Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Résumé

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Résumé

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

bioénergétique mitochondrial et les capacités respiratoires peuvent être étudiés non seulement dans des cellules ou des fibres perméabilisées, mais aussi dans les mitochondries isolées. Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries intactes du muscle squelettique en utilisant la centrifugation différentielle pour les mesures de respirométrie à haute résolution.

Pour isoler les mitochondries intactes pour respirométrie, le tissu est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par un procédé de centrifugation différentielle classique. La méthode de centrifugation différentielle est basée sur centrifugations séquentielles (dans une série de vitesse croissante) des broyats de tissus a été introduit par Pallade et collègues de travail il y a près de 70 ans ^1. Le tissu est tout d'abord hachée avec des ciseaux et homogénéisés mécaniquement dans un homogénéisateur en verre avec un pilon ample. Ensuite, l'homogénat est centrifugé à faible vitesse et le culot résultant qui contient du tissu intact, cellulaireles débris et les noyaux sont jetés. Ensuite, on centrifuge le surnageant à plusieurs reprises à grande vitesse, et la fraction enrichie est recueillie mitochondriale. Les avantages de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont les suivantes: i) la méthode est rapide et mitochondries peut être isolé au sein de 1-1,5 h (expériences respiratoires doivent être effectuées aussi vite que possible); ii) il est peu coûteux; et iii) il est très efficace et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle sont suffisamment pur pour les essais de respirométrie. Les inconvénients de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont que i) les mitochondries pourraient être endommagés et découplées pendant l'homogénéisation; ii) la contamination des mitochondries avec d'autres composants cellulaires (pouvait être résolu par un nouveau lavage du culot de mitochondries avec des étapes de centrifugation supplémentaires); iii) la possibilité de sélectionner différentes sous - populations mitochondriales, par exemple, au cours de centrifugations différentielles étapes, mitochondria avec dense inférieure peut être exclue ^7; et iv) l'entourant cellulaire est absent et que la respiration mitochondriale maximale théorique peut être mesurée. Une autre méthode pour isoler les mitochondries pour les essais de respirométrie est la centrifugation en gradient de densité ^2. Dans cette technique, l'extrait de tissu est déposé en couche sur une solution de saccharose ou d'un gradient de Percoll (avec une densité plus élevée au fond du tube de centrifugation) et on centrifuge à une certaine vitesse, ce qui provoque la mitochondrie être isolée des autres composants cellulaires en fonction de leur les densités. Cette méthode est souvent utilisée pour isoler les mitochondries du cerveau avec une très faible contamination par des synaptosomes. Cependant, les mitochondries de foie de rat isolés par centrifugation à gradient de densité sont fortement contaminés par d' autres organelles cellulaires ^3. Une des limitations de ce procédé est que le gradient de saccharose présente dans le tube de centrifugation peut se rompre sime mitochondries (choc osmotique).

Selon le type de tissu; il y a des facteurs importants à considérer pour l'isolement des mitochondries intactes par centrifugation différentielle. La première nécessité est d'homogénéiser les tissus d'une manière douce. des tissus mous tels que le rein, le cerveau et le foie ont besoin des forces mécaniques appliquées lors de l'homogénéisation douce. Cela contraste avec les tissus durs tels que le muscle cardiaque et squelettique qui nécessitent des forces mécaniques beaucoup plus fortes. Le tissu émincé est habituellement traitée par la protéinase avant l'homogénéisation pour adoucir le tissu. Tous les tampons utilisés lors de l' homogénéisation et la centrifugation doit être refroidi à la glace et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol ^{4, 5.}

L'un des avantages d'étudier bioénergétique mitochondrial isolé est que les membranes plasmiques cellulaires ne doivent pas être permeabilisées avec des détergents tels que la saponine ou la digitonine ^{4, 6,} ce qui peut compromettre l'intégrité de la membrane externe mitochondriale. Un autre avantage des mitochondries isolées est l'absence d'autres facteurs cytosoliques qui peuvent interférer avec l'analyse des fonctions mitochondriales telles que la consommation d'oxygène. Les inconvénients de l' utilisation des mitochondries isolées sont la sélection éventuelle de certaines populations mitochondriales au cours des étapes de centrifugation, des dommages à la mitochondrie lors de l' homogénéisation, et l'exigence de grandes quantités d'échantillons biologiques afin d'obtenir un bon rendement de mitochondries isolées ^{7, 8.}

Après la procédure d'isolement, les taux respiratoires des complexes mitochondriaux I-, II- et IV-dépendants (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l'aide à haute résolution respirométrie. Pour complexe conduit I-respiration, glutamateet malate sont ajoutés, suivis de l'adénosine diphosphate (ADP). Pour la respiration complexe entraînée II, succinate est ajouté, suivi par ADP. Pour complexe entraîné IV-respiration, ascorbate et tetramethylphenylendiamine (TMPD) sont ajoutés , suivis par ADP ^{9, 10, 11, 12.} L'état 2 se réfère à la consommation d'oxygène en présence des seuls substrats. Etat 3 se réfère à la consommation d'oxygène en présence de substrats et l'ADP. État 4 se réfère à la consommation d'oxygène après ADP épuisement. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR) est un indice de couplage de la production d'ATP de la consommation d'oxygène et est calculé comme le rapport entre l' état 3 et de l' état 4 ^{13, 15.}

En résumé, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries des muscles squelettiques et fonctionnelles intactes par centrifugation différentielle et utiliser ces mitochon isolédria pour des études fonctionnelles et bioénergétiques telles que haute résolution respirométrie.

Protocole

La biopsie du muscle quadriceps est prélevé à partir d'un porc anesthésié, à partir de laquelle les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Le cochon est utilisé par la suite pour une autre expérience. L'étude est réalisée en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité du canton de Berne, Suisse Animal Care.

1. Skeletal Homogénéisation musculaire et mitochondrial Isolation

1. Accise 5-10 échantillon g quadriceps musculaires à partir d' un porc anesthésié. Dans le présent essai, utilisez le muscle squelettique porcin. Ce protocole peut également être utilisé pour isoler les mitochondries à partir d' autres espèces (par exemple, le rat, la souris, l' homme, etc.).
   REMARQUE: Cette étape est effectuée par un médecin spécialiste avec une expertise en chirurgie.
   1. porcs rassis avec de la kétamine par voie intramusculaire (20 mg / kg) et de xylazine (2 mg / kg), avant l'anesthésie est induite par intra-midazolam veineuse (0,5 mg / kg, plus atropine 0,02 mg / kg). Maintenir une anesthésie par perfusion continue par voie intraveineuse de propofol (4-8 mg / kg par h) et de fentanyl (30 ug / kg et par heure) pendant une intervention chirurgicale.
2. Immerger immédiatement l'échantillon de tissu dans un bêcher contenant 20 ml de tampon d'isolement mitochondriale glacé (tableau 1).
   NOTE: Tampons utilisés pendant l'homogénéisation et centrifugations devraient être de la glace froide et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol.
3. Peser l'échantillon de tissu dans le bécher sur un équilibre taré analytique. Tarer la balance avec le bêcher contenant 20 ml de tampon d'isolement.
4. Placer le bécher sur un seau à glace.
   REMARQUE: Effectuer toutes les prochaines étapes de la procédure d'homogénéisation à la température de seau à glace et de garder tous les tampons sur le seau à glace.
5. Émincer le muscle squelettique dans le bécher (garder sur la glace) dans 1-2 mm de petits morceaux de 3-4 min en utilisant bien Scisseurs.
6. Rincer le tissu haché dans le bécher deux fois avec un tampon d'isolement de la glace froide (20 ml de chaque étape de lavage).
7. Suspendre le tissu dans 10 volumes de tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​contenant 5 mg de protéase / g de tissu.
8. Placer le bécher dans un bain de glace sur l'agitateur magnétique et agiter pendant 10 min.
9. Diluer la suspension dans le bêcher avec 10 volumes supplémentaires du tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% (poids / volume) d'albumine sérique délipidée bovine (BSA).
10. Transvaser la totalité du tampon d'isolement supplémenté avec 0,2% de BSA et rinçage du tissu dans le récipient deux fois avec du tampon d'isolement froid complémenté avec 0,2% de SAB (20 ml à chaque étape de lavage).
11. Remettre en suspension le tissu dans 10 volumes de tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% de BSA dégraissée.
12. Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur en verre semi-automatique (conservés sur la glace) avec un pilon ample (10 coups).
    NOTE: Homogenize le tissu toujours de la même manière (le même nombre de traits, par exemple 10 coups). Un nombre plus élevé de coups peut endommager et découpler les mitochondries. De préférence, l'homogénéisation du tissu à l'aide d'un homogénéiseur automatisé. Manuellement (et subjectivement) les échantillons de tissus homogénéisés dans homogénéisateurs de verre peuvent produire différentes qualités de mitochondries isolées.
13. Centrifuger le tissu homogénéisé à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g.
    REMARQUE: Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées dans des centrifugeuses avec des rotors à angle fixe.
14. Jeter le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique et resuspendre le culot dans un milieu d'isolement glacé BSA supplémenté (10 ml / g de tissu).
15. Centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 350 x g.
16. Réserver le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique et jeter le culot (débris cellulaires).
17. Filtrer le surnageant dans un bécher (conservé dans la glace) à travers deux couches de gaze (17 fils / cm ²⁾ pour enlever debr cellulaireest.
18. Centrifuger la suspension filtrée à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
19. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de mitochondries brut dans le tampon d'isolement (5 ml / g de tissu) additionné de 0,2% (poids / volume) de BSA et centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
20. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage (tableau 1). Centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
21. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage et centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
22. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans 1,0 ml de tampon de lavage.
23. Déterminer la concentration en protéines de la suspension mitochondriale et de garder la suspension mitochondriale concentrée sur la glace.
    REMARQUE: La concentration en protéine peut être mesurée en utilisant une méthode standard.
24. Juste avantrespirométrie pour les essais, remettre en suspension la suspension mitochondriale dans le tampon de respiration à une concentration finale de 0,4 mg / ml de protéine mitochondriale.

2. haute résolution Respirométrie

1. Pipette 2,1 ml de tampon de respiration (tableau 1) ¹⁶ dans une chambre de oxygraphe haute résolution et remuer le tampon en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C pendant 1 h jusqu'à ce qu'un signal de flux stable d'oxygène le capteur d'oxygène polarographique est obtenu.
   REMARQUE: des électrodes d'oxygène polarographiques à l'intérieur de chaque chambre de oxygraphe mesurer la concentration en oxygène et de calculer la consommation d'oxygène (flux) à l'intérieur de chaque chambre. La concentration en oxygène et le taux de consommation d'oxygène (flux) sont affichés en temps réel en ligne dans un ordinateur en utilisant un logiciel d'acquisition et d'analyse des données. En outre, afin de garantir des résultats précis et fiables, l'oxygène instrumental correction de fond doit êtreeffectuée selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: avec précision 2,1 ml de tampon respiratoire est ajouté dans la chambre pour l'étalonnage d'un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons.
2. Effectuer un étalonnage à l'air du capteur d'oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant ^17.
   REMARQUE: Lors de l'étalonnage de l'air, avec une phase gazeuse présente, la concentration en oxygène des médias sera équilibrer l'ordre de 15 à 20 min. En fonction de la température, la pression barométrique, et la solubilité de la concentration des médias peut être calculée.
3. Après étalonnage à l'air, aspirer le milieu de la respiration de la chambre de oxygraphe et ajouter 2,1 ml de la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / mL de protéine mitochondriale) de l'étape 1.24 dans une chambre du oxygraphe.
   NOTE: Le volume de tampon de respiration dépend de l'instrument mis en place et le fabricant. Pour la résolution haute respirométrie, 2,1 mL de bu de respirationffer est ajouté dans la chambre pour l'étalonnage d'un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons.
4. Fermer la chambre de oxygraphe par insertion du bouchon.
5. Incorporer la suspension mitochondriale en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C et la respiration cellulaire record à la ligne de base pendant 3-5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
   Remarque: la concentration en oxygène et le signal de flux d'oxygène sont affichées en temps réel en ligne sur un ordinateur en utilisant un logiciel pour l' acquisition et l' analyse ¹⁷ des données.
6. Par la suite, injecter des substrats et des inhibiteurs de la respiration mitochondriale par les orifices des bouchons en utilisant les protocoles standards suivants d'injection de titane.

3. Complexe Respiration I-dépendante

1. Préparer une chambre de oxygraphe contenant la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 2,1-2,5 etattendre un signal stable.
2. Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
   NOTE: Toutes les injections dans les étapes suivantes sont effectuées par les ports de bouchons en utilisant des seringues d'injection de titane.
3. Injecter 10 ul de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration mitochondriale jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
   NOTE: Le plateau de la respiration après addition d'ADP indique que la concentration d'ADP était élevée et saturante. En fonction de la quantité de mitochondries utilisées au cours de la respiration, la concentration d'ADP doit être titréepour un état 3 consommation d'oxygène stable (respiration maximale). L'addition d'ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente (état 3 respiration). Après l'ADP est consommée, le signal de flux d'oxygène diminue (état 4 respiration).

4. Complexe de la respiration II-dépendante

1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1-2.5 et d'attendre un signal stable.
2. Injecter 2 pi de roténone 0,2 mM (0,2 uM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de la chambre à l'aide d'une seringue et d'enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
   NOTE: La roténone est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine.
3. Injecter 20 ul de 1 M de succinate (10 mM) dans le ch oxygrapheambre et enregistrer la respiration mitochondriale pendant 3-5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
4. Injecter 10 ul de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, stabilise, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
   NOTE: L'addition d'ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente (état 3 respiration). Après l'ADP est consommée, le signal de flux d'oxygène diminue (état 4 respiration).

5. Complexe IV-dépendante Respiration

1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable.
2. Injecter ensuite 2,5 ul de 0,8 mM d'ascorbate (1 mM). Immédiatement après l'injection de 2,5 ul de 0,2M TMPD (0,25 mM) et 10 pi de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de respiration cellulaire et oxygraphe enregistrement jusqu'à ce que le flux d'oxygène signal augmente et se stabilise (3-5 minutes).
3. Enfin, l'injection de 10 pl de 1 M d'azoture de sodium (5 mM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.
   NOTE: L'azoture de sodium est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine.

6. Cytochrome C test

1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable.
2. Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambreet enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
3. Injecter 10 ul de 0,5 M d'ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de la chambre et l'enregistrement de la respiration mitochondriale jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
4. Enfin, l'injection de 5 ul de 4 mM de cytochrome c (10 uM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.

Résultats

Complexe I-dépendante la respiration

Taux isolés mitochondrial complexes I-dépendante des voies respiratoires (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l' aide à haute résolution respirométrie (Figure 1, un schéma représentant). I substrats complexes mitochondriaux, le glutamate et le malate, sont ajoutés, suivis par l'addition d'ADP. L'état 2 se réf?...

Discussion

Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler de haute qualité, intact et étroitement couplées mitochondries des muscles squelettiques par centrifugation différentielle qui peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles telles que haute résolution respirométrie.

Afin d'isoler les mitochondries intactes et étroitement couplées, il y a quelques points critiques à prendre en considération dans le présent protocole. Après avoir récolté le tissu oss...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical