Détection de l'expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en transcription inverse quantitative en temps réel. Cette méthode est appropriée pour étudier le profil d'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat dans plusieurs états pathologiques.

Résumé

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression de l'ARN messager après la transcription. Le profil d'expression des miARN a été étudié dans divers organes et tissus chez le rat. Cependant, les méthodes standard pour la purification des miARN et la détection de leur expression dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies. Nous avons développé une méthode efficace et fiable pour purifier et quantifier les miARN en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR) dans une membrane péritonéale de rat. Ce protocole comporte quatre étapes: 1) purification de l'échantillon de membrane péritonéale; 2) purification de l'ARN total, y compris le miARN provenant de l'échantillon de membrane péritonéale; 3) transcription inverse du miRNA pour produire de l'ADNc; Et 4) qRT-PCR pour détecter l'expression de l'ARNm. En utilisant ce protocole, nous avons déterminé avec succès que l'expression de six miARN (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p) augmentaientDe manière significative dans la membrane péritonéale d'un modèle de fibrose péritonéale de rat par rapport à ceux des groupes témoins. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le profil de l'expression de l'ARNm dans la membrane péritonéale des rats dans de nombreux états pathologiques.

Introduction

Les microARN (ARNm) sont des ARN courts et non codants qui post-transcriptionnellement régulent l'expression de l'ARN messager (ARNm) ¹ . Les changements dans l'expression des miARN régulent l'expression de nombreux ARNm qui jouent des rôles essentiels dans diverses conditions pathologiques, y compris le cancer, l'inflammation, les troubles métaboliques et la fibrose ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Par conséquent, les miARN possèdent du potentiel comme nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Le profil d'expression des miARN a été déterminé en plusieurs ratsOrganes et tissus, y compris le foie, le cœur, les poumons et les reins ⁹ . Cependant, les méthodes standard pour la purification et la détection des miARN dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies.

L'objectif global de ce protocole est de purifier avec succès et de détecter les miARN dans la membrane péritonéale du rat. Tout d'abord, l'échantillon de membrane péritonéale a été homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur de verre, suivi d'une exposition à un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse ¹⁰ . Ensuite, l'ARN total comprenant le miARN a été purifié à partir de l'échantillon de membrane péritonéale en utilisant une colonne de spin à base de silice ¹⁰ . Ensuite, l'ADNc a été synthétisé à partir de l'ARN total purifié en utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT ¹¹ . Enfin, l'expression de miRNA a été déterminée par qRT-PCR en utilisant un colorant intercalaire ¹¹ . La logique de ce protocole est bSur les études antérieures qui ont montré une purification et une détection significatives du miARN dans les tissus par un procédé simple ^{8 , 10 , 11} . Il a été rapporté que l'utilisation d'un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse et une colonne de spin à base de silice peut purifier l'ARN total de haute qualité des tissus ¹⁰ . Le procédé de synthèse d'ADNc à partir d'ARN total purifié utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT, et la méthode de détection de l'expression de l'IRAR par qRT-PCR utilisant un colorant intercalaire dans ce protocole ont été signalés pour montrer une grande précision et Sensibilité ¹¹ . De plus, il s'agit d'un processus simple qui permet d'économiser du temps et empêche toute erreur technique. Par conséquent, ce protocole est utile dans les études nécessitant une détection très précise et sensible du miARN dans la membrane péritonéale des rats dans un large éventail de pathologies.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux d'animaux ont été approuvés par le comité d'éthique animale de l'Université médicale de Jichi et ont été effectués conformément aux directives sur l'utilisation et l'entretien des animaux expérimentaux du Guide de l'Université médicale de Jichi pour les animaux de laboratoire.

1. Collection d'échantillons de péritoine

1. Recueillir les éléments suivants: tube de centrifugation de 50 ml avec du coton trempé dans de l'isoflurane, de la feuille de liège, de la boîte de Petri avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS), des ciseaux chirurgicaux et des pinces.
2. Éuthaniser un rat avec un surdosage d'isofluorane, puis pulvériser la peau abdominale du rat avec 70% d'éthanol, et monter le rat sur la feuille de liège sur le dos.
3. Faire une incision longitudinale dans la peau, les muscles et la membrane péritonéale à l'aide des ciseaux et des pinces.
4. Prenez la membrane péritonéale à l'aide de la pince et faites des incisions horizontales sur sa partie supérieure le long de l'os de côtes le plus bas sous le diaphragme et sur son lDe l'autre côté de la région latérale à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, faites des incisions longitudinales latérales pour enlever la membrane péritonéale du corps à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Puis, laver avec du PBS dans une boîte de Petri.
5. Découpez et coupez 20 mg (3-5 mm ² ) d'échantillons de membrane péritonéale, qui est une taille appropriée pour les étapes suivantes, en utilisant les ciseaux chirurgicaux et la pince.

