Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

Резюме

Мы представляем простой метод для построения 3D-систем культивирования нематод под названием NGT-3D и NGB-3D. Они могут быть использованы для изучения нематод пригодности и поведения в местах обитания, которые более похожи на натуральные Caenorhabditis Элеганс места обитания , чем стандартные 2D - лаборатория C. Элеганс культуры пластин.

Аннотация

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Введение

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

протокол

1. Подготовка решения для NGT-3D и NGB-3D

1. Подготовьте следующие стерильные растворы: 1 л раствора 0,1454 М NaCl, 1 л 1 М CaCl _2, 1 л 1 М MgSO _4, лизогении Бульон (LB), 1 л 1 М KPO ₄ буфера (108,3 г KH ₂ PO ₄ и 35,6 г K ₂ HPO _4, и заполняют H ₂ O до 1 л). Производство NGM с помощью этих решений можно найти в предыдущем протоколе ^10.
2. Автоклавы растворы при температуре 121 ° С, 15 мин.
3. Приготовьте 50 мл стерильного 5 мг / мл раствора холестерина. В коническую пробирку емкостью 50 мл, смешивают 0,25 г холестерина и 50 мл 99,99% этанола и хорошо перемешать. Не автоклав. Стерилизацию раствора холестерина с использованием 50 мл шприц с шприцевой фильтр 0,45 мкм. Это также приведет к удалению любого нерастворенного холестерина.
4. (Необязательно) Подготовьте 10 мл 150 мМ 2'-дезокси-5-фторуридиновые (FudR) акций. В конической трубе 15 мл, смешать 0.3693 гФУДР и 10 мл дистиллированной воды. Встряхнуть хорошо.

2. Подготовка культуре бактерий для NGT-3D и NGB-3D

1. Привить 10 мл LB бульона с бактериями. Стандартные бактерии , используемые для кормления C. Элеганс является штамм E.coli OP50.
2. Культура бактериальная инокуляция при 37 ° C в инкубаторном шейкере в течение ночи.
3. При подготовке к последовательным разбавлением, аликвотные 9 мл раствора NaCl в стерильные 15 мл конические пробирки. Например, аликвоту 9 мл в общей сложности 7 трубок , чтобы сделать 10 ^-7 разведения штамма OP50 E.coli.
4. С помощью стерильной 1000 мкл пипетку, пипеткой 1 мл бактериальной культуры или разбавленный бактериальной культуры в стерильную новую пробирку с 9 мл раствора NaCl и вихревые смесь по 10 мл хорошо. Повторите, пока желаемый бактериальный разбавление не будет достигнута.
   Примечание: Заданная бактериальной разбавление зависит от типа и состояния бактерий, а также точных условий эксперимента.Например, 10 ^-6 - 10 ^-8 разбавление штамма OP50 кишечной палочки было достаточным для получения от 1 - 200 бактериальных колоний на 6,5 мл НЗТ-3D трубки. Черви надежно разработаны и воспроизводится нормально , если количество колоний было старше 60 лет , которые произошли в разведении 10 ^-6 - 10 ^-7. Для NGB-3D, используйте разбавление 10 ^-8.

3. Создание NGT-3D и NGB-3D (200 мл)

1. После приготовления бактериальной культуры, смесь 0,6 г NaCl, 1 г гранулированного агара и 0,5 г пептона в 500 мл колбе. Вставьте магнитной мешалкой в ​​колбу.
2. Добавить 195 мл дистиллированной воды и покрывают горлышко колбы с алюминиевой фольгой.
3. Автоклавы 121 ° С в течение 15 мин.
4. Горячую автоклавного колбы на мешалке, и перемешивают при умеренной скорости в течение по крайней мере 2 часов. Охлаждают колбу до 40 ° С. Обязательно остыла как продолжение здесь при высоких температурах может привести к помутнению готового агара.Тем не менее, более низкие температуры могут привести к преждевременному отвердевания агар.
   1. (Необязательно) Чтобы ускорить процесс охлаждения, колбу помещают в 40 ° С на водяной бане 15 мин перед помещением на мешалке.
5. Когда температура агаровой среде достигает 40 ° С, добавляют 200 мкл 1 М CaCl _2, 200 мкл 5 мг / мл раствора холестерина, 200 мкл 1 М MgSO ₄ и 5 мл 1 М KPO ₄ буфера , как раствор продолжает перемешивать до конечной концентрации 1 мМ CaCl _2, 5 мкг / мл холестерина, 1 мМ MgSO _4, 1 мМ KPO _4.
   1. (Необязательно) Для НЗТ-3D анализа продолжительности жизни добавляют 80 мкл 150 мМ FUdR до конечной концентрации 120 мкМ ^12.
6. Добавить 6 мл 10 мл разбавленных бактериальной культуры, полученной на стадии 2.4, в колбу непосредственно.
   1. (Необязательно) Для NGT-3D, снимите 6 мл агара сред перед стадией 3.6 и держать его теплым отдельно. Этот носитель будет использоваться для бактерий, свободныхверхний слой.
7. Использование стерильных процедур выдачи носителя в стерильной культуральной камере. Убедитесь, что крышка камеры закрывается плотно.
   1. (Необязательно) Чтобы предотвратить бактериальные колонии от формирования на верхней поверхности агара, чтобы слой без бактерий агаре с этапа 3.6.1 на верхней перед СМИ со стадии 3.7 полностью затвердевает. Это создаст зону без бактерий в верхней части NGT-3D.
   2. Для NGT-3D, залить 6,5 мл носителя в 8 мл из прозрачного пластика пробирки, чтобы сделать слой бактерий агар, и тщательно дозировать 200 мкл бактерий свободные средства массовой информации на вершине полузависимыми закаленной 3D средах, чтобы сделать тонкую bacteria- свободный слой сверху.
   3. Для NGB-3D, залить 65 мл носителя в 25 см ² ясно пластиковой бутылки клеточной культуры. Эта сумма должна заполнить тело бутылки культуры ² клетки 25 см.
8. Оставьте камеры по вертикали при комнатной температуре в течение одной недели, чтобы позволить колонии бактерий растидо значительных размеров диаметром не менее 1 мм.
   1. (Необязательно) Для анализа продолжительности жизни в NGT-3D, крышка камеры с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить легкую деградацию ФУДР.

4. Мера Фитнес червячных населения на NGT-3D (Относительная Brood Размер пробирной)

1. Выберите каскад червя L4 при помощи платиновой проволоки выбрать и передачи на бактерии свободной NGM пластины. Разрешить червь свободно передвигаться в течение нескольких минут, чтобы удалить бактерии, прикрепленные к его телу.
2. Повторите шаг 4.1 и убедитесь, что червь свободен от бактерий. Как правило, два повторы 4.1 достаточно.
3. Аккуратно положите чистую червяка на поверхности 3D-среды с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
4. Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, но предотвращая высыхание агаре.
5. Инкубировать в течение 96 часов при температуре 20 ° С.
6. Через 4 дня, закройте крышки плотно и местоNGT-3D культуры камера в C водяной бане в 88 °, чтобы расплавить агар. Жара убивает червей, но их тела остаются нетронутыми.
   Примечание: Используя 8 мл пробирки для NGT-3D, 20 - 30 мин инкубации обычно достаточно.
7. С помощью стеклянной пипетки, передавать Расплавленный носитель на 9 см пластиковую чашку Петри. Пластиковые пипетки не рекомендуется, так как черви могут часто прилипают к ним.
8. Использование стерео передачи рассекает микроскопом, подсчитать количество червей на L3, L4 и взрослых этапах. Не рассчитывайте червей, которые являются этапом L2 и моложе, как можно спутать здесь поколений F1 и F2. Таким образом, этот анализ является относительным анализ размера выводка, а не общий анализ размера выводка.

5. Изображение и запись Worm Поведение на NGB-3D

1. Выберите каскад червя L4 с использованием платиновой проволоки выбрать и удалить любые бактерии, попавшие на поверхность путем переноса на бактерии свободной NGM пластины и позволяет ему свободно двигаться в течение нескольких минут.
2. Повторите шаг 5.1, чтобы убедиться, шогт свободна от бактерий.
3. Осторожно поместите чистый червяка на центр агаровой поверхности NGB-3D вблизи горлышка бутылки с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
4. Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, предотвращая высыхание агаре.
5. Изображение или запись червя под стерео передачи рассекает микроскопом. Отрегулируйте фокус, как червь движется через 3D-матрицу.

Результаты

Конструкция NGT-3D является простой и прямой протокол , который приводит к агаровой заполненной пробирки с небольшими бактериальных колоний , разнесенных по всей агар (Рис . 1А) Черви могут свободно перемещаться по агара матрице, находя и отнимает много ...

Обсуждение

Лаборатория выращивания C. Элеганс с использованием классических медиа пластин роста нематода имеет решающее значение для сотен важных открытий , что исследования в C. Элеганс предоставил. Здесь мы представляем новые методы для выращивания C. Элеганс в среде , которая бол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000