaştırmak için kullanın.
6. Saç kasık ve bilateral depilatory krem kullanarak üst kalça alanları kaldırın. Bir ıslak pamuk bez ile tüm gevşek saç toplamak.
7. Yer altında bir stereomicroscope fare ve 10 X 16 X büyütme kullanarak aşağıdaki cerrahi adımları gerçekleştirin.
8. İnguinal ligament, karın eğriliği (şekil 1) sadece yanal için paralel çalışan cilt makas kullanarak bir 2 cm kesi yapmak. Çekiş klemple bir bulldog kelepçe (şekil 1 d) kullanarak kesi distal tarafında geçerlidir. Bu pencerenin gerektiği gibi ayarlayın ve parafin yağı (1.12 içinde açıklanan) tutmak yardımcı olmak için yardımcı olacaktır.
9. Yağ dokusu karın duvarı uzak incelemek. Kanama önlemek için hafifçe yağ yastığı yerine doğrudan pad ile anatomi duvar ayırmak. Distal yönde yağ yastığı, nazik çekiş (şekil 1 c) süreci kolaylaştıracaktır.
10. Femoral arter tanımlamak ve ilk büyük dalları aşağı (epigastrik arter ve gracilis arter) izleyin (Şekil 2). Gracilis arter femoral arter adductor magnus kas üzerinde çalışan ilk büyük dalıdır ve sonra derin gracilis kas çalışır. Gracilis arter IVM için kullanılacaktır.
11. Kaslar ve damarları kaplayan şeffaf derin fasya tanımlayın. Keskin forseps kullanarak, fasya yukarı doğru çekin ve bir microscissor kullanarak kesti.
12. Bir damla (200 µL) ile maruz kalan kas tıbbi Sıvı parafin kapak (Oda sıcaklığı veya 37 ° C için önceden ısındı) hazırlanmış doku kurumasını önlemek için. Yağ damla uzak sızıntı değil ki emin olun. Bulldog kelepçe damarları banyoları parafin yağı tutmak için küçük bir boşluk oluşturmak için kullanma belgili tanımlık kesme deri kıvrımları ayarlayın.
13. Önceden ayarlanmış mikroskop (16 X optik büyütme) altında fare gracilis arter bilgisayar ekranında dikey şekilde yerleştirin. Mikroskop bağlamak bir kamera ve bilgisayar tabanlı damarları çapı görüntü veri kümesinden ayıklayabilirsiniz analiz sistemi. Çapı gemi iki luminal tarafına arasındaki mesafedir. Sürekli izlenmesi ve Arter çapı ölçümü arzu.
14. Işık kaynağı ışık kafa iletim azaltmak için hindlimb yeterli bir mesafede (en az 20 cm) yerleştirin.
15. Prewarmed ultrason iletim jel üst kontralateral hindlimb için geçerlidir. Ultrason sonda uyluk kemiği uzun eksenine dik yerleştirin.
16. Dikkatle açı ve adductor kas grubu kesitsel bir görünümünü elde etmek ultrason sonda yönünü ayarlayın. Fare ile ilgili olarak ultrason sonda konumunu temel ve hyperinsulinemic ölçmeler için aynı görüntüleme uçak tutmak için sabit tutmak için dikkat ediniz.
17. 30 dk için stabilize fare izin. Temel çapı belgeleyen önce gracilis arter çapı 10 dakikadır kararlı olmalıdır.

2. temel ve Hyperinsulinemic ölçümleri

1. Temel gracilis arter çapı IVM için kullanılan bilgisayar programı tarafından kaydedildiğinden emin olun.
2. Coulter karşı 2. 5 x 10⁹ kabarcıklar/mL deneme hemen önce bir konsantrasyon ile microbubbles önceden açıklanan³⁵ ve sayısı olarak hazırlayın.
3. Microbubbles yalnızca karşıtlık-modunda ultrason makinenin görülebilir gibi görüntü etkileyen parametreler kontrol ve toplanan kontrast veriler (açıklandığı 2.3.1) ve satın alma sürekli kullanımda.
   1. Ultrason makinede aşağıdaki ayarları kullanın: kontrast kazanç, 35 desibel; zaman off tazminat elde etmek; Satır yoğunluğu yüksek; Odak bölgeleri çapında sayısı; % 4 güç iletimi; Işın genişliği standart iletimi; SV kapısı 4; 1 duyarlılık; Sebat kapalı olarak. Odak bölgeleri konuma ilgi bölgesinin Merkezi düzeyde.
4. Kısa bir kaydetmek (5 s) klip. Bu arka plan sinyal hesaplamak için kullanılacaktır.
5. El ile tek tip bir süspansiyon için microbubbles içeren flakon sallamak. Kuyruk ven kanülü 5 µL/dk hızında çalıştırarak microbubbles beslerken başlatın. Microbubbles bir tek tip süspansiyon korumak için infüzyon tüp titreşimli girdap (min başına 200 x) yerleştirin.
6. Böylece bir kararlı durum seviyeye ulaşmıştır microbubbles sürekli infüzyon 5 dk izin. Difüzörü imha işlevini (MBD) kullanarak kabarcıklar zaman yoğunluğu eğrileri elde etme ile 5 dk ve 10 dk ultrason makinede microbubbles infüzyon (şekil 3A) başladıktan sonra devam. Bu iki ölçüm ortalama sinyal temel perfüzyon verilerini almak için al.
7. Temel veriler alındıktan sonra hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe açıklanan³⁴başlatın. (1. 3'yerleştirilen) kuyruk kanül insülin ve glikoz (ve anestezi) yönetmek için kullanın.
   1. Kısacası, değişken bir infüzyon % 20 60 dk. kullanım için sürekli insülin infüzyonu (7,5 mU/kg/dak) tarafından takip 200 mU/kg insülin bolus tanıtarak bir hyperinsulinemic devlet teşvik euglycemia korumak için D-glikoz.
   2. Her 5 dk kuyruk damardan kan şekeri glukoz izleme aygıtı ile değerlendirmek ve değişken glikoz infüzyon hızı ayarlayarak 5 mM korumak. İnsülin duyarlılığı ortalama glikoz infüzyonu oranı son 30 dakika sayı ortalaması alınarak belirlemek.
8. Gracilis arter çapı dönemlerde istenen (örneğin, 10, 30 ve 60 dk) bilgisayar programı ile hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe başlangıç belgelenen emin olun.
9. 25 min sonra ve/veya insülin kelepçe, 55 dk. 30 ve/veya 60 dk, MBV sırasıyla belgelemek için ikinci (hyperinsulinemic) CEUS ölçüm başlatın. 2.4 ve 2.5 konusunda açıklanan adımları izleyin. Bağlantısını kesin ve microbubbles demlemek için 4 yönlü bağlantılarının anestezi bağlantı noktasını kullanın. Anestezi tüp microbubbles infüzyon bitiminden sonra yeniden bağlayın.
10. IVM ve insülin infüzyonu CEUS ölçümleri başladıktan sonra 60 dk tamamlandıktan sonra kan daha sonraki analizler için bir kalp ponksiyon yordam tarafından fare geri alıyorum. Bu aynı zamanda fare ötenazi. Dikkatle gracilis ve femoral arterler incelemek ve daha fazla istenen deneyler için saklamak ( örneğiniçin Batı lekesi, immünhistokimya, ex vivo basınç myography^{36,37, deneyler 38}).

3. çevrimdışı analiz

Not: IVM ve CEUS ölçümleri analizleri çevrimdışı kör bir dedektif tarafından gerçekleştirilmelidir. CEUS daha büyük gemiler mikro geçici olarak microbubbles yüksek yoğunluklu ultrason dalgaları MBD işlevini kullanarak tarafından tahrip tarafından ayırt etmek imkanı sunuyor. (Rasgele birimlerinde (a.u) daha büyük gemiler ölçülür) sinyal bu mikro daha hızlı karşılık gelen damarlarının microbubbles hız nedeniyle geri yüklenir.

1. Çevrimdışı bir iş istasyonu veya yazılım ultrason makinede analizler yapmak için kullanın.
2. Bir bölge çıkarlarını (ROI) mikro dahil etmek için çizin. Daha büyük femur gemiler (şekil 3A) dahil etmek için ayrı bir yatırım Getirisi çizin.
3. Arka plan, temel ve hyperinsulinemic ölçümler için mikro'nın ve daha büyük gemiler ROIs yazılımda yerleşik ROI Kopyala işlevini kullanarak yinelenen.
4. Arka plan ölçüm taban çizgisinden ve hyperinsulinemic ölçümleri yoğunluğunu sinyal çıkarma.
5. Mikro yoğunluğu sinyal şiddeti sinyal femur gemilerin bölün. Temel ve hyperinsulinemic MBVs şimdi karşılaştırılabilir.

Sonuçlar

Glikoz infüzyonu oranı hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe (insülin duyarlılık) sırasında oldu 180.21 ± 19.81 µmol/kg/dak gemi stabilize etmek için yerel uygulama parafin yağı adductor kas yuvası üzerinde ortalama temel çapı değişmedi damarların (73,6 ± 29.0 µm vs 68.8 ± 17,9 µm; p 0,58 =) ama varyasyon azaltmak yardımcı hayvanlar test (şekil 4A). İnsülin sürekli gracilis arter çapı (14.58 ± %6,2 60 dk; artışla N = 9) önemli ölçüde farklı olduğu (p < 0.0001) çapı değişikliğinden kaynaklanan tarafından salin infüzyon (-6.3 ± % 4.9; N = 6). İnsülin kaynaklı vazodilatasyon kayda değer 10 dakika sonra (10.09 ± %5.1; p = 0,002) ve 30 dk sonra en fazla akıl kapasitesi yaklaşık % 95'i ulaştı.

CEUS kullanarak, insülin sürekli kas MBV (şekil 5A) 33.5 oranında artmıştır (%31.04 ±, N = 7; p 0.0009 =) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında (-10.63 ± %27.87, N = 6) (şekil 5B). Sunulan veriler kas tarafından femur damarları bölünmüş MBV sinyal yoğunluklarda vardır. Bu deneysel varyasyon farklı ölçümleri arasında farklı fare (veri gösterilmez) arasında azaltır. Sinyal şiddeti femur damarlarının doğrusal olarak microbubbles (şekil 3 c) dolaşımda konsantrasyon ile karşılık gelir. Femur damarları sinyal için teorik olarak düzeltme kullanılan microbubbles (şekil 3D) konsantrasyonları farklılıkları düzeltir. Veri ± standart sapma anlamına Bu bölümde sunulmaktadır.

Şekil 1: Hindlimb Adductor bölmesinin cerrahi fuar. (A)bir kesi yapılır kasık, inguinal ligament yönüne paralel. (B) yumuşak çekiş distal yönde (siyah oklar) yağ yastığı, bağ dokusu (*) yağ yastığı ve karın duvarı arasında sunacak. Belgili tanımlık kesme (C) deri kıvrımları damarları banyoları parafin yağı tutmak için küçük bir boşluk oluşturmak için buldozer kelepçe kullanılarak ayarlanabilir. Sonra hazırlanan gracilis arter kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak görülüyor (D) ultrason sonda kontralateral üst hindlimb üzerinde konumlandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Fare Hindlimb intravital mikroskobu. Femoral arter(a)epigastrik arter (B) ve (D) adductor kas grubu üzerinde çalışır gracilis arter (C) açmaktadır. Gracilis arter kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak IVM için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Sinyal yoğunluğu kas mikrovasküler kan hacmi ve femur damarları kontrast-artırılmış Ultrasonografinin. Bir erkek fare üst hindlimb microbubbles sürekli infüzyon sırasında dijital görüntüleme platformu modunu görüntüleme doğrusal olmayan kontrast(a)görünümü. Doğru kapı aynası: iki ROIs MBV kas ve femur damarları temsil etmek için çizilir. Dahil adductor kas bölmenin yüzeysel parçasıdır sadece sinyal olarak yatırım Getirisi içinde derinliği ile yoğunluğu azalır. Sol kapı aynası: zaman-yoğunluğu eğrisi kas MBV yatırım Getirisi düşük. Dikey çizgiler microbubbles (MBD) imha yüksek enerji dalgaları ile temsil eder. Hemen MBD sonra kontrast temsilcisi microbubbles ile yavaş yavaş dolmaya başlayan görüntüleme düzlemde mevcuttur. Sonra 10-15 s, kontrast geliştirme zirvesine ulaştı. (B-D) Kararlı durum sinyal ulaşıldı sonra 2. 5 x 10⁹ kabarcıklar/mL infüzyon hızını iki katına (5, 10, 20 µL/dk). Sinyal şiddeti kas MBV (B) ve femur gemiler (C) difüzörü konsantrasyon dolaşımda iki katına paralellik. (D) düzeltme kas MBV femur damarları sinyal sinyal yoğunluğu farklı difüzörü konsantrasyonları tarafından neden değişkenliğin kaldırır için (N = 9; hata çubukları temsil eden standart sapma). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Gracilis arter intravital mikroskobu ölçümleri. (A)parafin yağı azaltır (olan parafin vs 17,9 µm olmadan 29.0 µm yağ uygulandıktan sonra) varyasyon gracilis arter farklı hayvanların ortalama temel çapı istikrarlı (73,6 µm 68.8 µm; vs tutarken p 0,58 =). (B) Arteryel çapları temel ve insülin veya salin infüzyon 60 dk sonra. 60 dk infüzyon sürekli gracilis arter büyümüş sonra insülin (p < 0.0001) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında. (C) insülin kaynaklı vazodilatasyon oluşur 10 dk infüzyon başladıktan sonra (p = 0,002) ve en yüksek seviyede 30 dk. hata çubukları temsil standart sapma; % 95'i ulaşır unpaired bir öğrenci T-testi istatistik için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Mikrovasküler kan hacmi kontrast-artırılmış Ultrasonografi, fare Hindlimb Adductor kas bölmesinin kullanarak ölçüleri. (A)insülin insülin infüzyonu başladıktan sonra MBV 30 dk tutarlı bir artış sonuçlandı. (B) hyperinsulinemic ve temel ölçü birimlerinin (MBV değiştir) arasındaki farkı ile insülin-aracılı mikrovasküler işe alım gösterilir. İnsülin indüklenen %33.5 (%31.04 ±, p 0.016; = N = 7) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında mikrovasküler işe alım (-10.63 ± %27.87, N = 6). Hata çubukları temsil eden standart sapma; unpaired bir öğrenci T-testi istatistik için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Biz aynı anda insülin'ın (IVM kullanarak) daha büyük arter ve (CEUS kullanarak) kas iskelet mikro vasküler eylemleri tahmin etmek için bir teknik geliştirdi. Başarılı ve güvenilir ölçümler için kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde açığa gracilis arter kanama olmadan; 2) arter banyo parafin yağı sızıntısını önleme; 3) infüzyon vazoaktif bileşikler (insülin) ve kontrast Aracısı (microbubbles) için patent Venöz erişim (kuyruk ven kanülü) sahip.

Mikrovasküler disfonksiyon kas çalışması obezite ve insülin direnci^14,25,39,40bağlamında dikkat kazanmaktadır. Obezite ve insülin direnci vasküler işlevi üzerinde olumsuz etki vasküler ağaç farklı düzeylerde kendini gösteriyor. Şu andan itibaren farklı yaklaşımlar bu değişiklikleri değerlendirmek gerekir. Aynı fare IVM ve CEUS teknikleri kombine kullanımı insülin'ın etkileri damarlara farklı düzeylerinde ölçmek için güçlü bir araç sağlar. IVM doğrudan görselleştirme ve kantitatif analiz direnç arter ve CEUS insülin kaynaklı değişimler kas perfüzyon değerlendirilmesi için olanak sağlar.

Adductor kas yuvası okuyan birçok avantajı vardır. Damar kolayca erişilebilir ve belgili tanımlık kesme yüzeysel doğası, deney tamamlandıktan sonra cilt kesi 5.0 absorbe steril dikiş ile kapatmak olanak verir. Hayvanlar subkutan buprenorfin ile deneyler sonra 0.1 mg/kg doz adlı bir analjezik olarak enjekte ve sıcak bir ortamda kurtarmak için izin verdi. Fareler yordamı çok iyi tolere ve hayvanlar kaybı olmaksızın ne de okudu 35'ten fazla hayvanlarda hindlimb adet enfeksiyondan yaşadık. Bu takip sağlar veya boyuna bir moda hayvanlarda eğitim. Bu deneylerde kullanılan hayvanlar ancak, 0,4 L/dak yine de bir anestezi maskesi akan oksijen ile dengeli inhale % 1,8 isoflurane kullanarak anestezi. Aksine İsoflurane anestezi^41,42, FMA anestezi periferik insülin duyarlılığı rahatsız etmez. Bir gelecek planı ne kadar iyi fareler FMA anesteziden kurtarmak incelemektir.

Adductor kas bölme de yerel arabuluculuk çeşitli vazoaktif bileşikler beri yararlıdır ve aşağı akım vasküler etkileri değerlendirilir. Örneğin, bu bileşiklerin topikal uygulama hedef dokulara superfusion teknikleri²⁸ veya cerrahi işleme ve uyuşturucu stentlerin kelepçeleri damarları⁴³çevreleyen implantasyonu kullanarak mümkün olabilir. Ayrıca, gracilis arter izole ve basınç myograph okudu. Bizim grup ve diğerleri Bu arter ex vivo^36,37,38. insülin ve diğer vazoaktif bileşikler etkilerini belgelemek için basınç myograph kullanarak önemli deneysel kanıtlar toplandı

Bir kullanım için doğal IVM tekniği kas cerrahi Fuar ve damarlara stabilize etmek için uygulama parafin yağı kısıtlamasıdır. Öyle olup olmadığını bu eylemleri yerel ortamını arter etkisi açık değildir. Ancak, şekil 3A parafin yağı içinde banyo gracilis arter temel çapını önemli ölçüde değişmez gösterir. Ayrıca mineral yağ doku hyperoxic koşulları⁴⁴korumak, Oksijen difüzyon başarıyla engeller gösterilmiştir. Ayrıca, petrol arterler temel çapı varyasyonu azaltmaya yardımcı olur. Bu yüzden biz parafin yağı kullanımı ve en az 30 dk için hazırlık dinlenme için savunucusu. Belirtmek gerekirse yağ – veya hiç yağ yerine tamponlu tuz kullanımı hiç – son derece değişken çapları ve daralma (veri gösterilmez) geminin sonuçlandı. Ayrıca, deneyler sonunda, biz parafin yağı - banyo gracilis arterler - izole ve onların reaktivite basınç myograph test ex vivo. Parafin yağı banyo damar benzer şekilde insülin ve asetilkolin (damar açıcı) ile uyardığında damar denetlemek için tepki gösterdi (veri gösterilmez). Tutarlı insülin kaynaklı vazodilatasyon açıkça bu çalışmada açıklanan IVM Protokolü güvenilir sonuçlar üretir gösterir.

Aynı fare her iki teknikleri uygulayarak avantajı bazı içsel sınırlamaları bir tekniği diğer tarafından üstesinden gelir: CEUS MBV rahatsız edilmeden kas içinde vivo içinde tahmin ediyor ama bireysel damarları değil görülebilir; MBV tahmin edemez de olsa IVM bireysel gemiler, görmek mümkün kılar. Bir gelecek planı IVM mikroskobu birlikte cremaster kas adductor kas kontralateral tarafında CEUS ile kullanmaktır. Bu değişiklik bir tahmin (CEUS kullanarak) MBV ve kılcal damarlar (IVM kullanarak) doğrudan bir optik erişim sağlayabilir. Protokol daha değiştirilebilir; kuyruk kanül için kullanılan 4 yönlü konnektör 5-yönlü bağlayıcıyı geçirilir. Bu, biz (2,9 noktasında açıklanmıştır) ikinci CEUS ölçüm yaparken anestezi tüp ayırma önleyebilirsiniz. Deneyim, fareler geçerli protokol iyi tolere. Bu iletişim kuralı için yapılan bir başka değişiklik kullanılan insülin kelepçe oranıdır. Biz supra fizyolojik olarak kabul edilir 7.5 mU/kg/dak kelepçe oranı kullanılır. Bağlı olarak çalışma,-ebilmek var olmak kullanılmış bir daha düşük insülin kelepçe oranı (örneğin 3 mU/kg/dak).

Açıklanan protokol güvenilir bulduk, dikkat edilmesi gereken belirli sınırlamalar vardır. Bazı durumlarda Arteryel çap ölçümü en uygun olduğunda. Hazırlık adımları çalıştırma modeli ile biraz tecrübe gerektirir. Bu gemi rahatsız ile yeni yağ ilave ve Arter dinlensin başka bir 30 dk için gerekli olduğunun çapı değiştirme parafin yağı gemi ortamından kaçak değil ki çok önemlidir. Buna ek olarak, parafin yağı yüzeyinde ışığın (protokol 1.14. adımında açıklandığı) yansıması bazen çok parlak, arter görüntülemek zorlaştırır. Bu ışık bir açıyla parafin yağı yüzey ve Arter paralel düşer böylece ışık kaynağının yönlendirerek yokedilebileceğini.

Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan IVM ve CEUS tekniklerin birleşimi, insülin damarlara farklı seviyelerde farklı etkileri ölçmek olanak verir. IVM gracilis arter CEUS kullanarak ölçülen aşağı akım mikrovasküler perfüzyon katkıda ters yönde vasküler değişiklikler görmemizi sağlar. Biz aynı fare daha iyi birkaç deneysel tekniklerin birleşimi değerlendirmek vasküler işlevi savunucusu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mice	Charles river		Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system	VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer	VisualSonics inc.
Vevo 2100 software	VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009	Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex	VWR international	58815-234
Heating pad	Pantlab
Freestyle Precision Xceed	Abbott		To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid	Novo Nordisk
Glucose monohydrate	Merck Millipore	1083421000
Buffered saline solution	B. Braun	152118062
PE-20 medical tubing	Becton, Dickinson and Company	427405
Needle, 27 Gauge	Becton-Dickinson & Co	305109
Medical tape	3M
Ultrasound probe holder			Built In-house
Cotton swabs			Multiple Equivalent
Creme depilator			Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive	Derma+flex	GA30005-2222
Infusion pump	Harvard Apparatus	Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors	Fine Science Tools (FST)	14090-09
Needle holder	Fine Science Tools (FST)	12500-12
Straight forceps with fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-20
Stereomicroscope	Olympus	SZX12
Camera	Basler	scA1390-17gc
Image Grabber program	Built in-house		Image acquisition system
Timer	VWR	33501-418
Syringes, 1 mL	Fisher	14-817-25
Light source, fiber-optic	Schott	KL1500	Ideally has adjustable arms
Paraffin oil			Multiple Equivalent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850365C
polyoxyethylene stearate	Sigma	p3440
perfluorobutane gas	F2 Chemicals	C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath	Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515370-0810
Multisizer Coulter Counter	Beckman Coulter Inc