la culture de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En trois dimensions dans le laboratoire

Résumé

Nous présentons une méthode simple pour construire 3D systèmes de culture de nématodes appelés NGT-3D et NGB-3D. Ceux - ci peuvent être utilisées pour étudier le nématode fitness et des comportements dans des habitats qui sont plus semblables à Caenorhabditis elegans naturelles habitats que les laboratoires C. plaques de culture elegans 2D standard.

Résumé

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introduction

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocole

1. Préparer des solutions pour NGT-3D et NGB-3D

1. Préparer les solutions stériles suivantes: 1 L de solution 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl _2, 1 L de 1 M MgSO _4, Lysogénie Broth (LB), 1 L de 1 M KPO ₄ tampon (108,3 g de KH ₂ PO ₄ et 35,6 g de K ₂ HPO ₄ et H ₂ O compléter à 1 L). Production de NGM utilisant ces solutions peuvent être trouvées dans un précédent protocole ^10.
2. Solutions autoclave à 121 ° C, 15 min.
3. Préparer 50 ml d'une / ml de solution stérile, 5 mg de cholestérol. Dans un tube conique de 50 ml, mélanger 0,25 g de cholestérol et de 50 ml de 99,99% d'éthanol et bien mélanger. Ne pas autoclaver. Stériliser la solution de cholestérol à l'aide d'une seringue de 50 ml avec un filtre à seringue de 0,45 um. Cela permettra également de supprimer tout le cholestérol non dissous.
4. (Facultatif) Préparer 10 ml d'une 150 mM de 2'-désoxy-5-fluorouridine (FUdR) stock. Dans un tube conique de 15 ml, mélanger 0,3693 gde FUdR et 10 ml d'eau distillée. Bien agiter.

2. Préparer les bactéries de la culture pour NGT-3D et NGB-3D

1. Inoculer 10 ml LB bouillon avec des bactéries. Les bactéries standards utilisés pour C. elegans alimentation est la souche E. coli OP50.
2. La culture d'inoculation bactérienne à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant une nuit.
3. Dans la préparation d'une dilution en série, aliquotes de 9 ml de la solution de NaCl dans 15 ml tubes coniques stériles. Par exemple, aliquote 9 ml dans un total de 7 tubes pour obtenir une dilution de la souche 10 ^-7 OP50 E. coli.
4. À l'aide d'une pipette stérile 1000 ul, pipette 1 ml de la culture bactérienne ou d'une culture bactérienne diluée dans le nouveau tube stérile avec 9 ml de solution de NaCl et bien vortexer le mélange de 10 ml. Répétez jusqu'à ce que la dilution bactérienne désirée soit atteinte.
   REMARQUE: La dilution bactérienne souhaitée dépend du type et de l'état des bactéries, ainsi que les conditions expérimentales précises.Par exemple, un 10 ^-6 - 10 ^-8 dilution de la souche OP50 de E. coli a été suffisante pour produire à partir de 1 - 200 colonies bactériennes par 6,5 ml Tube NGT-3D. Worms fiable développé et reproduit normalement lorsque le nombre de colonies était de plus de 60, qui a eu lieu à une dilution de 10 ^{-6 à 10 -7.} Pour NGB-3D, utiliser une dilution de 10 ^-8.

3. Faire NGT-3D et NGB-3D (200 ml)

1. Après la préparation de la culture bactérienne, mélanger 0,6 g de NaCl, 1 g de granulé de la gélose et la peptone 0,5 g dans un flacon de 500 ml. Insérez une barre d'agitation magnétique dans le ballon.
2. Ajouter 195 ml d'eau distillée et couvrir la bouche de la fiole avec une feuille d'aluminium.
3. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
4. Placer le ballon autoclavé chaud sur une plaque d'agitation, et agiter à une vitesse modérée pendant au moins 2 h. Refroidir le ballon à 40 ° C. Assurez-vous de refroidir suffisamment en continuant d'ici à des températures élevées peut conduire à opacification de l'agar fini.Cependant, des températures plus basses peuvent conduire à un durcissement prématuré de la gélose.
   1. (Facultatif) Pour accélérer le processus de refroidissement, placer le ballon dans un 40 ° C bain d'eau 15 min avant de le placer sur une plaque d'agitation.
5. Lorsque la température du milieu gélose atteint 40 ° C, ajouter 200 pi de 1 M _CaCl2, 200 ul de 5 mg / ml de solution de cholestérol, 200 pi de 1 M _MgSÛ4 et 5 ml de 1 M KPO ₄ tampon que la solution continue d'agiter à des concentrations finales de 1 mM de _CaCl2, 5 ug / ml de cholestérol, 1 mM de MgSO _4, 1 mM KPO _4.
   1. (Facultatif) Pour l' essai de durée de vie NGT-3D ajouter 80 ul de mM FUdR 150 à une concentration finale de 120 uM ^12.
6. Ajouter 6 ml des 10 ml de culture bactérienne diluée à l'étape 2.4 dans le ballon directement.
   1. (Facultatif) Pour NGT-3D, retirez 6 ml de milieu agar avant l'étape 3.6 et le garder au chaud séparément. Ce média sera utilisé pour les bactéries librescouche supérieure.
7. En utilisant des procédures stériles, distribuer les médias dans une chambre de culture stérile. Assurez-vous que le couvercle de la chambre se ferme hermétiquement.
   1. (Facultatif) Pour éviter des colonies bactériennes de se former à la surface supérieure de la gélose, faire une couche de bactéries libres-média agar de l'étape 3.6.1 sur le dessus avant que les médias de l'étape 3.7 durcit complètement. Cela va créer une zone exempte de bactéries dans le haut de la NGT-3D.
   2. Pour NGT-3D, versez 6,5 ml de milieu dans les 8 ml claires tubes à essai en plastique pour faire une couche de gélose bactéries, et distribuer soigneusement 200 pi des médias exempt de bactéries sur le dessus du support semi-durci 3D pour faire une aux bactéries mince couche libre sur le dessus.
   3. Pour NGB-3D, versez 65 ml de milieu dans les 25 cm ² plastique transparent flacon de culture cellulaire. Ce montant doit remplir le corps de la 25 cm ² de culture cellulaire bouteille.
8. Laissez chambres verticalement à la température ambiante pendant une semaine pour permettre des colonies bactériennes de croîtred'une taille considérable d'au moins 1 mm de diamètre.
   1. (Facultatif) Pour l'essai de durée de vie dans NGT-3D, les chambres de couverture avec une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation de la lumière de FUdR.

4. Mesurer Fitness de la population de Ver sur NGT-3D (Brood relative Taille Assay)

1. Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et transfert sur une plaque NGM exempt de bactéries. Laisser un ver de se déplacer librement autour pendant quelques minutes pour éliminer les bactéries attachées à son corps.
2. Répétez l'étape 4.1 et assurez-vous que le ver est exempt de bactéries. En règle générale, deux répétitions de 4,1 suffisent.
3. Placez délicatement le ver propre sur la surface du support 3D avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
4. Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, mais empêchant le séchage du milieu agar.
5. Incuber pendant 96 heures à 20 ° C.
6. Après 4 jours, fermez le couvercle hermétiquement et placer lechambre de culture NGT-3D dans un bain d'eau C 88 ° pour faire fondre l'agar-agar. La chaleur tue les vers mais leurs corps restent intacts.
   NOTE: L'utilisation de 8 ml tubes pour NGT-3D, 20 - 30 minutes d'incubation est généralement suffisant.
7. En utilisant une pipette en verre, transférer les médias fondus sur un plat en plastique de Pétri de 9 cm. pipettes en plastique ne sont pas informés, que les vers peuvent souvent tenir à eux.
8. En utilisant un microscope à dissection transmission stéréo, compter le nombre de vers à la L3, L4 et stades adultes. Ne pas compter les vers qui sont stade L2 et les plus jeunes, les générations F1 et F2 peuvent être confondus ici. Ainsi, cette analyse est une analyse de la taille des couvées par rapport au lieu d'un dosage de la taille totale du couvain.

5. image et enregistrement Worm Comportement sur NGB-3D

1. Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et éliminer toutes les bactéries collées à la surface par le transfert à une plaque NGM exempt de bactéries et de lui permettre de se déplacer librement pendant quelques minutes.
2. Répétez l'étape 5.1 pour vous assurer que le worm est exempt de bactéries.
3. Placez délicatement le ver propre sur le centre de la surface de la gélose de la NGB-3D à proximité du col de la bouteille avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
4. Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, tout en empêchant le séchage du milieu agar.
5. Image ou enregistrer le ver sous un microscope binoculaire transmission stéréo. Réglez la mise au point que le ver se déplace à travers la matrice 3D.

Résultats

La construction de NGT-3D est un protocole simple et direct qui se traduit par un tube d'essai d' agar-rempli avec de petites colonies bactériennes espacées tout au long de l'agar - agar (figure 1A). Les vers peuvent se déplacer librement à travers la matrice d'agar, la recherche et la consommation des colonies bactériennes. Pour vérifier si C. elegans peuvent se reproduire et se développer normalement dans NGT-3D, nous avons comparé la f...

Discussion

La culture en laboratoire de C. elegans en utilisant les plaques de milieu de croissance des nématodes classiques était cruciale pour les centaines de découvertes importantes que la recherche en C. elegans a fourni. Ici, nous présentons de nouvelles méthodes pour cultiver C. elegans dans un environnement qui reflète plus fidèlement leurs habitats naturels en trois dimensions. Bien que d' autres méthodes ont été utilisées pour observer C. elegans ¹³ en 3D, cec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000