2. ARN total purifiant des échantillons de membrane péritonéale

REMARQUE: Ici, des échantillons de membrane péritonéale pesant 20 mg sont homogénéisés à l'aide d'un homogénéisateur de verre et d'un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugation. Ensuite, l'ARN total provenant de l'échantillon de membrane péritonéale est isolé à l'aide d'une colonne de spin à base de silice.

1. Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ou 2,0 ml, éthanol à 100%, chloroforme, homogénéisateur de verre, glace, système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugeuse ¹⁰ Colonne de spin à base de silice ¹⁰ , réactif de lyse à base de phénol / guanidine, tampon de lavage comprenant de la guanidine et de l'éthanol (tampon de lavage 1) et un tampon de lavage comprenant l'éthanol (tampon de lavage 2).
2. Mettez un échantillon de 20 mg de membrane péritonéale dans un homogénéisateur de verre et ajoutez 700 μL du réactif de lyse à base de phénol / guanidine.
3. Homogénéiser l'échantillon de membrane péritonéale en appuyant lentement sur le pilon sur l'échantillon avec une torsion. Répétez ce processus plusieurs dizaines de fois sur de la glace jusqu'à ce que l'échantillon de membrane péritonéale soit complètement dissous dans le réactif de lyse à base de phénol / guanidine.
4. Pour une autre homogénéisation, transférer le lysat homogénéisé dans le système de déchiquetage des biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugeuse dans un tube de collecte de 2,0 mL. Ensuite, centrifuger à 14 000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
5. Transférer le lysat homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
6. Ajouter 140 μL de chloroforme au lysat homogénéisé et capter le bainE en toute sécurité. Ensuite, mélanger le tube par inversion pendant 15 s.
7. Incuber les échantillons pendant 2 à 3 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
8. Transférer le surnageant (généralement 300 μL) à un nouveau tube de microcentrifugeuse sans perturber le précipité et ajouter 1,5x son volume (habituellement 450 μl) d'éthanol à 100%. Ensuite, mélanger l'échantillon par vortexage pendant 5 s.
9. Pipeter jusqu'à 700 μl de l'échantillon dans une colonne de spin à base de silice placée dans un tube de collecte de 2,0 ml. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
10. Ajouter 700 μL de tampon de lavage 1 à la colonne de spin à base de silice pour laver soigneusement l'échantillon. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
11. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 2 à la silice-membColonne de spin basée sur le rane pour éliminer toute trace de sel. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
12. Répétez 2.11.
13. Centrifuger à nouveau la colonne de spin à base de silice à 15 000 xg pendant 1 min. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
14. Placez la colonne de spin à base de silice dans un nouveau tube de collecte de 1,5 ml. Ensuite, transférer 25 μL d'eau sans RNase dans la colonne. Fermez le cap de la colonne. Laisser l'échantillon à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 1 min.
15. Transférer l'éluat de 25 μL contenant l'ARN total à un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ensuite, rangez-le à -80 ° C avant utilisation.

3. Transcription inverse de l'ARN total

REMARQUE: Référence et respect de l'information minimale pour la publication de l'expérience quantitative PCR en temps réel(MIQE) encouragent une meilleure pratique et contribuent à obtenir des résultats fiables et sans équivoque ¹² .
NOTE: Ici, un total de 1,0 pg d'ARN isolé est transcrit en inverse en utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT.

1. Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL; Tubes à bande à huit puits; Eau exempte de RNase; la glace; Kit de transcriptase inverse (voir tableaux de matériaux) ¹¹ .
2. Préparez une solution de mélange maître qui contient 2,0 μL de mélange d'acide nucléique 10x, 2,0 μL de mélange de transcriptase inverse (à partir du kit) et 4,0 μL de 5x tampon hi-spec pour un total de 8,0 μL par tube.
3. Distribuer 8,0 μL de solution de mélange maître (du kit) dans chaque tube.
4. Mesurer la quantité d'ARN total en utilisant un spectrophotomètre. Ajouter 1,0 μg d'ARN totals isolés purifiés à partir de l'échantillon de membrane péritonéale à chaque tube.
   REMARQUE: qRT-PCR peut être effectué usiNg ARN total en tant que modèle sans transcription inverse pour le contrôle de la qualité des ARN totalisés purifiés. Si un ADN est contaminé, des produits d'amplification inattendus sont observés par qRT-PCR.
5. Ajouter de l'eau exempte de RNase à chaque tube pour un total de 20 μL. Ensuite, mélanger soigneusement en pipetant et centrifuger pendant 15 s.
6. Incuber les échantillons pendant 60 min à 37 ° C. Incuber immédiatement pendant 5 min à 95 ° C.
   REMARQUE: Cette étape peut être effectuée dans un thermocoupleur.
7. Transférer l'ADNc sur un nouveau tube de microcentrifugeuse et diluer dix fois (1:10) avec de l'eau exempte de RNase.
8. Rangez l'ADNc dilué sur glace temporairement et à -80 ° C pour un long terme avant utilisation.

4. qRT-PCR de miARN

NOTE: qRT-PCR de miARN est effectué en utilisant un colorant intercalaire. Ici, amorces pour l'ARN, U6 petit nucléaire 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p ont été utilisées.

1. Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL, plaque de réaction de 96 puits pour qRT-PCR, film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits, amorces spécifiques à l'ARNm, kit de PCR à base de colorant vert (voir tableau de matériaux) ¹¹ et un Instrument de PCR en temps réel.
2. Préparez un mélange maître contenant 12,5 μL de mélange principal de PCR 2x, 2,5 μL de 5 μM chaque amorce miARN dissous dans de l'eau exempte de nuclease et 1,25 μl d'amorce universelle 10x pour chaque puits.
3. Dispenser 22,5 μL de mélange maître dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
4. Ajouter 2,5 μl d'ADNc modèle à chaque puits.
5. Sceller la plaque avec un film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits. Ensuite, centrifuger la plaque à 1000 xg pendant 30 s.
6. Exécutez le programme de cyclage PCR avec l'instrument et le logiciel de PCR en temps réel comme suit.
   1. Réglez la plaque dans l'instrument de PCR en temps réel. Dans le logiciel de PCR en temps réel, définissez les propriétés expérimentales (entrée expérimentaleNom, choisissez "96 puits" pour le type d'instrument expérimental, choisissez "méthode 2 ^{- ΔΔCT} " pour la méthode de quantification, choisissez "réactifs verts SYBR" pour que le réactif détecte la séquence cible, choisissez "vitesse de rampe standard" pour Instrument exécuté).
   2. Ensuite, attribuez les noms aux échantillons et ciblez les ARNm dans chaque puits. Les échantillons sont toujours testés en double ou en triple pour obtenir suffisamment de données pour la validation des résultats. Sélectionnez l'échantillon de référence et le contrôle endogène. Sélectionnez "none" pour que le colorant soit utilisé comme référence passive.
   3. Entrer un volume de réaction de "20 μL" et les conditions de cyclage de PCR suivantes dans le logiciel de PCR en temps réel conformément aux instructions: préincubation à 95 ° C pendant 15 min, puis 40 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 15 s , Recuit à 55 ° C pendant 30 s, et extension à 70 ° C pendant 30 s.
7. Analyser les données qRT-PCRChante le logiciel de l'instrument de PCR en temps réel. Confirmez que le seuil et la ligne de base qui sont automatiquement déterminés par le logiciel sont appropriés dans chaque puits.
8. Vérifiez le cycle de seuil des miARN cible dans chaque échantillon. Le cycle de seuil est l'intersection entre une courbe d'amplification et une ligne de seuil. Ensuite, normalisez le niveau d'expression des miARN cible contre RNU6-2 en tant que contrôle endogène et calculez le niveau d'expression relatif des miARN cible en utilisant la méthode 2 ^{- ΔΔCT 13} .
   NOTE: Il convient de noter que la stabilité du niveau d'expression du miNrr de contrôle endogène doit être vérifiée. Dans cette expérience, RNU6-2 a été confirmé pour être exprimé à un niveau élevé et relativement invariant dans chaque groupe.

Résultats

Les résultats présentés ici sont basés sur notre étude précédemment rapportée ⁸ . Nous avons étudié le profil d'expression du miARN dans la fibrose péritonéale. La fibrose péritonéale est une complication majeure de la dialyse péritonéale. Il se caractérise par la perte de la monocouche cellulaire mésothéliale et l'accumulation excessive de composants de la matrice extracellulaire, et est associé à une rupture de la membrane péritoné...

Discussion

En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les miARN dans la membrane péritonéale de rat ont été purifiés avec succès et ont été détectés à l'aide de la PCR qRT. La fiabilité de l'analyse des données qRT-PCR dépend de la qualité des miARN purifiés. Par conséquent, la pureté des miRNAs peut être vérifiée avant qRT-PCR par le rapport absorbance à 260 nm à celui à 280 nm, qui peut être mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre. Lorsque l'amplification significative ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign