איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs noncoding קטנים המווסת את הביטוי RNA שליח הודעה שלאחר transcriptionally. פרופיל הביטוי miRNA נחקרה באיברים ורקמות שונים בעכברוש. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור miRNAs וזיהוי הביטוי שלהם בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. פיתחנו שיטה יעילה ואמינה לטהר לכמת miRNAs באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז (qRT-PCR) בממברנה פריטוניאלית עכברוש. פרוטוקול זה מורכב של ארבעה שלבים: 1) טיהור מדגם קרום פריטוניאלי; 2) טיהור של RNA הכולל כולל מירנה מדגם הממברנה פריטוניאלית; 3) שעתוק לאחור של מירנה לייצר cDNA; ו 4) qRT-PCR כדי לגלות ביטוי מירנה. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו בהצלחה כי הביטוי של miRNAs שישה (מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p) גדלבאופן מובהק בממברנה הצפקית של מודל חולשת הצפק של העכברוש בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של חולדות בתנאים פתולוגיים רבים.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) הם קצרים, RNAs לא קידוד כי שלאחר transcriptionally לווסת את השליח RNA (mRNA) ביטוי ¹ . שינויים בביטוי של miRNAs להסדיר את הביטוי של mRNAs רבים אשר ממלאים תפקידים מרכזיים במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, דלקות, הפרעות מטבוליות, ו פיברוזיס ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . לכן, miRNAs יש פוטנציאל כמו ביומרקרים חדשים ומטרות טיפוליות ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . פרופיל הביטוי miRNA נקבע בעכברוש שוניםאיברים ורקמות, כולל כבד, לב, ריאה וכליות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור וזיהוי של miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא בהצלחה לטהר ולזהות miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש. ראשית, מדגם הממברנה הצפק היה homogenized באמצעות homogenizer זכוכית, ואחריו חשיפה למערכת biopolymer רטוש בעמודה microcentrifuge ספין ¹⁰ . לאחר מכן, סך כולל RNA כולל miRNA היה מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית באמצעות עמודה סיליקה מבוסס קרום סיליקה ¹⁰ . לאחר מכן, cDNA היה מסונתז מן RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל ¹¹ . לבסוף, הביטוי של מירנה נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating ¹¹ . הרציונל של פרוטוקול זה הוא בכמו על מחקרים קודמים שהראו טיהור משמעותי וזיהוי של מירנה ברקמות על ידי תהליך פשוט ^{8 , 10 , 11} . זה כבר דיווח כי השימוש במערכת biopolymer-רטוש בעמודה microcentrifuge ספין סיליקה קרום מבוסס ספין טור יכול לטהר באיכות גבוהה RNA סך מ רקמות ¹⁰ . השיטה של ​​סינתזה cDNA מ RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (א), ו אוליגו dT תחל, ואת השיטה של ​​גילוי ביטוי מירנה על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating בפרוטוקול זה דווחו כדי להראות דיוק גבוהה רגישות ¹¹ . בנוסף, זהו תהליך פשוט, אשר חוסך זמן ומונע שגיאות טכניות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי מדויק ורגיש מאוד של מירנה בממברנה פריטוניאלית עכברוש במגוון רחב של תנאים פתולוגיים.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת Jichi רפואי ונערכו בהתאם לשימוש וטיפול של הנחיות לבעלי חיים ניסיוניים מן Jichi Medical University Guide עבור חיות מעבדה.

1. פריטוניום אוסף דוגמאות

1. לאסוף את הפריטים הבאים: 50 צנטריפוגות צינור מ"ל עם כותנה ספוג ב isoflurane, גיליון הפקק, צלחת פטרי עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מספריים כירורגי, מלקחיים.
2. להרדים חולדה עם מנת יתר של isofluorane, ולאחר מכן לרסס את העור הבטן של החולדה עם אתנול 70%, ואת הרם חולדה על גיליון השעם על גבו.
3. בצע חתך אורכי של העור הבטן, שריר, הממברנה פריטוניאלית באמצעות מספריים ו מלקחיים.
4. להרים את הממברנה פריטוניאלית באמצעות מלקחיים, ולעשות חתכים אופקיים על החלק העליון שלה לאורך עצם הצלע הנמוך ביותר מתחת לסרעפת ועל l שלהצד ower על האזור לרוחב באמצעות מספריים כירורגית. לאחר מכן, לבצע חתכים אורך לרוחב כדי להסיר את הממברנה פריטוניאלית מהגוף באמצעות מספריים כירורגיים. לאחר מכן, לשטוף אותו עם PBS בצלחת פטרי.
5. לחתוך ולקצץ 20 מ"ג (3-5 מ"מ ² ) של דגימות קרום פריטוניאלי, אשר מתאים בגודל הצעדים הבאים, באמצעות מספריים כירורגי ומלקחיים.

2. מטהר RNAs סך דגימות ממברנה פריטוניאלית

הערה: הנה, דגימות הממברנה פריטוניאלית במשקל 20 מ"ג הם homogenized באמצעות homogenizer זכוכית מערכת biopolymer רטוש בעמודה ספין microcentrifuge. לאחר מכן, RNA הכולל מדגם הממברנה הצפק מבודד באמצעות טור ספין סיליקה מבוססי קרום.

1. אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 או 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge, אתנול 100%, כלורופורם, homogenizer זכוכית, קרח, biopolymer-רטוש מערכת בעמודה ספין microcentrifuge ¹⁰ 10 , פנול / guanidine מבוסס מגיב תמוגה, לשטוף חיץ כולל guanidine ואתנול (לשטוף חיץ 1), וכן לשטוף חיץ כולל אתנול (לשטוף חיץ 2).
2. שים 20 מ"ג מדגם קרום פריטוניאלית לתוך homogenizer זכוכית ולהוסיף 700 μL של מגיב תמוגה פנול / guanidine.
3. Homogenize דגימת הממברנה הצפק על ידי לחיצה איטית על העלי על המדגם עם פיתול. חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים על הקרח עד דגימת הממברנה פריטוניאלית יש מומס לחלוטין לתוך מגיב תמוגה פנול / guanidine.
4. לקבלת homogenization נוספת, העברת lysate homogenized כדי biopolymer-רטוש המערכת בעמודה ספין microcentrifuge ב 2.0 צינור מ"ל. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 14,000 במשך 3 דקות ב 4 ° C.
5. מעבירים את lysate הומוגני לצינור microcentrifuge חדש.
6. הוסף 140 μL של כלורופורם כדי lysate הומוגני ואת מכסה את האמבט. לאחר מכן, לערבב את הצינור על ידי היפוך במשך 15 s.
7. דגירה הדגימות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, צנטריפוגה אותם XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
8. מעבירים את supernatant (בדרך כלל 300 μL) לצינור microcentrifuge חדש מבלי להפריע את המשקע, ולהוסיף 1.5x נפח שלה (בדרך כלל 450 μL) של אתנול 100%. לאחר מכן, לערבב את המדגם על ידי vortexing עבור 5 s.
9. פיפטה עד 700 μL של המדגם לתוך עמודה ספין מבוסס סיליקה סיליקה ממוקם צינור 2.0 מ"ל אוסף. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
10. הוסף 700 μL של חיץ לשטוף 1 לעמוד סיליקה מבוססי קרום סיליקה לשטוף בחום את המדגם. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
11. הוסף 500 μL של חיץ לשטוף 2 סיליקה- membRane מבוסס ספין טור להסיר כל זכר של מלח. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
12. חזור על 2.11.
13. צנטריפוגה סיליקה קרום מבוסס ספין טור שוב ב XG 15,000 במשך 1 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
14. מניחים את סיליקה קרום מבוסס ספין טור ב צינור 1.5 מ"ל חדש אוסף. לאחר מכן, העברת 25 μL של מים חינם RNase לתוך העמודה. סגור את מכסה העמודה. השאירו את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 15,000 במשך 1 דקות.
15. מעבירים את eluate 25 μL המכיל RNA הכולל לצינור microcentrifuge חדש. לאחר מכן, לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. הפוך שעתוק של RNA סך

הערה: הפניה ודבקות המידע המינימלי לפרסום כמותי בזמן אמת PCR מומחה(IMQ) הנחיות מעודדות תרגול טוב יותר ועזרה בהשגת תוצאות אמינות וחד משמעיות ¹² .
הערה: כאן, סך של 1.0 מיקרוגרם של רנ"א מבודד הוא transcript לאחור באמצעות transcriptase לאחור, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל.

1. אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות; שמונה צינורות שפופרת היטב; מים נטולי RNase; קֶרַח; ערכת transcriptase לאחור (ראה טבלת חומרים) ¹¹ .
2. הכן פתרון לערבב מאסטר המכיל 2.0 μL של תערובת חומצה גרעין 10x, 2.0 μL של תמהיל transcriptase הפוך (מתוך הערכה), ו 4.0 μL של חיץ 5x Hi-spec עבור סכום כולל של 8.0 μL לכל צינור.
3. לוותר 8.0 μL של פתרון לערבב הורים (מן הערכה) לתוך כל צינור.
4. למדוד את כמות RNAs הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. הוסף 1.0 מיקרוגרם של RNAs סך מבודדים מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית לכל צינור.
   הערה: qRT-PCR עשוי להתבצע usiNg סך RNAs כתבנית ללא שעתוק לאחור עבור בקרת איכות של RNAs סך מטוהרים. אם כל DNA הוא מזוהם, מוצרים הגברה בלתי צפויות נצפים על ידי qRT-PCR.
5. הוסף מים RNase חינם לכל צינור כדי סך של 20 μL. לאחר מכן, לערבב היטב על ידי pipetting ו צנטריפוגה זה 15 s.
6. דגירה הדגימות למשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מיד דגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלב זה יכול להתבצע ב cycler תרמי.
7. העברת cDNA לצינור microcentrifuge חדש לדלל עשר פעמים (1:10) עם מים ללא RNase.
8. חנות cDNA מדולל על קרח באופן זמני, ב -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך לפני השימוש.

4. qRT-PCR של מירנה

הערה: qRT-PCR של מירנה מבוצעת באמצעות צבע intercalating. הנה, primers עבור רנ"א, U6 קטן גרעיני 2 (RNU6-2), מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו מירנה -34a-5p שומשו.

1. לאסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, 96-גם צלחת תגובה עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור 96-גם תגובה צלחת, מירנה ספציפיים primers, צבע ירוק מבוסס PCR Kit (ראה טבלה חומרים) ¹¹ , בזמן אמת PCR כלי.
2. הכן תערובת אב המכיל μL 12.5 של תערובת 2x PCR מאסטר, 2.5 μL של 5 מיקרומטר כל פריימר מירנה מומס במים nuclease חינם, ו 1.25 μL של תחל אוניברסלי 10x עבור כל טוב.
3. לוותר על 22.5 μL של תערובת אב לתוך היטב כל צלחת 96-היטב.
4. הוסף 2.5 μL של cDNA תבנית היטב כל אחד.
5. חותם את הצלחת עם סרט דבק עבור 96-גם צלחת התגובה. ואז, צנטריפוגה צלחת ב 1000 xg במשך 30 s.
6. הפעל את תוכנית רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת PCR כלי ותוכנה כדלקמן.
   1. הגדר את הצלחת בזמן אמת מכשיר ה- PCR. בזמן אמת תוכנה PCR, להגדיר מאפיינים ניסיוניים (קלט ניסיונישם, לבחור "96 בארות" עבור סוג הניסוי של המכשיר, לבחור "2 ^- שיטת ^ΔΔCT " עבור שיטת quantitation, בחר "SYBR ריאגנטים ירוקים" עבור מגיב כדי לזהות את רצף היעד, לבחור "מהירות כבש רגילה" עבור הפעלת מכשיר).
   2. לאחר מכן, להקצות שמות לדגימות miRNAs היעד בכל טוב. דוגמאות נבדקות תמיד כפולים או בשלושה עותקים כדי לקבל מספיק נתונים לאימות התוצאות. בחר מדגם התייחסות ובקרה אנדוגנית. בחר "ללא" עבור צבע להשתמש כהפניה פסיבית.
   3. קלט נפח התגובה של "20 μL" ואת התנאים הבאים רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת התוכנה PCR בהתאם להוראות: פרינקובציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות , חישול על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וכן הרחבה ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
7. ניתוח נתונים qRT-PCR uלשיר את התוכנה של מכשיר ה- PCR בזמן אמת. ודא כי סף הבסיס אשר נקבעים באופן אוטומטי על ידי התוכנה מתאימים כל טוב.
8. בדוק את מחזור הסף של miRNAs היעד בכל מדגם. מחזור הסף הוא הצומת בין עקומת הגברה לקו סף. ואז, לנרמל את רמת הביטוי של miRNAs היעד נגד RNU6-2 כבקרה אנדוגני, ולחשב את רמת הביטוי היחסי של miRNAs היעד באמצעות שיטה 2 ^{- ΔΔCT 13} .
   הערה: יצוין כי היציבות של רמת הביטוי של מירנה בקרה אנדוגני צריך להיות מאומת. בניסוי זה, RNU6-2 אושר להתבטא ברמה גבוהה יחסית קבוע לאורך כל קבוצה.

תוצאות

התוצאות המוצגות כאן מבוססות על המחקר הקודם שלנו ⁸ . חקרנו את פרופיל הביטוי מירנה ב fibrois פריטוניאלי. סיבוך פריטוניאלי הוא סיבוך גדול בדיאליזה פריטונאלית. זה מאופיין על ידי אובדן monolayer התא mesothelial ואת הצטברות עודף של מרכיבי מטריקס תאיים, והו...

Discussion

באמצעות פרוטוקול המוצג בכתב היד הזה, miRNAs בקרום עכברוש עכברוש טוהרו בהצלחה זוהה באמצעות qRT-PCR. האמינות של ניתוח נתונים qRT-PCR תלוי באיכות של miRNAs מטוהרים. לכן, טוהר miRNAs ניתן לבדוק לפני qRT-PCR על ידי היחס של ספיגת ב 260 ננומטר לזה ב 280 ננומטר, אשר ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign