בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה.

כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני ^1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול ^7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה ^2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים ^3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי).

בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol ^{4, 5.}

אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin ^{4, 6,} אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד ^{7, 8.}

לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו ^{9 ADP, 10, 11, 12.} המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 ^{13, 15.}

לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.

Protocol

הביופסיה השרירה ארבעה הראשים נלקחת חזיר מורדם, שממנו המיטוכונדריה מבודד על ידי צנטריפוגה הפרש. החזיר משמש לאחר מכן עבור ניסוי נוסף. המחקר מתבצע בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור ועדת טיפול בבעלי חיים של קנטון ברן, שוויץ.

1. המגון שרירי השלד ובידוד מיטוכונדריאלי

1. בלו 5-10 ארבעה גרמו דגימת שריר מ חזיר מורדם. ב assay מופיע, השתמשו בשרירי שלד חזיריים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה ממינים אחרים (למשל, חולדה, עכברים, אדם, וכו '.).
   הערה: שלב זה מתבצע על ידי מומחה רפואי עם התמחות בכירורגיה.
   1. חזירים שלווים עם קטמין תוך שרירית (20 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (2 מ"ג / ק"ג), לפני הרדמה מושרה עם התוךmidazolam ורידי (0.5 מ"ג / ק"ג, בתוספת אטרופין 0.02 מ"ג / ק"ג). לשמור על הרדמה עם חליטות תוך ורידי רציף של propofol (4-8 מ"ג / ק"ג ח) ו- פנטניל (30 מיקרוגרם / ק"ג ח) במהלך הניתוח.
2. מיד לטבול את דגימת רקמה בתוך כוס המכילה 20 מ"ל של חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח (טבלה 1).
   הערה: חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריך להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol.
3. לשקול את דגימת רקמה בכוס על איזון tared אנליטי. טרה את האיזון עם כוס המכילה 20 מ"ל של חיץ בידוד.
4. מניח את הכוס על דלי קרח.
   הערה: בצע את כל השלבים הבאים עבור ההליך המגון בטמפרטורה דלי קרח ולשמור את כל המאגרים על דלי הקרח.
5. לרכך את שרירי השלד בכוס (לשמור על הקרח) לחתיכות קטנות 1-2 מ"מ במשך 3-4 דקות באמצעות sciss בסדרORS.
6. יש לשטוף את רקמת טחון בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר כקרח (20 מיליליטר כל צעד כביסה).
7. להשעות את הרקמה 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) המכיל רקמות 5 מ"ג פרוטאז / g.
8. מניח את הכוס באמבט קרח על stirrer המגנטי ומערבבים במשך 10 דקות.
9. לדלל את ההשעיה בכוס עם 10 כרכים נוספים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) אלבומין בסרום שור נטול שומן (BSA).
10. למזוג את כל חיץ הבידוד השלים עם 0.2% BSA ולשטוף את הרקמה בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר קרח בתוספת 0.2% BSA (20 מיליליטר כל צעד כביסה).
11. Resuspend רקמת ב 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% עם נטול שומן BSA.
12. Homogenize רקם עם homogenizer זכוכית חצי אוטומטי (כל זמן על קרח) עם עלי רפוי (10 משייכות).
    הערה: Homogenizדואר הרקמה תמיד באותו אופן (אותו מספר משיכות, למשל, 10 משיכות). מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. רצוי, homogenize הרקמה באמצעות homogenizer אוטומטי. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד.
13. צנטריפוגה רקמת הומוגני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10,000 x ז.
    הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעים צנטריפוגות עם רוטורים בזווית קבועים.
14. בטל supernatant באמצעות pipet סרולוגיות ו resuspend גלולה במדיום בידוד קר כקרח-בתוספת BSA (10 מ"ל / גרם רקמה).
15. צנטריפוגה ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב g x 350.
16. שומרים לעצמנו את supernatant באמצעות pipet סרולוגיות וזורקים את הכדור (פסולת הסלולר).
17. סנן את supernatant לתוך מבחנה (לשמור על הקרח) באמצעות שתי שכבות של גזה (17 האשכולות / ² ס"מ) להסיר תאים debrהוא.
18. צנטריפוגה ההשעיה המסוננת על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז.
19. בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר הבידוד (5 רקמות מיליליטר / g) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) BSA ו צנטריפוגות ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז.
20. בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית חיץ לשטוף (טבלה 1). צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x ז.
21. בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר לשטוף בצנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x גרם.
22. בטל supernatant ו resuspend גלולה המיטוכונדריה גולמי 1.0 מ"ל של חיץ לשטוף.
23. קביעת ריכוז החלבון של ההשעיה המיטוכונדריה ולשמור ההשעיה המיטוכונדריה המרוכזת על קרח.
    הערה: ריכוז חלבון ניתן למדוד באמצעות כל שיטה סטנדרטית.
24. זמן קצר לפניכדי respirometry מבחני, resuspend ההשעיה המיטוכונדריה למאגר הנשימה לריכוז סופי של חלבון 0.4 מ"ג / מ"ל ​​המיטוכונדריה.

2. ברזולוציה גבוהה Respirometry

1. 2.1 פיפטה מ"ל הנשימה חיץ (טבלה 1) ¹⁶ לתוך תא oxygraph ברזולוציה גבוהה ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C עבור 1 ח עד אות השטף חמצן יציבה של חיישן חמצן polarographic מתקבל.
   הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל תא oxygraph למדוד את ריכוז החמצן ולחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. בנוסף, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות, תיקון רקע חמצן אינסטרומנטלי צריך להיותנעשה על פי הוראות היצרן.
   הערה: מדויק 2.1 מיליליטר של חיץ נשימה מתווספת לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים.
2. בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן ^17.
   הערה: במהלך כיול אוויר, עם מתנת שלב גז, ריכוז חמצן התקשורת יהיה לאזן בסדר גודל של 15-20 דקות. בהתאם טמפרטורה, לחץ ברומטרי, מסיסות של -oxygen ריכוז התקשורת ניתן לחשב.
3. לאחר כיול אוויר, לשאוב את המדיום הנשימה מהאולם oxygraph ולהוסיף 2.1 מ"ל של השעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / חלבון המיטוכונדריה מ"ל) משלב 1.24 אל חדר של oxygraph.
   הערה: היקף מאגר נשימה תלוי במכשיר להגדיר ויצרן. לקבלת respirometry ברזולוציה גבוהה, 2.1 מ"ל של bu הנשימהffer מתווסף לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים.
4. סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק.
5. מערבב את ההשעיה המיטוכונדריה ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C ו- נשימה תאית שיא בתחילת המחקר במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח ^17.
6. לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים הבאים.

נשימת 3. אני תלוי Complex

1. הכן תא oxygraph המכיל את ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציבה.
2. להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ"מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ"מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמרית להקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים.
3. להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה המיטוכונדריאלי עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות).
   הערה: הרמה של נשימה לאחר תוספת ADP עולה כי ריכוז ADP היה גבוה להרוות. בהתאם לכמות של המיטוכונדריה בשימוש במהלך הנשימה, ריכוז ADP יש טיטרציהעבור צריכת חמצן מדינת 3 יציבה (נשימה מקסימלי). תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4).

4. נשימה השנייה תלויה Complex

1. הכן תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציב.
2. להזריק 2 μL של 0.2 rotenone מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט את הנשימה התאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
   הערה: Rotenone הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם.
3. להזריק 20 μL של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך ch oxygraphענבר נשימה המיטוכונדריאלי שיא 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
4. להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן, מייצב, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות).
   הערה: תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4).

5. נשימה IV התלוי Complex

1. הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ"ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה.
2. ואז להזריק 2.5 μL של ascorbate 0.8 מ"מ (1 מ"מ). מיד לאחר מכן להזריק 2.5 μL של 0.2M TMPD (0.25 מ"מ) ו -10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph ואת הנשימה התאית שיא עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב (3-5 דקות).
3. לבסוף להזריק 10 μL של 1 M יזיד הנתרן (5 מ"מ) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
   הערה: אזיד הנתרן הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם.

6. ציטוכרום C מבחן

1. הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ"ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה.
2. להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ"מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ"מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמריתולהקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
3. להזריק 10 μL של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי נשימה המיטוכונדריאלי שיא עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורדת ומייצב (3-5 דקות).
4. לבסוף, להזריק 5 μL של ציטוכרום C 4 מ"מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.

תוצאות

אני תלוי קומפלקס נשימה

שיעורי נשימה שאני תלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 1, דיאגרמה נציג). מצעים שאני מורכבים מיטוכ...

Discussion

במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.

כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical