טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות.

Abstract

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introduction

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocol

1. הכינו פתרונות עבור NGT-3D ו NGB-3D

1. הכן את הפתרונות סטרילי הבאים: 1 ליטר של 0.1454 פתרון M NaCl, 1 ליטר של 1 M CaCl _2, 1 ליטר של 1 M MgSO _4, מרק Lysogeny (LB), 1 ליטר של 1 M KPO ₄ חיץ (108.3 גרם של KH _{2 4} PO ו 35.6 גרם של K ₂ HPO _4, ולמלא H ₂ O ל L 1). הפקה של NGM באמצעות פתרונות אלה ניתן למצוא בפרוטוקול קודם ^10.
2. פתרונות חיטוי ב 121 ° C, 15 דקות.
3. הכן 50 מ"ל של פתרון 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול סטרילי. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב 0.25 גרם של כולסטרול ו -50 מ"ל של אתנול 99.99% ומערבבים היטב. אל חיטוי. לעקר את הפתרון כולסטרול באמצעות מזרק 50 מ"ל עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. זה יהיה גם להסיר כל כולסטרול שלא נמס.
4. (אופציונלי) הכן 10 מ"ל של 150 מ"מ של 2'-deoxy-5-fluorouridine המניות (FUDR). בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לערבב 0.3693 גרםשל FUDR ו -10 מ"ל מים מזוקקים. נער היטב.

2. כן תרבות חיידקים עבור NGT-3D ו NGB-3D

1. לחסן 10 מ"ל מרק LB עם חיידקים. החיידקים הסטנדרטיים המשמשים עבור אלגנס האכלה הוא OP50 זן החיידק.
2. תרבות חיסון החיידקים על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת הלילה.
3. לקראת דילול סדרתי, aliquot 9 מ"ל של פתרון NaCl לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל סטרילי. לדוגמה, aliquot 9 מ"ל לתוך סך של 7 צינורות לבצע דילול 10 ^-7 של E. coli זן OP50.
4. בעזרת פיפטה 1,000 μl סטרילי, pipet 1 מ"ל של תרבית החיידקים או התרבות חיידקים בדילול לתוך הצינור החדש סטרילי עם 9 מ"ל של תמיסת NaCl ו מערבולת את התערובת 10 מ"ל היטב. חזור על הפעולה עד דילול חיידקי הרצוי הוא הגיע.
   ההערה: דילול החיידקים הרצוי תלוי בסוג והמצב של חיידקים, כמו גם את תנאי ניסוי המדויקים.לדוגמה, 10 ^-6 - 10 ^-8 דילול של זן OP50 E. coli היה מספיק כדי להפיק מן 1 - 200 מושבות חיידקים לכל 6.5 מ"ל צינור NGT-3D. תולעים שפותחו באופן מהימן ומתרבים בדרך כלל כאשר מספר מושבות היה מעל גיל 60, שאירע בשעת דילול של 10 ^-6 - 10 ^-7. לקבלת NGB-3D, השתמש דילול של 10 ^-8.

3. ביצוע NGT-3D ו NGB-3D (200 מ"ל)

1. לאחר הכנת תרבית החיידקים, לערבב 0.6 גרם NaCl, 1 גרם אגר מגורען, ו -0.5 גרם peptone בבקבוק 500 מ"ל. הכנס בר ומערבבים מגנטיים לתוך הבקבוק.
2. להוסיף 195 מ"ל מים מזוקקים לכסות את הפה של הבקבוק עם רדיד אלומיניום.
3. C חיטוי 121 מעלות במשך 15 דקות.
4. מניחים את הבקבוק autoclaved חם על צלחת ומערבבים, ומערבבים במהירות בינונית במשך שעה לפחות 2. מצננים את הבקבוק עד 40 ° C. הקפד לקרר מספיק כממשיך מכאן בטמפרטורות גבוהות עלול להוביל ערפול של אגר המוגמר.עם זאת, בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום התקשות המוקדמת של אגר.
   1. (אופציונלי) כדי להאיץ את תהליך הקירור, הנח את הבקבוק בתוך 15 דקות באמבט מים 40 ° C לפני הצבת בצלחת ומערבבים.
5. כאשר הטמפרטורה של התקשורת אגר מגיע 40 ° C, להוסיף 200 μl 1 M CaCl _2, 200 μl של 5 מ"ג / פתרון כולסטרול מ"ל, 200 μl 1 M MgSO ₄ ו -5 מ"ל 1 M KPO ₄ חיץ כפתרון ממשיכה לעורר לריכוזים סופי של 1 ₂ מ"מ CaCl, 5 כולסטרול מיקרוגרם / מ"ל, 1 מ"מ ₄ MgSO, 1 מ"מ KPO _4.
   1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים NGT-3D להוסיף 80 μl של 150 מ"מ FUDR לריכוז סופי של 120 מיקרומטר ^12.
6. הוסף 6 מ"ל של 10 מ"ל מדולל תרבית החיידקים משלב 2.4 לתוך הבקבוק ישירות.
   1. (אופציונלי) עבור NGT-3D, להסיר 6 מ"ל של התקשורת אגר לפני שלב 3.6 ו לשמור אותו חם בנפרד. מדיה זה ישמש את החיידקים ללאשכבה עליונה.
7. בעזרת הליכים סטרילי, לוותר התקשורת לתוך תא תרבות סטרילי. ודא שהמכסה של החדר נסגרת בחוזקה.
   1. (אופציונאלי) כדי למנוע מושבות חיידקים מ טביעה על פני השטח העליונים של אגר, ליצור שכבה של תקשורת אגרה חיידקים ללא משלב 3.6.1 בחלק העליון בפני התקשורת משלב 3.7 מתקשה לחלוטין. פעולה זו תיצור אזור חיידקים ללא בחלק העליון של NGT-3D.
   2. לקבלת NGT-3D, יוצקים 6.5 מ"ל התקשורת לתוך מבחנות פלסטיק 8 מ"ל ברור ליצור שכבה אגר חיידקים, ובזהירות לוותר 200 μl של התקשורת חיידקים חינם על גבי מדיה 3D קשוח למחצה לעשות bacteria- דק שכבה חינם על העליונה.
   3. לקבלת NGB-3D, יוצקים 65 מ"ל של המדיה לתוך בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ ² פלסטיק שקוף. סכום זה צריך למלא את הגוף של בקבוק תרבות 25 ס"מ ² תאים.
8. השאר תאים אנכיים בטמפרטורת חדר למשך שבוע כדי לאפשר מושבות חיידקים לגדוללגודל ניכר מ"מ קוטר 1 לפחות.
   1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים ב NGT-3D, תאי מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה לאור FUDR.

4. כושר מדוד אוכלוסין תולעת על NGT-3D (Assay גודל יחסית Brood)

1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לקטוף העברה בצלחת NGM חיידקים חינם. אפשר תולעת לנוע בחופשיות במשך כמה דקות כדי להסיר חיידקים מחוברים לגוף שלה.
2. חזור על שלב 4.1 וודא כי התולעת היא ללא חיידקים. באופן כללי, ולשני שידורים חוזרים של 4.1 הם מספיק.
3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על פני השטח של תקשורת 3D במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, אבל מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
5. דגירה של 96 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.
6. לאחר 4 ימים, לסגור את העפעפיים בחוזקה והמקוםNGT-3D תא תרבות לתוך אמבט מים 88 ° C כדי להמיס את אגר. החום הורג תולעים אך גופם נותרו על כנן.
   הערה: שימוש 8 מ"ל צינורות עבור NGT-3D, 20 - 30 הדגירה דקות בדרך כלל מספיק.
7. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את התקשורת מומסת על צלחת פטרי פלסטיק 9 ס"מ. טפטפות פלסטיק לא מומלצות, כמו תולעים לעתים קרובות יכולים להידבק אליהם.
8. באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור, לספור את מספר תולעים בבית L3, L4, ושלבי מבוגר. אל תסמכו תולעים כי הם בשלב L2 וצעיר, במרוצת הדורות F1 ו- F2 יכול להתבלבל כאן. לפיכך, assay זה הוא assay גודל להרהר ביחס ולא assay גודל גוזל הכולל.

תמונה 5. והתנהגות תולעת שיא על NGB-3D

1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לאסוף ולהסיר כל חיידקים תקועים אל פני השטח על ידי העברה לצלחת חיידקים ללא NGM ומאפשר לו לנוע בחופשיות במשך כמה דקות.
2. חזור על שלב 5.1 לוודא ווrm הוא ללא חיידקים.
3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על גבי במרכז השטח אגר של NGB-3D ליד הצוואר של הבקבוק במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, תוך מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
5. תמונה או להקליט את התולעת תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור. התאם את המיקוד כתולעת עוברת דרך מטריקס 3D.

תוצאות

בניית NGT-3D היא פרוטוקול פשוט וברור שתוצאתה הוא מבחנה המלאה אגרה עם מושבות חיידקים קטנות במרווחים לאורך (איור 1 א) אגר. תולעים יכולים לנוע בחופשיות דרך מטריקס אגר, מציאה וממצים את מושבות חיידקים. כדי לברר האם אלגנס יכולים להתרבות ולגדול ב...

Discussion

טיפוח המעבדה של C. elegans באמצעות צלחות תקשורת צמיחת נמטודות הקלסיות היה חיוני למאות תגליות חשובות כי המחקר ב C. elegans ספקה. כאן, אנו מציגים שיטות חדשות לטפח סי אלגנס בסביבה בצורה מדויקת יותר משקפת גידול תלת מימדי הטבעי שלהם. למרות שיטות אחרות שימשו להתבונן

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000