Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Resumo

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Resumo

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introdução

bioenergética mitocondrial e capacidades respiratórias pode ser estudado, não só em células permeabilizadas ou fibras, mas também em mitocôndrias isoladas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias de músculo esquelético intactas utilizando centrifugação diferencial para medições de respirometria de alta resolução.

Para isolar mitocôndrias intactas para ventilometria, o tecido é homogeneizado e mitocôndrias são isoladas por um método de centrifugação diferencial convencional. O método de centrifugação diferencial baseia-se centrifugações sequenciais (em uma série de aumentar a velocidade) de homogeneizados de tecido foi introduzido pela primeira vez por Pallade e colegas de trabalho há quase 70 anos ^1. O tecido é primeiro picada com uma tesoura e homogeneizada mecanicamente em um homogeneizador de vidro com um pilão folgadas. Em seguida, o homogeneizado é centrifugado a baixa velocidade e o sedimento resultante que contém o tecido intacto, celulardetritos e núcleos é descartado. Em seguida, o sobrenadante é centrifugada várias vezes a alta velocidade e a fracção enriquecida mitocondrial é recolhido. As vantagens do método de centrifugação diferencial para isolar as mitocôndrias são que: i) o método é rápido e mitocôndrias pode ser isolado dentro de 1-1,5 horas (experiências respiratórias deve ser feito tão rápido quanto possível); ii) é barato; e iii) é muito eficiente e as mitocôndrias obtidos por centrifugação diferencial são suficientemente puro para ensaios de respirometria. As desvantagens do método de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias são de que i) mitocôndrias podem ficar danificados e desacoplados durante a homogeneização; ii) a contaminação da mitocôndria com outros componentes celulares (poderia ser resolvido por lavagem adicional com o sedimento mitocondrial passos de centrifugação adicionais); iii) a possibilidade de selecionar diferentes subpopulações mitocondriais, por exemplo, durante centrifugações diferenciais etapas, mitochondria com menor densa pode ser excluída ^7; e iv) a envolvente celular está ausente e só a respiração teórica máxima mitocondrial pode ser medido. Outro método para isolar as mitocôndrias para ensaios ventilometria é a densidade do gradiente de centrifugação ^2. Nesta técnica, o extracto de tecido é colocado em camadas sobre uma solução de sacarose ou de um gradiente de Percoll (com uma densidade mais elevada na parte inferior do tubo de centrifugação) e centrifugou-se a uma determinada velocidade, fazendo com que as mitocôndrias para ser isolado a partir de outros componentes celulares de acordo com os seus densidades. Este método é frequentemente usado para isolar as mitocôndrias do cérebro com muito pouca contaminação por sinaptossomas. No entanto, as mitocôndrias isoladas de fígado de rato por centrifugação de gradiente de densidade são altamente contaminado com outros organelos celulares ^3. Uma das limitações deste método é que o gradiente de sacarose presente no tubo de centrifugação pode romper tãome mitocôndrias (choque osmótico).

Dependendo do tipo de tecido; existem alguns fatores importantes a considerar para o isolamento de mitocôndrias intactas por centrifugação diferencial. A primeira necessidade é para homogeneizar tecidos de uma forma suave. tecidos moles, como rim, cérebro e fígado requerem forças mecânicas suaves aplicadas durante a homogeneização. Isto contrasta com os tecidos duros tais como o músculo cardíaco e esquelético que requerem forças mecânicas muito mais fortes. O tecido moído é geralmente tratada com proteinase antes da homogeneização para amaciar o tecido. Todos os tampões usados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol ^{4, 5.}

Uma das vantagens de estudar isoladas bioenergética mitocondrial é que membranas plasmáticas celular não precisa ser permealized com detergentes, tais como digitonina ou saponina ^{4, 6,} o que pode comprometer a integridade mitocondrial externa da membrana. Outra vantagem da mitocôndria isolada é a ausência de outros factores citosólicas, que podem interferir com a análise das funções mitocondriais, tais como o consumo de oxigénio. As desvantagens de usar as mitocôndrias isoladas são a possível selecção de determinadas populações mitocondriais durante os passos de centrifugação, os danos para a mitocôndria durante a homogeneização, e o requisito de grandes quantidades de amostras biológicas a fim de obter um bom rendimento de mitocôndrias isoladas ^{7, 8.}

Após o procedimento de isolamento, as taxas respiratórias de complexos mitocondriais I-, II- e IV-dependentes (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando-alta resolução respirometria. Para complexo impulsionado-I respiração, glutamatoe malato são adicionados seguindo-se adenosina difosfato (ADP). Para complexo respiração impulsionado-II, succinato é adicionado, seguido pela ADP. Para complexo impulsionado-IV respiração, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) são adicionados, seguidos pela ADP ^{9, 10, 11, 12.} Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de substratos sozinho. Estado 3 se refere ao consumo de oxigénio, na presença de substratos e ADP. Estado 4 refere-se ao consumo de oxigênio após a depleção ADP. A relação de controle respiratório (RCR) é um índice de acoplamento da produção de ATP consumo de oxigênio e é calculado como a relação entre o estado 3 e 4 estado ^{13, 15.}

Em resumo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias musculares esqueléticas e funcionais intactos por centrifugação diferencial e utilizá-los mitochon isoladodria para estudos funcionais e bioenergéticos como respirometria de alta resolução.

Protocolo

A biópsia do músculo quadriceps é retirado de um porco anestesiado, a partir do qual as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. O porco é usado depois para uma outra experiência. O estudo é realizado de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados Animal do cantão Berna, Suíça.

1. A homogeneização músculo esquelético e mitocondrial Isolamento

1. Excise 5-10 espécime g músculo quadríceps de um porco anestesiado. No presente ensaio, utilizam porcina músculo esquelético. Este protocolo pode também ser utilizada para isolar as mitocôndrias a partir de outras espécies (por exemplo, ratazanas, ratos, humanos, etc.).
   NOTA: Este passo é realizado por um médico especialista com experiência em cirurgia.
   1. sedar porcos com cetamina intramuscular (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), antes da anestesia é induzida com intramidazolam venoso (0,5 mg / kg, mais atropina 0,02 mg / kg). Manter a anestesia com infusões contínuas intravenosas de propofol (4-8 mg / kg por hora) e fentanilo (30 ug / kg por hora) durante a cirurgia.
2. Mergulhar imediatamente a amostra de tecido em um copo contendo 20 ml de tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocondrial (Tabela 1).
   NOTA: Os tampões utilizados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol.
3. Pesa-se a amostra de tecido no béquer tarado numa balança analítica. Tarar a balança com o copo contendo 20 ml de tampão de isolamento.
4. Colocar o copo em um balde de gelo.
   Observação: executar todos os próximos passos para o processo de homogeneização a uma temperatura de balde de gelo e manter todos os buffers no balde de gelo.
5. Picar o músculo esquelético no copo (manter em gelo) em pequenos pedaços de 1-2 mm para 3-4 min usando sciss finaRUP.
6. Lavar o tecido moído no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo (20 mL de cada passo de lavagem).
7. Suspende-se o tecido em 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), contendo 5 mg de protease / g de tecido.
8. Colocar o copo num banho de gelo sobre o agitador magnético e agitou-se durante 10 min.
9. Dilui-se a suspensão no recipiente com mais 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% (peso / volume) de albumina de soro bovino a desengordurada (BSA).
10. Decantar todo o tampão de isolamento completado com 0,2% de BSA e enxaguar o tecido no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo suplementado com 0,2% de BSA (20 mL de cada passo de lavagem).
11. Ressuspender o tecido em 10 volumes de tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% de BSA com desengordurada.
12. Homogeneizar o tecido com um homogeneizador de vidro semi-automático (mantido em gelo) com um pilão folgada (10 golpes).
    NOTA: HomogenizÊ O tecido sempre da mesma forma (o mesmo número de acidentes vasculares cerebrais, por exemplo, 10 cursos). Um maior número de acidentes vasculares cerebrais podem danificar e desacoplar as mitocôndrias. De um modo preferido, homogeneizar o tecido utilizando um homogeneizador automatizado. Manualmente (e subjetivamente) amostras de tecido homogeneizado em homogeneizadores de vidro podem produzir diferentes qualidades de mitocôndrias isoladas.
13. Centrifugar o tecido homogeneizado a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g.
    NOTA: Todos os passos de centrifugação são realizados em centrífugas com rotores de ângulo fixo.
14. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e ressuspender o sedimento em meio de isolamento arrefecido em gelo suplementado com BSA (10 ml / g de tecido).
15. Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 350 x g.
16. Reservamo-nos o sobrenadante utilizando uma pipeta sorológica e descartar o pellet (restos celulares).
17. Filtra-se o sobrenadante para uma proveta (mantido em gelo) por meio de duas camadas de gaze (17 fios / cm ²⁾ para remover células debré.
18. Centrifugar a suspensão foi filtrada a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
19. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto no tampão de isolamento (5 mL / g de tecido) suplementado com 0,2% (peso / volume) de BSA e centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
20. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem (Tabela 1). Centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
21. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem e centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
22. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em 1,0 ml de tampão de lavagem.
23. Determinar a concentração de proteína da suspensão mitocondrial e manter a suspensão mitocondrial concentrado em gelo.
    NOTA: A concentração de proteína pode ser medido utilizando qualquer método padrão.
24. Somente o interiorpara Respirometria ensaios, ressuspender a suspensão mitocondrial no buffer de respiração para uma concentração final de 0,4 mg de proteína mitocondrial / mL.

2. High-resolution Respirometria

1. Pipetar 2,1 mL de tampão de respiração (Tabela 1) ¹⁶ para dentro de uma câmara de oxygraph de alta resolução e agita-se o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h até que um sinal de fluxo de oxigénio estável de o sensor de oxigénio é obtido polarográfica.
   NOTA: eletrodos de oxigênio Polarográfico dentro de cada câmara oxygraph medir a concentração de oxigênio e calcular o consumo de oxigênio (fluxo) dentro de cada câmara. A concentração de oxigénio e as taxas de consumo de oxigênio (de fluxo) são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados. Além disso, a fim de garantir resultados precisos e fiáveis, oxigénio instrumental correcção de fundo deve serrealizada de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: com exactidão 2,1 ml de tampão de respiração é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas.
2. Executar uma calibração de ar do sensor de oxigénio polarográfico de acordo com os protocolos do fabricante ^17.
   Nota: Durante a calibração do ar, com uma fase de gás presente, a concentração de oxigénio meios irá equilibrar na ordem de 15-20 minutos. Dependendo da temperatura, a pressão barométrica e a solubilidade da concentração dos meios -oxygen pode ser calculada.
3. Após a calibração de ar, aspirar o meio da respiração da câmara oxygraph e adicionar 2,1 ml de suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg de proteína mitocondrial / mL) do passo 1,24 para uma câmara do oxygraph.
   NOTA: O volume de tampão respiração depende do instrumento criado e fabricante. Para respirometria de alta resolução, os 2,1 ml de bu respiraçãoffer é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas.
4. Fechar a câmara de oxygraph por inserção da rolha.
5. Agita-se a suspensão mitocondrial continuamente usando uma barra magnética de agitação presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C e ficha respiração celular na linha de base para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
   NOTA: A concentração de oxigênio e sinal de fluxo de oxigênio são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados ^17.
6. Em seguida, injectar substratos e inibidores para a respiração mitocondrial através dos orifícios de injecção de titânio das rolhas, utilizando os seguintes protocolos padrão.

3. Complexo Respiração-I dependente

1. Prepara-se uma câmara de oxygraph contendo o isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos e 2,1-2,5esperar por um sinal estável.
2. Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
   NOTA: Todas as injeções nas seguintes etapas são realizadas através dos portos de injeção de titânio de rolhas usando seringas.
3. Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e a respiração mitocondrial gravar até que o sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
   NOTA: O planalto da respiração após a adição de ADP indica que a concentração de ADP foi elevada e saturação. Dependendo da quantidade de mitocôndrias utilizados durante a respiração, concentração de ADP deve ser tituladapara um consumo de oxigênio estado 3 estável (respiração máxima). A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração).

4. Respiração II-dependente Complexo

1. Prepara-se uma câmara contendo oxygraph isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nas etapas 2,1-2,5 e esperar por um sinal estável.
2. Injectar 2 mL de rotenona 0,2 mM (0,2 uM) 'CUIDADO "para dentro da câmara oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha de câmara usando uma seringa e gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
   NOTA: rotenona é um veneno perigosa e pode ter um impacto significativo na saúde humana.
3. Injectar 20 mL de 1 M de succinato (10 mM) em CH oxygraphâmbar e registro respiração mitocondrial para 3-5 min até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado.
4. Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar até que a respiração celular sinal aumenta o fluxo de oxigénio, estabiliza, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
   NOTA: A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração).

5. Respiração Complexo-dependentes IV

1. Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável.
2. Em seguida, injectam 2,5 mL de ascorbato 0,8 mM (1 mM). Imediatamente depois injectar 2,5 mL de 0,2H TMPD (0,25 mM) e 10 uL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para dentro da câmara e oxygraph ficha respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza (3-5 min).
3. Finalmente injectar 10 mL de azida de sódio 1 M (5 mM) "CUIDADO" para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigénio e estabiliza.
   NOTA: A azida sódica é um veneno perigoso e pode ter um impacto significativo sobre a saúde humana.

6. citocromo C Teste

1. Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável.
2. Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmarae gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
3. Injectar 10 mL de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha e câmara de registo respiração mitocondrial até sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
4. Finalmente, injectar 5 mL de 4 mM de citocromo c (10 pM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.

Resultados

Complexo I-dependente respiração

Taxas isoladas complexo mitocondrial dependente da I respiratórias (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 1, um diagrama representativo). substratos complexo I mitocondrial, glutamato e malato, são adicionados, seguidos pela adição de ADP. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de só os...

Discussão

No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar de alta qualidade, intactas e fortemente acoplados mitocôndrias do músculo esquelético através de centrifugação diferencial, que podem ser utilizadas para estudos funcionais tais como ventilometria de alta resolução.

Para isolar mitocôndrias intactas e fortemente acoplados, há alguns pontos críticos a serem considerados no presente protocolo. Após a colheita do tecido esquelético, deve ser imediatamente imersas em tam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical