の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

要約

我々はNGT-3DとNGB-3Dと呼ばれる3D線虫の栽培システムを構築するための簡単な方法を提示します。これらは、標準的な2D実験室のC.エレガンス培養プレートより自然な線虫（Caenorhabditis elegans）の生息地に類似している生息地における線虫のフィットネスや行動を研究するために使用することができます。

要約

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

概要

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

プロトコル

1. NGT-3DとNGB-3Dのためのソリューションを準備

1. 0.1454 M NaCl溶液1 L、1 MのCaCl _2、1MのMgSO _4、溶原性ブロス（LB）、KH ₂の1 M KPO ₄緩衝液（108.3グラムの1 Lの1 Lの1 L：以下の無菌溶液を準備しますK ₂ HPO ₄のPO ₄ 35.6 gであり、1 LにH ₂ Oを充填します）。これらのソリューションを使用してNGMの生産は以前のプロトコル¹⁰で見つけることができます。
2. 121℃、15分のオートクレーブソリューション。
3. 無菌の5mg / mlのコレステロール溶液50mlを準備します。 50ミリリットルの円錐管では、コレステロールの0.25グラムと99.99％のエタノール50mlを混合し、よく混ぜます。 オートクレーブしないでください 。 0.45μmのシリンジフィルターで50mlの注射器を用いてコレステロール溶液を滅菌します。これはまた、任意の溶解していないコレステロールを除去します。
4. 2'-デオキシ-5-フルオロ（FUDR）株式の150 mMのの10ミリリットルを用意（オプション）。 15ミリリットルコニカルチューブでは、0.3693グラムを混ぜますFUDRおよび蒸留水10mlを。よくまぜろ。

2. NGT-3DとNGB-3Dのための細菌培養を準備

1. 細菌と10mlのLBブロスに接種。 C.エレガンス供給のために使用される標準的な細菌は、 大腸菌株OP50です。
2. 文化一晩振とう培養器で37℃で細菌接種。
3. 連続希釈の準備のために、滅菌した15ミリリットルコニカルチューブにNaCl溶液のアリコート9ミリリットル。例えば、7チューブの合計に一定分量9mlをOP50株大腸菌の10 ^-7希釈を行います。
4. NaCl溶液の9ミリリットルで、無菌の新しいチューブに無菌千μlのピペット、ピペット1mlの細菌培養物または希釈した細菌培養物を使用して、よく10ミリリットルの混合物をボルテックス。目的の細菌の希釈が達成されるまで繰り返します。
   注：希望の細菌希釈タイプと条件細菌のと同様に、正確な実験条件に依存します。例えば、10 ^-6 - 6.5ミリリットルNGT-3Dのチューブ当たり200細菌コロニー- OP50株大腸菌の10 ^-8希釈は1から生成するのに十分でした。 10 ^-7 -コロニーの数は60を超えていたとき、ワームは、10 ^-6の希釈で発生し、確実に開発され、正常に再生しました。 NGB-3Dの場合は、10 ^-8の希釈を使用します。

3.メイキングNGT-3DとNGB-3D（200ミリリットル）

1. 細菌培養物を準備した後、0.6グラムのNaCl、1グラムの造粒寒天、および500mlのフラスコ内の0.5グラムペプトンを混ぜます。フラスコに磁気攪拌棒を挿入します。
2. 195ミリリットルに蒸留水を加え、アルミホイルでフラスコの口をカバーしています。
3. 15分間121℃でオートクレーブ。
4. 撹拌プレート上にホットオートクレーブ処理フラスコを置き、少なくとも2時間、中程度の速度で攪拌します。 40℃にフラスコを冷却します。完成した寒天の曇りにつながる可能性があり、ここで、高温でから継続して十分に冷却するようにしてください。しかしながら、より低い温度は、寒天の早期硬化をもたらすことができます。
   1. 撹拌プレート上に配置する前に、40℃の水浴で15分間でフラスコを置き、冷却プロセスをスピードアップする（オプション）。
5. 寒天培地の温度が40℃に達したとき、溶液を攪拌し続けるように、200μlの1 MのCaCl _2、5 mg / mlでのコレステロール溶液200μl、200μlの1 MのMgSO ₄および5 mlの1 M KPO ₄緩衝液を加えます1mMのCaCl ₂を、5μg/ mlのコレステロール、1mMのMgSO ₄を、1 mMのKPO ₄の最終濃度まで。
   1. NGT-3Dの寿命アッセイのために（オプション^）120μM12の最終濃度に150mMのFUDRの80μlを添加します。
6. 直接フラスコにステップ2.4からの細菌培養物を希釈した10ミリリットルの6ミリリットルを追加します。
   1. （オプション）NGT-3Dの場合は、ステップ3.6前の寒天培地の6ミリリットルを削除し、別にそれを暖かく保ちます。このメディアが使用されます細菌フリー上層。
7. 滅菌手順を使用して、無菌培養室にメディアを分配します。チャンバーのカバーがしっかりと閉じていることを確認します。
   1. ステップ3.7からのメディアが完全に硬化する前に、上のステップ3.6.1から細菌を含まない寒天培地の層を作る、寒天の上面に形成されるの細菌コロニーを防止するために、（オプション）。これはNGT-3Dの上部にある細菌フリーゾーンを作成します。
   2. NGT-3Dの場合は、細菌の寒天層を作り、そして慎重に薄いbacteria-を作るために半硬化3Dメディアの上に細菌を含まない培地200μlのを分配するために8ミリリットル透明なプラスチック製試験管に6.5ミリリットルのメディアを注ぎます上部の自由層。
   3. NGB-3Dの場合は、25cm ²の透明なプラスチックの細胞培養瓶にメディアの65ミリリットルを注ぎます。この量は、25cm ²の細胞培養ボトルのボディを埋める必要があります。
8. 細菌コロニーが成長できるようにするために、室温で1週間垂直室を残します少なくとも直径1mmのかなりの大きさ。
   1. （オプション）NGT-3Dで寿命アッセイのために、FUDRの光劣化を防止するために、アルミホイルでチャンバーをカバーしています。

NGT-3D（相対同腹サイズアッセイ）上でワームの人口の4メジャーフィットネス

1. ピックや細菌フリーNGMプレート上の転送白金線を使用して、L4段ワームを選びます。ワームは自由に体に付着した細菌を除去するために、数分間に移動できるようにします。
2. ステップ4.1を繰り返して、このワームは細菌から自由であることを確認してください。一般的に、4.1の2反復が十分にあります。
3. 慎重に白金線ピックで3Dメディアの表面にきれいなワームを置きます。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
4. ゆるくいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じますが、寒天培地の乾燥を防止します。
5. 20℃で96時間インキュベートします。
6. 4日後、しっかりと蓋を閉じて置きます88℃の水浴にNGT-3D培養チャンバは、寒天を融解します。熱は虫を殺すが、自分の体はそのまま残ります。
   注：NGT-3Dのための8ミリリットルのチューブを使用して、20から30分間のインキュベーションは、通常は十分です。
7. ガラスピペットを使用して9センチプラスチックシャーレ上に溶融したメディアを転送します。ワームは、多くの場合、それらに固執することができますようにプラスチックピペットは、お勧めされていません。
8. 送信立体解剖顕微鏡を用いて、L3、L4でワーム、および成体段階の数を数えます。 F1及びF2世代はここで混乱することができますように、L2ステージと若いワー​​ムをカウントしないでください。したがって、このアッセイは、相対的なひなサイズ分析ではなく、合計ひなサイズのアッセイです。

5.イメージとNGB-3Dでの録音ワームの動作

1. 白金線を使用して、L4段ワームをピックし、細菌フリーNGMプレートに移し、それが自由に数分間移動させることにより、表面に付着した細菌を除去します。
2. インクルードをめざし確実にする手順を繰り返し5.1rmが細菌から自由です。
3. 慎重に白金線ピックと瓶の首に近いNGB-3Dの寒天表面の中央にきれいなワームを配置します。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
4. 寒天培地の乾燥を防止しながら、緩やかにいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じます。
5. 画像または伝送ステレオ解剖顕微鏡下でワームを記録。ワームが3Dマトリックスを通って移動するようにフォーカスを調整します。

結果

NGT-3Dの建設は、寒天（ 図1A）全体に間隔をあけ小さな細菌コロニーを寒天で満たされた試験管になり、シンプルで簡単なプロトコルです。ワームは自由に細菌コロニーを発見し、消費し、寒天マトリックスを通って移動することができます。 C.エレガンスが再現し、NGT-3Dで正常に成長できるかどうかを確認するために、我々は標準的な2D NGMプレー?...

ディスカッション

古典的な線虫の増殖培地プレートを使用して、 線虫の実験室での栽培は、 線虫の研究が提供していることが重要な発見の数百に非常に重要でした。ここで、我々はより正確に自然な立体生息環境を反映している環境で、 線虫を育成する新たな方法を提示します。他の方法は、3D ¹³の線虫を観察するために使用されているが、これは、固体三次元マトリック...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000