cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em três dimensões em Laboratório

Resumo

Nós apresentamos um método simples para a construção de sistemas de cultivo nematóide 3D chamado NGT-3D e NGB-3D. Estas podem ser usadas para estudar a aptidão nematóide e comportamentos em habitats que são mais semelhantes aos naturais Caenorhabditis elegans habitats do que as placas padrão 2D cultura elegans laboratório C..

Resumo

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introdução

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocolo

1. Prepare Soluções para NGT-3D e NGB-3D

1. Preparar as seguintes soluções esterilizadas: 1 L de solução de NaCl a 0,1454 M, 1 L de 1 M de _CaCl2, 1 L de 1 M de _MgSO4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 H KPO tampão ₄ (108,3 g de KH ₂ PO ₄ e 35,6 g de K ₂ HPO _4, e preencher _H2O a 1 L). Produção de NGM usando essas soluções podem ser encontradas em um protocolo anterior ^10.
2. soluções autoclave a 121 ° C, 15 min.
3. Preparar 50 ml de uma solução estéril a 5 mg / ml de colesterol. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 0,25 g de colesterol e 50 ml de 99,99% de etanol e misture bem. Não autoclave. Esterilizar a solução colesterol utilizando uma seringa de 50 ml com um filtro de seringa de 0,45 um. Isso também irá remover qualquer colesterol não dissolvido.
4. (Opcional) Preparar 10 ml de uma 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina estoque (FUdR). Em um tubo cónico de 15 ml, 0,3693 g misturarde FUdR e 10 ml de água destilada. Agite bem.

2. Prepare Cultura das bactérias para NGT-3D e NGB-3D

1. Inocular 10 ml de caldo LB com bactérias. As bactérias comuns usados para a C. elegans alimentação é a estirpe de E. coli OP50.
2. Cultura a inoculação bacteriana a 37 ° C num incubador com agitação durante a noite.
3. Na preparação para uma diluição em série, alíquotas de 9 ml da solução de NaCl em 15 ml estéreis tubos cónicos. Por exemplo, alíquotas de 9 ml em um total de 7 tubos para obter uma diluição de 10 ^-7 estirpe de E. coli OP50.
4. Utilizando uma pipeta estéril de 1.000 ul, pipeta de 1 ml da cultura bacteriana ou cultura bacteriana diluída para o novo tubo estéril com 9 ml de solução de NaCl e agitar com vortex a mistura de 10 ml bem. Repita até a diluição bacteriana desejada é atingida.
   NOTA: A diluição bacteriana desejada depende do tipo e condição de bactérias, bem como as condições experimentais exactos.Por exemplo, um 10 ^-6 - diluição da estirpe de E. coli OP50 10 ^-8 era suficiente para produzir a partir de 1 - 200 colónias bacterianas por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms desenvolvido e reproduzidos normalmente quando o número de colónias foi superior a 60, o que ocorreu a uma diluição de 10 ^-6 fiavelmente - 10 ^-7. Para NGB-3D, usar uma diluição de 10 ^-8.

3. Fazer NGT-3D e NGB-3D (200 ml)

1. Depois de preparar a cultura bacteriana, misturar 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, e 0,5 g de peptona, em um balão de 500 ml. Inserir uma barra de agitação magnética para o balão.
2. Adicione 195 ml de água destilada e cobrir a boca do balão com folha de alumínio.
3. Autoclave de 121 ° C durante 15 min.
4. Colocar o balão autoclavada quente sobre uma placa de agitação, e agitar a uma velocidade moderada durante pelo menos 2 h. Arrefece-se o balão a 40 ° C. Certifique-se de arrefecer o suficiente como continuar a partir daqui a altas temperaturas pode levar a opacificação do agar acabado.No entanto, as temperaturas mais baixas podem resultar no endurecimento prematuro do agar.
   1. (Opcional) Para acelerar o processo de resfriamento, colocar o balão em um 40 ° C banho de água 15 min antes de colocar em uma placa de agitação.
5. Quando a temperatura do meio de ágar atinge 40 ° C, adicionar 200 ul de 1 M de _CaCl2, a 200 ul de 5 mg de solução de colesterol / ml, 200 ul de 1 M de MgSO ₄ e 5 ml de 1 M de KPO tampão _4, tal como a solução continua a agitar para concentrações finais de 1 mM de _CaCl2, 5 ug / ml de colesterol, MgSO ₄ 1 mM, _KPO4 1 mM.
   1. (Opcional) Para o ensaio do tempo de vida NGT-3D adicionar 80 ul de FUdR a 150 mM para uma concentração final de 120 pM ^12.
6. Adicionar 6 ml de 10 ml de cultura bacteriana diluído do passo 2.4 para dentro do frasco directamente.
   1. (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de ágar antes do passo 3.6 e mantê-lo aquecido separadamente. Este suporte vai ser utilizado para os livre de bactériascamada superior.
7. Usando procedimentos de esterilização, dispensar a mídia em uma câmara de cultura estéril. Verifique se a tampa da câmara fecha hermeticamente.
   1. (Opcional) Para evitar a formação de colónias de bactérias na superfície superior do ágar, fazer uma camada de meio de ágar livre de bactérias a partir do passo 3.6.1 em cima antes que o material a partir do passo 3.7 endurece completamente. Isto irá criar uma zona livre de bactérias no topo da NGT-3D.
   2. Para NGT-3D, despeje 6,5 ml de meio em 8 ml tubos de ensaio de plástico claras para fazer uma camada de agar de bactérias, e dispensar cuidadosamente 200 ul de meios de comunicação sem bactérias na parte superior do meio de cultura semi-endurecido 3D para fazer uma fina bacteria- camada livre no topo.
   3. Para NGB-3D, despeje 65 ml de mídia na 25 centímetros garrafa de cultura celular ² clara de plástico. Esta quantidade deve encher o corpo da garrafa de 25 centímetros de cultura ² de células.
8. Deixar câmaras verticalmente à temperatura ambiente durante uma semana para permitir que as colónias bacterianas a crescerpara um tamanho considerável de pelo menos 1 mm de diâmetro.
   1. (Opcional) Para o ensaio vida na NGT-3D, câmaras cubra com papel alumínio para evitar a degradação luz do FUdR.

4. Medida da aptidão da População Sem-fim na NGT-3D (Brood Relativa Tamanho Assay)

1. Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina pegar e transferência em uma placa NGM sem bactérias. Permitir worm para mover-se livremente ao redor por alguns minutos para remover bactérias aderidas ao corpo.
2. Repita o passo 4.1 e certificar-se de que o worm é livre de bactérias. Geralmente, duas repetições de 4.1 são suficientes.
3. Com cuidado, coloque o worm limpo na superfície da mídia 3D com uma picareta fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
4. Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, mas impedindo a secagem do ágar.
5. Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
6. Após 4 dias, a fechar as tampas hermeticamente e colocar ocâmara de cultura NGT-3D em um banho de água a 88 ° C para fundir o ágar. O calor mata vermes, mas seus corpos permanecem intactos.
   NOTA: Usando 8 ml tubos para NGT-3D, 20 - 30 minutos de incubação é geralmente suficiente.
7. Usando uma pipeta de vidro, transferir os meios derretido sobre de 9 cm de prato de petri de plástico. pipetas de plástico não são aconselhados, como vermes pode muitas vezes ficar com eles.
8. Usando um microscópio de dissecação transmissão estéreo, contar o número de vermes no L3, L4, e estágios adultos. Não conte vermes que estão fase L2 e mais jovens, como as gerações F1 e F2 podem ser confundidos aqui. Assim, este ensaio é um ensaio tamanho da ninhada em relação ao invés de um ensaio total de tamanho da ninhada.

5. Imagem e registrar o comportamento Worm na NGB-3D

1. Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina escolher e remover qualquer bactéria coladas à superfície através da transferência a uma placa NGM sem bactérias e permitindo-lhe mover-se livremente para alguns min.
2. Repita o passo 5.1 para garantir que o worm é livre de bactérias.
3. Cuidadosamente colocar o verme limpo para o centro da superfície de agar do NGB-3D perto do gargalo da garrafa com uma escolha de fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
4. Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, evitando a secagem do ágar.
5. Imagem ou gravar o worm sob um microscópio de dissecação transmissão estéreo. Ajuste o foco como o worm se move através da matriz 3D.

Resultados

A construção de NGT-3D é um protocolo simples e directo que resulta em um tubo de ensaio de agar-enchido com pequenas colónias bacterianas espaçadas ao longo do ágar (Figura 1A). Worms pode circular livremente através da matriz de agar, encontrar e consumir as colónias de bactérias. Para confirmar se o C. elegans podem se reproduzir e crescer normalmente na NGT-3D, comparou fertilidade e desenvolvimento larval em 3D com placas padrão 2D NGM. No ensaio ...

Discussão

O cultivo laboratorial de C. elegans utilizando as placas de meio de crescimento nematóide clássicos foi crucial para as centenas de descobertas importantes que a pesquisa em C. elegans tem prestado. Aqui, nós apresentamos novos métodos de cultivar C. elegans em um ambiente que reflete com mais precisão seus habitats tridimensionais naturais. Embora outros métodos têm sido utilizados para observar C. elegans em 3D ^13, este é o primeiro protocolo que permite a cultur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000