Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения

Резюме

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Аннотация

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Введение

Митохондриальные биоэнергетика и дыхательные способности могут быть изучены не только в проницаемыми клеток или волокон, но и в изолированных митохондриях. В настоящем исследовании мы опишем протокол, чтобы изолировать неповрежденных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии с высокой разрешающей способностью.

Чтобы изолировать интактные митохондрии для респирометрии, ткань гомогенизируют и митохондрии изолированы с помощью обычного метода дифференциального центрифугирования. Метод дифференциального центрифугирования основан на последовательном центрифугировани (в серии увеличения скорости) тканевых гомогенатах впервые был введен Pallade и сотрудниками почти 70 лет назад ^1. Ткань сначала фарша с помощью ножниц и гомогенизируют механически в стеклянном гомогенизаторе с рыхлой облегающие пестиком. Затем гомогенат центрифугируют при низкой скорости и образующийс осадок, который содержит сплошную ткань, клеточныймусора и ядер отбрасывают. Затем надосадочную жидкость центрифугируют несколько раз на высокой скорости и митохондриальные обогащенную фракцию собирают. Преимущества метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что: I) метод быстр и митохондрии, могут быть выделены в течение 1-1,5 ч (дыхательные эксперименты должны быть выполнены как можно быстрее); б) это недорого; и III) она является очень эффективным и митохондрии, полученные с помощью дифференциального центрифугирования достаточно чистым для использования респирометрии анализов. К недостаткам метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что я) митохондрии могут быть повреждены и отсоединен во время гомогенизации; б) загрязнение митохондрий с другими клеточными компонентами (может быть решена путем дальнейшей промывки митохондриальная гранул с дополнительными шагами центрифугирование); III) возможность выбора различных митохондриальных субпопуляции, например, во время дифференциальные центрифугировани шагов, митochondria с более низкой плотной могут быть исключены ^7; и IV) митохондриальный сотовой окружающих отсутствует, и только теоретическое максимальное дыхание может быть измерено. Другой метод , чтобы изолировать митохондрии для респирометрии анализов градиент плотности Центрифугирование ^2. В этой технике, экстракт ткани наслаивается над раствором сахарозы или градиентом Percoll (с более высокой плотностью в нижней части центрифугирование трубки) и центрифугировали при определенной скорости, в результате чего митохондрии быть изолированы от других клеточных компонентов в соответствии с их плотности. Этот метод часто используется, чтобы изолировать митохондрии мозга с очень низким загрязнения от синаптосомах. Тем не менее, митохондрии печени крысы , выделенные центрифугирования в градиенте плотности сильно загрязнены с другими клеточных органелл ^3. Одним из недостатков этого метода является то, что градиент сахарозы присутствует в центрифужную пробирку может треснуть такменя митохондрии (осмотический шок).

В зависимости от типа ткани; Есть некоторые важные факторы, которые необходимо учитывать для выделения неповрежденной митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Первой необходимости является гомогенизация тканей в мягкой форме. Мягкие ткани, такие как почки, мозг и печень требуют нежные механические силы, применяемые в процессе гомогенизации. Это контрастирует с твердыми тканями, такими как сердца и скелетных мышц, которые требуют гораздо более сильные механические силы. Измельченной ткани, как правило, обрабатывают протеиназой до гомогенизации, чтобы размягчить ткани. Все буферы , используемые в процессе гомогенизации и центрифугирования должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы , совместимой с цитозоле ^{4, 5.}

Одним из преимуществ изучения изоляции митохондриальные биоэнергетика является то, что клеточная плазматические мембраны не должны быть permeabiтрализованную с моющими средствами , такими как дигитонина или сапонина ^{4, 6,} которые могут привести к нарушению целостности митохондриальной наружной мембраны. Еще одно преимущество изолированного митохондрий является отсутствие других цитозольных факторов, которые могут препятствовать анализу митохондриальных функций, таких как потребление кислорода. Недостатки использования выделенных митохондрии возможный выбор некоторых митохондриальных популяций во время стадий центрифугирование, повреждение митохондрий в процессе гомогенизации, а также потребность в больших количеств биологических образцов, чтобы получить хороший выход изолированных митохондрий ^{7, 8.}

После процедуры изоляции, частота дыхания митохондриальных комплексов I-, II- и IV-зависимые состояния (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии. Для сложных I управляемых дыхания, глутамати малат добавляют с последующим аденозиндифосфатом (ДПА). Для получения сложного дыхания II приводом, сукцинат с последующим добавлением АДФ. Для комплексного IV управляемых дыхания, аскорбат и tetramethylphenylendiamine (ТМФД) добавляют с последующим АДФ ^{9, 10, 11, 12.} Состояние 2 относится к потреблению кислорода в присутствии одних субстратов. Состояние 3 относится к потреблению кислорода в присутствии субстратов и АДФ. Состояние 4 относится к потреблению кислорода после истощения АДФ. Дыхательный коэффициент (RCR) является индексом сцепления производства АТФ потребления кислорода и рассчитывается как отношение между состоянием 3 и состояние 4 ^{13, 15.}

В заключение, мы опишем протокол для выделения функциональных и неповрежденные скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования и использовать эти изолированные mitochonDria функциональных и биоэнергетических исследований, таких как высокого разрешения респирометрии.

протокол

Четырехглавой мышцы биопсия взята из анестезированной свиньи, из которой митохондрии выделяют дифференциального центрифугирования. Свинья используется впоследствии для другого эксперимента. Исследование проводится в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов по уходу и использованию экспериментальных животных и с одобрения Animal Care комитета кантона Берн, Швейцария.

1. скелетных мышц Гомогенизация и Митохондриальная Изоляция

1. Акцизный 5-10 г четырехглавой мышцы образец из анестезированной в свинью. В данном анализе используют свиную скелетных мышц. Этот протокол также может быть использован для выделения митохондрии из других видов (например, крысы, мыши, человека и др.).
   Примечание: Этот шаг выполняется врачом-специалистом с опытом в области хирургии.
   1. Седативный свиней с внутримышечным введением кетамина (20 мг / кг) и ксилазина (2 мг / кг), перед наркозом индуцируется с интравенозный мидазолама (0,5 мг / кг, плюс атропин 0,02 мг / кг). Поддержание анестезии с непрерывным внутривенным инфузий пропофола (4-8 мг / кг в час) и фентанила (30 мкг / кг в час) во время операции.
2. Немедленно погрузить образец ткани в химический стакан , содержащий 20 мл охлажденного на льду буфера митохондриальной изоляции (таблица 1).
   Примечание: Буферы используются во время гомогенизации и центрифугирования должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы, совместимой с цитозоле.
3. Взвесьте образец ткани в химическом стакане на аналитических тарированный баланса. Тарирования с химический стакан, содержащий 20 мл буфера для изоляции.
4. Поместите стакан на ведро льда.
   Примечание: Выполните все следующие шаги для процедуры гомогенизации при температуре ведро льда и сохранить все буферы на ведро льда.
5. Фарш скелетных мышц в стакане (держать на льду) в 1-2 мм мелкие кусочки в течение 3-4 мин с использованием тонких scissПРС.
6. Ополосните измельченной ткани в стакане со льдом дважды буфером холодной изоляции (20 мл каждая отмывкой).
7. Подвешивание ткани в 10 объемах буфера изоляции на массу ткани (г), содержащий 5 мг протеазы / г ткани.
8. Стакан помещают в баню со льдом на магнитной мешалкой и перемешивают в течение 10 мин.
9. Разбавляют суспензию в химическом стакане с дополнительными 10 объемами буфера изоляции на массу ткани (г), дополненной 0,2% (вес / объем) обезжиренный бычий сывороточный альбумин (БСА).
10. Влить весь буфер изоляции, дополненной 0,2% БСА и полоскание ткани в стакане дважды со льдом буфером холодной изоляции, дополненной 0,2% БСА (20 мл каждый раз отмывкой).
11. Ресуспендируют ткани в 10 объемах буфера изоляции на массу ткани (г), дополненной 0,2% с обезжиренной БСА.
12. Однородный ткани с полуавтоматической стеклянной гомогенизатора (держали на льду) с рыхлым облегающие пестика (10 ударов).
    Примечание: Homogenizе ткани всегда таким же образом (одинаковое количество ударов, например, 10 ударов). Большее количество ударов может привести к повреждению и расцепить митохондрии. Предпочтительно гомогенизировать ткани с использованием автоматического гомогенизатора. Вручную (и субъективно) образцы гомогенизированные ткани в стеклянных гомогенизаторов может производить различные качества изолированных митохондрий.
13. Центрифуга гомогенизированной ткани при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х г.
    Примечание: Все стадии центрифугирования выполняются в центрифугах с угловым ротором.
14. Жидкость над осадком сливают с помощью серологической пипетки и ресуспендируют осадок в БСА-добавляемой ледяным изолирующей среды (10 мл / г ткани).
15. Центрифуга суспензии при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 350 х г.
16. Резервный супернатант с помощью серологических пипеткой и отбросить осадок (остатков клеток).
17. Фильтр супернатант в стакан (держали на льду) через два слоя марли (17 нитей / см ²⁾ для удаления клеток Debrявляется.
18. Центрифуга отфильтрованный суспензию при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
19. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной гранул в буфере изоляции (5 мл / г ткани), дополненной 0,2% (вес / объем) БСА и центрифуге суспензии при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
20. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной гранул в промывочном буфере (таблица 1). Центрифуга суспензия снова при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
21. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной осадок в буфере для промывки и центрифугировать суспензия снова при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
22. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальные гранулы в 1,0 мл буфера для промывки.
23. Определить концентрацию белка в митохондриальной суспензии, и держать концентрированную митохондриальной суспензии на льду.
    Примечание: Концентрация белка может быть измерена с помощью любого стандартного метода.
24. Непосредственно передна респирометрии анализы, ресуспендируют митохондриальной суспензии в буфере дыхания до конечной концентрации 0,4 мг / мл митохондриального белка.

2. Высокое разрешение респирометрии

1. Пипетка 2,1 мл дыхания буфера (таблица 1) ¹⁶ в oxygraph камеру с высокой разрешающей способностью и размешать буфер непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 1 ч до тех пор , сигнал стабильный поток кислорода из полярографический датчик кислорода получается.
   Примечание: Полярографические электроды кислорода внутри каждой oxygraph камере измеряют концентрацию кислорода и рассчитать потребление кислорода (потока) в каждой камере. Концентрация кислорода и скорости потребления кислорода (потока) отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере, используя программное обеспечение для сбора и анализа данных. Кроме того, для того, чтобы обеспечить точные и надежные результаты, инструментальное кислородный коррекция фона должна бытьосуществляется в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: точно 2,1 мл буфера дыхания добавляют в камеру для калибровки конечного объема камеры 2,0 мл после закрытия стопоров.
2. Провести калибровку воздуха полярографическому кислородного датчика в соответствии с протоколами изготовителя ^17.
   Примечание: В процессе калибровки воздуха, с газовой фазой, присутствующей, концентрация кислорода, средства массовой информации будут уравновешиваться от порядка 15-20 мин. В зависимости от температуры, барометрического давления и растворимости концентрации средств массовой -кислород можно рассчитать.
3. После калибровки воздуха, аспирация дыхание среды из камеры oxygraph и добавляют 2,1 мл изолированной митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл митохондриального белка) со стадии 1,24 к камере oxygraph.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера дыхания зависит от инструмента настройки и производителя. Для получения высокого разрешения респирометрии, 2,1 мл дыхания бушельffer добавляется в камеру для калибровки конечного объема камеры 2,0 мл после закрытия стопоров.
4. Закройте oxygraph камеру путем вставки стопора.
5. Перемешать митохондриальную приостановку непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° C и запись клеточного дыхания на исходном уровне в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
   Примечание: Концентрация кислорода и сигнала поток кислорода отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере с помощью программного обеспечения для сбора и анализа данных ^17.
6. Затем вводят субстраты и ингибиторы для митохондриального дыхания через нагнетательную титана портов стопоров с использованием следующих стандартных протоколов.

3. Комплекс I-зависимой Дыхательный

1. Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную приостановку (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1-2.5 иждать стабильного сигнала.
2. Вводят 12,5 мкл 0,8 М малат (5 мМ конечная концентрация) и 10 мкл 2 М глутамата (10 мМ конечная концентрация) в oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную суспензию (0,4 мг / мл) через нагнетательную титана порт камеры пробкой и запись клеточное дыхание в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции в следующие шаги выполняются через нагнетательные титана портов пробками с использованием шприцев.
3. Вводят 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и не записывать дыхание митохондрий, пока сигнал возрастает поток кислорода, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
   Примечание: Плато дыхания после АДФ того указывает, что концентрация АДФ была высокой и насыщением. В зависимости от количества митохондрий, используемых в процессе дыхания, концентрации АДФ следует титроватьдля стабильного состояния 3 потребления кислорода (максимальное дыхание). Добавление АДФ к митохондриальной суспензии будет вызывать увеличение потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет возрастать (состояние 3 дыхания). После того, как АДФ потребляется, сигнал поток кислорода будет уменьшаться (состояние 4 дыхания).

4. Комплекс II-зависимой Дыхательный

1. Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1-2.5 и ждать стабильного сигнала.
2. Вводят 2 мкл 0,2 мМ ротенону (0,2 мкМ) «Внимание» в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопора с помощью шприца и не записывают клеточное дыхание в течение 3-5 мин, пока не будет достигнут устойчивый сигнал поток кислорода.
   Примечание: Ротенон является опасным ядом и может оказать существенное влияние на здоровье человека.
3. Вводят 20 мкл 1 М сукцинат (10 мМ) в oxygraph чянтарь и запись митохондриального дыхания в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала потока кислорода достигается.
4. Вводят 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и не записывать клеточное дыхание, пока сигнал возрастает поток кислорода, стабилизирует, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
   Примечание: Добавление АДФ к митохондриальной суспензии будет вызывать увеличение потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет возрастать (состояние 3 дыхания). После того, как АДФ потребляется, сигнал поток кислорода будет уменьшаться (состояние 4 дыхания).

5. Комплекс IV-зависимой Дыхательный

1. Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1 до 2.5 протокола и ждать стабильного сигнала.
2. Затем вводят 2,5 мкл 0,8 мМ аскорбата (1 мМ). Сразу же после этого вводят 2,5 мкл 0,2М TMPD (0,25 мМ) и 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточного дыхания до тех пор пока кислорода потока сигнала увеличивается и стабилизируется (3-5 мин).
3. Наконец вводят 10 мкл 1 М азида натрия (5 мМ) «Внимание» в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание до нормализации сигнала потока кислорода и стабилизирует.
   Примечание: азид натрия представляет собой опасный яд и может оказать существенное влияние на здоровье человека.

6. цитохром C Test

1. Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1 до 2.5 протокола и ждать стабильного сигнала.
2. Вводят 12,5 мкл 0,8 М малат (5 мМ конечная концентрация) и 10 мкл 2 М глутамата (10 мМ конечная концентрация) в oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную суспензию (0,4 мг / мл) через нагнетательную титана порт камеры стопороми запись клеточное дыхание в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
3. Вводят 10 мкл 0,5 М АДФ (2,5 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и записывать митохондриального дыхания, пока сигнал увеличивается поток кислорода, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
4. И, наконец, вводят 5 мкл 4 мМ цитохрома с (10 мкМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.

Результаты

Комплекс I-зависимого дыхания

Изолированные митохондриальные сложные частота дыхания I-зависимых состояний (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии (рисунок 1, представитель диаграмм...

Обсуждение

В настоящем исследовании мы опишем протокол для изоляции высокого качества, нетронутыми и тесно связанных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования, которые могут быть использованы для функциональных исследований, таких как высокого разрешения респи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical