L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Riepilogo

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduzione

bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione.

Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tessuti è stato introdotto da Pallade e collaboratori quasi 70 anni fa ^1. Il tessuto viene prima tritata con le forbici e omogeneizzato meccanicamente in un omogeneizzatore di vetro con un pestello larghi. Successivamente l'omogenato viene centrifugato a bassa velocità e il pellet risultante che contiene tessuto ininterrotta, cellulardetriti e nuclei viene scartato. Poi, il surnatante viene centrifugato più volte ad alta velocità e la frazione arricchita mitocondriale viene raccolta. I vantaggi del metodo differenziale centrifugazione per isolare i mitocondri sono che: i) il metodo è veloce e mitocondri può essere isolato all'interno 1-1,5 h (esperimenti respiratorie devono essere eseguite più velocemente possibile); ii) è poco costoso; e iii) è molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale sono abbastanza puro per analisi respirometria. Gli svantaggi di metodo centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri sono che i) i mitocondri possano venire danneggiati e sganciato durante l'omogeneizzazione; ii) la contaminazione dei mitocondri con altri componenti cellulari (potrebbe essere risolto ulteriore lavaggio del pellet mitocondriale con fasi di centrifugazione accessorie); iii) la possibilità di selezionare differenti sottopopolazioni mitocondriali, per esempio, durante centrifugazioni differenziali gradini, mitochondria con denso inferiore può essere esclusa ^7; e iv) l'mitocondriale circostante cellulare è mancante e solo la respirazione massimo teorico può essere misurata. Un altro metodo per isolare mitocondri per i saggi respirometria è il gradiente di centrifugazione densità ^2. In questa tecnica, l'estratto tissutale è stratificato su una soluzione di saccarosio o un gradiente Percoll (con densità maggiore nella parte inferiore del tubo di centrifugazione) e centrifugati a una certa velocità, causando i mitocondri essere isolati da altri componenti cellulari secondo la loro densità. Questo metodo viene spesso utilizzato per isolare i mitocondri cerebrali con molto bassa contaminazione da sinaptosomi. Tuttavia, i mitocondri di fegato di ratto isolati dal gradiente di densità centrifugazione sono altamente contaminati con altri organelli cellulari ^3. Uno dei limiti di questo metodo è che il gradiente di saccarosio presente nel tubo di centrifugazione può rompersi cosìMi mitocondri (shock osmotico).

A seconda del tipo di tessuto; ci sono alcuni fattori importanti da considerare per l'isolamento dei mitocondri intatti mediante centrifugazione differenziale. La prima necessità è di omogeneizzare i tessuti in un modo delicato. I tessuti molli come il rene, cervello e fegato richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l'omogeneizzazione. Questo contrasta con i tessuti duri come il muscolo cardiaco e scheletrico che richiedono forze meccaniche molto più forti. Il tessuto tritato è di solito trattato con proteinasi prima della omogeneizzazione per ammorbidire i tessuti. Tutti i buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione devono essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citosol ^{4, 5.}

Uno dei vantaggi di studiare isolato bioenergetica mitocondriale è che le membrane plasmatiche cellulari non devono essere permeabilitàzato con detergenti quali digitonina o saponina ^{4, 6,} che potrebbero compromettere l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Un altro vantaggio del mitocondri isolati è l'assenza di altri fattori citosolici, che possono interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno. Gli svantaggi di usare mitocondri isolati sono possibili selezione di alcune popolazioni mitocondriali durante le fasi di centrifugazione, danni ai mitocondri durante l'omogeneizzazione, e la necessità di elevate quantità di campioni biologici per ottenere una buona resa di mitocondri isolati ^{7, 8.}

Dopo la procedura di isolamento, la frequenza respiratoria dei complessi mitocondriali I-, II- e IV-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per complesso I-guidato la respirazione, il glutammatoe malato sono aggiunti seguito da adenosina difosfato (ADP). Per complesso respirazione II-driven, succinato è aggiunto seguito da ADP. Per complesso IV-driven respirazione, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) sono aggiunti seguiti da ADP ^{9, 10, 11, 12.} Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza di substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l'esaurimento ADP. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è un indice di accoppiamento della produzione di ATP consumo di ossigeno e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e 4 dello stato ^{13, 15.}

In sintesi, si descrive un protocollo per isolare i mitocondri dei muscoli scheletrici e funzionali intatti per centrifugazione differenziale e utilizzare questi isolati mitochondria per studi funzionali e bioenergetici, come ad alta risoluzione respirometria.

Protocollo

La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera.

1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitocondriale

1. Excise 5-10 esemplare g muscolo quadricipite da un maiale anestetizzato. Nel presente saggio, usare muscolo scheletrico suina. Questo protocollo può anche essere utilizzata per isolare mitocondri da altre specie (ad esempio, ratti, topi, umano, ecc.).
   NOTA: Questa fase viene eseguita da un medico specialista con esperienza in chirurgia.
   1. maiali sedare con ketamina intramuscolare (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), prima dell'anestesia è indotta con intramidazolam venosa (0,5 mg / kg, più atropina 0,02 mg / kg). Mantenere l'anestesia con continue infusioni endovenose di propofol (4-8 mg / kg per h) e fentanyl (30 mg / kg per h) durante l'intervento chirurgico.
2. Immergere immediatamente il campione di tessuto in un becher contenente 20 mL di tampone isolamento mitocondriale ghiacciata (Tabella 1).
   NOTA: buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione dovrebbe essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citoplasma.
3. Pesare il campione di tessuto nel becher su una bilancia analitica tarato. La tara con becher contenente 20 mL di tampone di isolamento.
4. Porre il bicchiere in un secchio di ghiaccio.
   NOTA: eseguire tutti i passi successivi per la procedura di omogeneizzazione alla temperatura secchiello del ghiaccio e mantenere tutti i buffer sul secchiello del ghiaccio.
5. Tritare il muscolo scheletrico nel bicchiere (tenere in ghiaccio) in 1-2 mm piccoli pezzi per 3-4 minuti utilizzando SCISS beneors.
6. Risciacquare il tessuto tritato nel bicchiere due volte con ghiaccio buffer di isolamento a freddo (20 ml ciascuna fase di lavaggio).
7. Sospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) contenente 5 mg proteasi / g di tessuto.
8. Porre il becher in un bagno di ghiaccio sulla agitatore magnetico e agitare per 10 min.
9. Diluire la sospensione nel becher con ulteriori 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% (peso / volume) di albumina di siero bovino sgrassata (BSA).
10. Decantare tutto il buffer di isolamento integrato con 0,2% BSA e sciacquare il tessuto nel becher due volte con tampone di ghiaccio freddo isolamento integrato con 0,2% BSA (20 mL ciascuna fase di lavaggio).
11. Risospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% BSA sgrassata.
12. Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore di vetro semi-automatico (tenuti in ghiaccio) con un pestello larghi (10 colpi).
    NOTA: Homogenizall'e tessuto sempre nello stesso modo (lo stesso numero di colpi, ad esempio, 10 colpi). Un numero maggiore di colpi può danneggiare e disaccoppiare i mitocondri. Preferibilmente, omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore automatizzato. Manualmente (e soggettivamente) campioni di tessuto omogeneizzati in omogeneizzatori di vetro possono produrre diverse qualità di mitocondri isolati.
13. Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 4 ° C per 10 min a 10.000 x g.
    NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite in centrifughe con rotori ad angolo fisso.
14. Eliminare il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere il pellet in terreno di isolamento ghiacciata BSA-integrato (10 ml / g di tessuto).
15. Centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 350 x g.
16. Prenotate il surnatante con una pipetta sierologica e scartare il pellet (detriti cellulari).
17. Filtrare il surnatante in un becher (tenuti in ghiaccio) attraverso due strati di garza (17 fili / cm ²⁾ per rimuovere DEBR celluleè.
18. Centrifugare la sospensione filtrata a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
19. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale grezzo nel buffer di isolamento (5 mL / g di tessuto) supplementato con 0,2% (peso / volume) BSA e centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
20. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio (tabella 1). Centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
21. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio e centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
22. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio in 1,0 ml di tampone di lavaggio.
23. Determinare la concentrazione proteica della sospensione mitocondriale e mantenere la sospensione mitocondriale concentrata su ghiaccio.
    NOTA: la concentrazione di proteine ​​può essere misurata con qualsiasi metodo standard.
24. Appena primaper Respirometria saggi, risospendere la sospensione mitocondriale nel buffer respirazione ad una concentrazione finale di 0,4 mg mL proteine ​​/ mitocondriale.

2. ad alta risoluzione respirometria

1. Pipettare 2.1 mL di tampone respirazione (Tabella 1) ¹⁶ in una camera oxygraph ad alta risoluzione e mescolare il buffer continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C per 1 h fino a quando un segnale di ossigeno flusso stabile di il sensore di ossigeno polarografico si ottiene.
   NOTA: gli elettrodi di ossigeno polarografici all'interno di ciascuna camera oxygraph misurano la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno (flusso) all'interno di ciascuna camera. La concentrazione di ossigeno e tassi di consumo di ossigeno (flusso) sono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Inoltre, al fine di garantire risultati accurati e affidabili, ossigeno strumentale correzione del fondo dovrebbe essereeseguite in conformità alle istruzioni del produttore.
   NOTA: Accurato 2.1 mL di tampone di respirazione viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi.
2. Eseguire una taratura dell'aria del sensore di ossigeno polarografico secondo protocolli ¹⁷ del produttore.
   NOTA: Durante la taratura dell'aria, con una fase gassosa presente, la concentrazione di ossigeno media sarà equilibrare dell'ordine di 15-20 min. A seconda della temperatura, pressione barometrica, e la solubilità della concentrazione dei media -oxygen può essere calcolato.
3. Dopo la calibrazione dell'aria, aspirare il terreno respirazione dalla camera oxygraph e aggiungere 2,1 ml di sospensione mitocondriale isolata (0,4 mg / ml proteina mitocondriale) dal passaggio 1,24 a una sezione del oxygraph.
   NOTA: Il volume di tampone respirazione dipende dallo strumento impostare e produttore. Per respirometria alta risoluzione, i 2,1 ml di bu respirazioneffer viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi.
4. Chiudere la camera oxygraph mediante inserimento del tappo.
5. Mescolare la sospensione mitocondriale continuo mediante una barra magnetica agitazione presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C e registrare la respirazione cellulare al basale per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
   NOTA: la concentrazione di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno vengono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati ^17.
6. Successivamente, iniettare substrati e inibitori della respirazione mitocondriale attraverso i fori di iniezione di titanio dei tappi utilizzando i seguenti protocolli standard.

3. Complesso respirazione I-dipendente

1. Preparare una camera oxygraph contenente la sospensione isolata mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 eattendere un segnale stabile.
2. Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camera ed registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
   NOTA: Tutte le iniezioni nei seguenti operazioni vengono eseguite attraverso i fori di iniezione titanio di tappi che utilizzano siringhe.
3. Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione mitocondriale fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
   NOTA: L'altopiano della respirazione dopo l'aggiunta di ADP indica che la concentrazione di ADP era alto e saturazione. A seconda della quantità di mitocondri utilizzati durante la respirazione, concentrazione ADP deve essere titolatoper uno stato 3 il consumo di ossigeno stabile (respirazione massima). L'aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l'ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione).

4. Complesso respirazione II-dipendente

1. Preparare una camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 e attendere un segnale stabile.
2. Iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 pM) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo della camera con una siringa e registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto.
   NOTA: Rotenone è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana.
3. Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mm) nel ch oxygraphambra e registrare la respirazione mitocondriale per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile si ottiene.
4. Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione cellulare fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, stabilizza, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
   NOTA: L'aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l'ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione).

5. Complesso respirazione IV-dipendente

1. Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile.
2. Poi iniettare 2,5 ml di 0,8 mm ascorbato (1 mm). Subito dopo l'iniezione di 2,5 ml di 0,2M TMPD (0,25 mM) e 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza (3-5 min).
3. Infine iniettare 10 ml di 1 M sodio azide (5 mm) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
   NOTA: Sodio azide è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana.

6. citocromo C test

1. Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile.
2. Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camerae registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
3. Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo camera e registrare respirazione mitocondriale fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
4. Infine, iniettare 5 ml di 4 mM citocromo c (10 pM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

Risultati

Complesso I-dipendente respirazione

Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l'aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in pres...

Discussione

Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria.

Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all'interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical