JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.

Özet

Mikro RNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyonel olarak haberci RNA ekspresyonunu düzenleyen küçük kod çözücü olmayan RNA'lardır. Sıçanlardaki çeşitli organ ve dokulardaki miRNA ekspresyon profili araştırılmıştır. Bununla birlikte, miRNA'ların saflaştırılması ve fare peritoneal membrandaki ekspresyonlarının saptanması için standart yöntemler iyi belirlenmemiştir. Rat peritoneal membranda kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak miRNA'ları arındırmak ve ölçmek için etkili ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokol dört aşamadan oluşur: 1) peritoneal membran numunesinin saflaştırılması; 2) peritoneal membran örneğinden miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA'nın saflaştırılması; 3) cDNA üretmek için miRNA'nın ters transkripsiyonu; Ve 4) miRNA ekspresyonunu saptamak için qRT-PCR. Bu protokolü kullanarak altı miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 ve miRNA-34a-5p) ekspresyonunun arttığını başarıyla tespit ettikSıçan peritoneal fibroz modelinin peritoneal zarında kontrol gruplarına kıyasla belirgin olarak anlamlı bir farklılık göstermedi. Bu protokol, birçok patolojik koşulda sıçanların peritoneal zarındaki miRNA ekspresyon profilini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Mikro RNA'lar (miRNA'lar), haberci RNA (mRNA) ekspresyonunu transkripsiyonel olarak düzenleyen kısa, kodlamayan RNA'lardır. MiRNA'ların ekspresyonundaki değişiklikler, kanser, inflamasyon, metabolik bozukluklar ve fibroz 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarda önemli rol oynayan birçok mRNA'nın ekspresyonunu düzenler. Bu nedenle, miRNA'lar yeni biyolojik belirteçler ve terapötik hedefler olarak potansiyele sahiptir 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA ifade profili, çeşitli sıçanlardaKaraciğer, kalp, akciğer ve böbrek dahil olmak üzere organ ve dokular 9 . Bununla birlikte, sıçan peritoneal membrandaki miRNA'ların saflaştırılması ve bulgulanması için standart yöntemler iyi belirlenmemiştir.

Bu protokolün genel amacı sıçan periton zarında bulunan miRNA'ları başarılı bir şekilde arındırmak ve tespit etmektir. İlk önce, bir cam homojenleştirici kullanılarak periton zar numunesi homojenleştirildi ve ardından bir mikrosantrifüj spin kolonu 10'da bir biyopolimer parçalama sistemine maruz bırakıldı. Daha sonra, miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA, bir silika-zar-esaslı döndürme kolonu 10 kullanılarak peritoneal membran örneğinden saflaştırılmıştır. Ardından, cDNA, ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primer 11 kullanılarak saflaştırılmış toplam RNA'dan sentezlendi. Sonunda, miRNA ifadesi bir interkalasyon boya 11 kullanılarak qRT-PCR ile belirlendi. Bu protokolün mantığı bDokulardaki miRNA'yı basit bir işlem 8 , 10 , 11 ile belirgin saflaştırma ve saptamayı gösteren önceki çalışmalara dayandırılmıştır. Mikro santrifüj spin kolonu ve silis-membran tabanlı spin sütununda bir biyopolimer parçalama sisteminin kullanılmasının dokulardan 10 yüksek kaliteli toplam RNA'yı arındırabildiği bildirilmiştir. Ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primer kullanılarak saflaştırılmış toplam RNA'dan cDNA sentezleme yöntemi ve bu protokolde interkalasyon boyası kullanılarak qRT-PCR ile miRNA ekspresyonunu saptama yöntemi, yüksek doğruluk ve Duyarlılık 11 . Buna ek olarak, bu zaman kazandıran ve teknik hatayı önleyen basit bir işlemdir. Bu nedenle, bu protokol, geniş bir patolojik koşul aralığında sıçan peritoneal membranda yüksek oranda hassas ve hassas bir şekilde tespit edilmesini gerektiren çalışmalarda yararlıdır.

Protokol

Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etiği komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Kılavuzu'ndan Deneysel Hayvanlar Kullanımının ve Bakımının yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Periton Numune Toplama

  1. Aşağıdaki maddeleri toplayın: İzofluran, mantar levha, fosfat tamponlu salin (PBS) ile petri kabı, cerrahi makas ve forseps ile ıslatılmış pamuklu 50 mL santrifüj tüpü.
  2. Bir isofluoran doz aşımı ile bir sıçanı euthanize, daha sonra% 70 etanol ile sıçanın karın cildi püskürtülür ve sığır onun sırtında mantar levha üzerine monte edin.
  3. Makas ve forseps kullanarak karın cildi, kas ve periton zarında uzunlamasına bir kesi yapın.
  4. Forseps kullanarak peritoneal membranı alın ve diyaframın altındaki en alçak kemik boyunca ve üst kısımda yatay kesikler yapınCerrahi makas kullanarak lateral bölge üzerinde ower tarafı. Daha sonra, periton zarını cerrahi makas kullanarak vücuttan çıkarmak için yanal boyuna insizyonlar yapın. Ardından, bir petri kabında PBS ile yıkayın.
  5. Cerrahi makas ve forseps kullanarak aşağıdaki adımlar için uygun bir boyut olan 20 mg (3-5 mm2) peritoneal membran numunesini kesin ve kesin.

2. Peritoneal Membran Numunelerindeki toplam RNA'ların saflaştırılması

NOT: Burada, 20 mg ağırlığındaki peritoneal membran numuneleri bir cam homojenleştirici ve bir biyo-polimer parçalama sistemi kullanılarak bir mikro santrifüj spin sütununda homojenize edilir. Ardından, peritoneal membran örneğinden alınan toplam RNA bir silika-membran tabanlı dönme kolonu kullanılarak izole edilir.

  1. Aşağıdaki maddeleri toplayın: 1.5 veya 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri,% 100 etanol, kloroform, cam homojenizatörü, buz, biyolojik polimer parçalama sistemi, mikro santrifüj spin kolonu 10 10 , fenol / guanidin bazlı lizis ayıracı, guanidin ve etanol içeren yıkama tamponu (yıkama tamponu 1) ve etanol içeren yıkama tamponu (yıkama tamponu 2).
  2. Bir cam homojenleştiriciye 20 mg peritoneal membran örneği koyun ve fenol / guanidin bazlı lizis reaktifinin 700 μL'sini ekleyin.
  3. Bükülme ile numuneye havluyu yavaş yavaş bastırarak peritoneal membran numunesini homojenize edin. Periton zar numunesi fenol / guanidin bazlı lizis ayıracı içine tamamen çözünene kadar bu işlemi birkaç düzine kez buz üzerinde tekrar edin.
  4. Daha fazla homojenizasyon için, homojenize edilmiş lizat, 2.0 mL'lik bir toplama tüpünde bir mikrosantrifüj spin sütununda biyopolimer parçalama sistemine aktarılmalıdır. Sonra, 4 ° C'de 3 dakika boyunca 14.000 xg'de santrifüjleyin.
  5. Homojenleştirilmiş lizatı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  6. Homojenize edilmiş lizata 140 μL kloroform ekleyin ve tüpü kapatınE güvenli bir şekilde. Ardından tüp, 15 saniye süreyle ters çevirerek karıştırın.
  7. Örnekleri oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Daha sonra, 12 ° C'de 15 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin.
  8. Çökelti bozmadan süpernatantı (genellikle 300 μL) yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hacmi (genellikle 450 μL)% 100 etanolün 1.5 katı ekleyin. Ardından, 5 saniye vorteks karıştırarak numuneyi karıştırın.
  9. 2.0 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirilen silika-membranlı bir spin sütununa örnekten 700 μL kadar pipetleyin. Sütunun kapağını kapatın. Daha sonra, 15 saniye boyunca 15.000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, toplama borusundaki akış akışını atın.
  10. Numuneyi titizlikle yıkamak için silika-membran esaslı döndürme sütununa 700 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. Sütunun kapağını kapatın. Daha sonra, 15 saniye boyunca 15.000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, toplama borusundaki akış akışını atın.
  11. Silika-memb'a 500 uL yıkama tamponu ekleyinHerhangi bir tuz izini kaldırmak için rane tabanlı dönme kolonu. Sütunun kapağını kapatın. Daha sonra, 15 saniye boyunca 15.000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, toplama borusundaki akış akışını atın.
  12. Tekrar et 2.11.
  13. Silika-membran tabanlı spin sütununu tekrar 15,000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, toplama borusundaki akış akışını atın.
  14. Yeni bir 1.5 mL toplama tüpüne silika-membranlı tabanlı döner kolonu yerleştirin. Ardından sütuna 25 μL RNaz içermeyen su aktarın. Sütunun kapağını kapatın. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. Daha sonra, 1 dakika için 15.000 xg'de santrifüjleyin.
  15. Total RNA içeren 25 μL elüatını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, kullanmadan önce -80 ° C'de saklayın.

3. Total RNA'nın Tersine Dökülmesi

NOT: Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Exper'in Yayınlanması için Asgari Bilgiye Referans ve Uyum(MIQE) yönergeleri daha iyi uygulama imkânı tanır ve güvenilir ve net sonuçlar elde etmede yardımcı olur 12 .
NOT: Burada, toplam 1.0 μg izole RNA ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primer kullanılarak ters transkribe edilmiştir.

  1. Aşağıdaki maddeleri toplayın: 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpleri; Sekiz yuvalı şerit tüpler; RNaz içermeyen su; buz; Ters transkriptaz kiti (materyal tablosuna bakınız) 11 .
  2. 2.0 mcL 10x nükleik asit karışımı, 2.0 μL ters transkriptaz karışımı (kitten) ve 4.0 uL 5x hi-spec tampon içeren tüp başına 8.0 μL içeren bir ana karışım çözeltisi hazırlayın.
  3. 8.0 μL master karışım solüsyonunu (kitten) her tüpe boşaltılır.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA miktarını ölçün. Peritoneal membran örneğinden saflaştırılmış 1.0 μg izole edilmiş toplam RNA'yı her tüpe ekleyin.
    NOT: qRT-PCR usi ile yapılabilirSaflaştırılmış toplam RNA'ların kalite kontrolü için ters transkripsiyon olmadan bir şablon olarak toplam RNA'lar. Herhangi bir DNA kontamine olursa, beklenmeyen amplifikasyon ürünleri qRT-PCR ile gözlenir.
  5. RNaz içermeyen suyun her tüpüne toplam 20 mcL'ye ekleyin. Ardından, pipetle iyice karıştırın ve 15 saniye boyunca santrifüjleyin.
  6. Numuneleri 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin. Hemen 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adım bir termal döngüleyici içinde gerçekleştirilebilir.
  7. CDNA'yı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RNaz içermeyen suyla on kez (1:10) seyreltin.
  8. Seyreltilmiş cDNA'yı geçici olarak buzda tutun ve kullanımdan önce uzun süre -80 ° C'de saklayın.

4. miRNA'nın qRT-PCR

NOT: miRNA'nın qRT-PCR'si interkalasyon boyası kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, RNA, U6 küçük nükleer 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 ve miRNA-34a-5p için primerler kullanılmış.

  1. Aşağıdaki maddeleri toplayın: 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpleri, qRT-PCR için 96 oyuklu reaksiyon plakası, 96 oyuklu reaksiyon plakası için yapışkan film, miRNA'ya özgü primerler, yeşil boya temelli PCR kiti (bkz. Malzeme tablosu) 11 ve Gerçek zamanlı PCR Enstrümanı.
  2. 12.5 μL 2x PCR master karışımı, 2.5 μL 5 uM her bir miRNA astar, nükleaz içermeyen su içinde çözülmüş ve her kuyu için 10x evrensel primerden 1.25 μL içeren bir ana karışım hazırlayın.
  3. 96-çukurlu plakanın her kuyucuğuna 22.5 μL master karışım verin.
  4. Her göze 2.5 uL şablon cDNA ekleyin.
  5. Plakayı, 96 oyuklu reaksiyon plakası için yapışkan filmle yapıştırın. Ardından, 30 x 1000 x g'de plak santrifüjleyin.
  6. PCR döngüsü programını gerçek zamanlı PCR Enstrümanı ve yazılımı ile aşağıdaki gibi çalıştırın.
    1. Plakayı gerçek zamanlı PCR aletinde ayarlayın. Gerçek zamanlı PCR yazılımında deneysel özellikleri tanımlayın (deneysel girdiDeneysel enstrüman için "96 kuyucuk " seçin, niceleme metodu için "2 - Δ ΔCT yöntemi" ni seçin, hedef sekansı tespit etmek için reaktif için "SYBR yeşil reaktifleri" seçin, bunun için "standart rampa hızı" nı seçin Alet çalışması).
    2. Daha sonra numunelere isimler atayın ve her kuyucuktaki miRNA'ları hedefleyin. Sonuçların doğrulanması için yeterli veri elde etmek için numuneler her zaman çift veya üçlü olarak test edilmiştir. Referans örneği ve endojen kontrol seçin. Pasif referans olarak kullanılacak boya için "none" seçeneğini seçin.
    3. "20 μL" reaksiyon hacmi ve aşağıdaki PCR döngü koşullarını gerçek zamanlı PCR yazılımında talimatlara uygun olarak girin: 95 ° C'de 15 dakika ön inkübasyon ve daha sonra 94 ° C'de 15 saniye süreyle 40 devir denatürasyonunu girin , 55 ° C'de 30 saniye tavlama ve 30 saniye boyunca 70 ° C'de uzatma.
  7. QRT-PCR verilerini analiz edinGerçek zamanlı PCR aletinin yazılımını söyle. Yazılım tarafından otomatik olarak belirlenen eşik ve taban çizgisinin her kuyuda uygun olduğunu teyit edin.
  8. Her numunedeki hedef miRNA'ların eşik döngüsünü kontrol edin. Eşik çevrimi, bir amplifikasyon eğrisi ve bir eşik çizgisi arasındaki kesişimdir. Daha sonra hedef miRNA'ların ekspresyon düzeyini endojen bir kontrol olarak RNU6-2'ye karşı normalize edin ve 2 - ΔΔCT yöntemi 13 kullanarak hedef miRNA'ların göreceli ekspresyon seviyesini hesaplayın.
    NOT: Endojen kontrol mRNA'sının ekspresyon seviyesinin kararlılığının doğrulanması gerektiğini unutmamalısınız. Bu deneyde, RNU6-2'nin yüksek düzeyde ifade edildiği ve her grupta nispeten değişmediği teyit edildi.

Sonuçlar

Burada sunulan sonuçlar daha önce bildirilen çalışmamıza 8 dayanır. Peritoneal fibrozda miRNA ekspresyon profilini araştırdık. Peritoneal fibroz peritoneal diyalizde önemli bir komplikasyondur. Mezotel hücre tek tabaka kaybı ve aşırı hücre birimi matris bileşenleri birikimi ile karakterizedir ve peritoneal membran başarısızlığı 14 , 15 ile ilişkilidir. Peritoneal bir fibrozis sıç...

Tartışmalar

Bu el yazmasında sunulan protokol kullanılarak sıçan peritoneal zardaki miRNA'lar başarılı bir şekilde saflaştırıldı ve qRT-PCR kullanılarak tespit edildi. QRT-PCR veri analizinin güvenilirliği, saflaştırılmış miRNA'ların kalitesine bağlıdır. Dolayısıyla, miRNA'ların saflığı, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilen 260 nm'de absorbansa 280 nm'de absorbansa oranla qRT-PCR'den önce kontrol edilebilir. MiRNA'nın anlamlı amplifikasyonu qRT-PCR kullanıla...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışmalarının olmadığını açıkladılar.

Teşekkürler

Mükemmel teknik desteği için Miyako Shigeta'ya teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI tarafından desteklenmiştir (hibe numarası 25461252).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
QIA shredderQiagen79654biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kitQiagen217004silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLTQiagen79216wash buffer 1
Buffer RWTQiagen1067933wash buffer 2
miScript II RT kit Qiagen218161includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer  QiagenMS00033740not disclosed
miRNA-142-3p primerQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'  
miRNA-21-5p primerQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primerQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primerQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primerQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primerQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific4311971adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument software
methylglyoxalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumonot assign peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley ratsSLCnot assign 

Referanslar

  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 124MikroRNAs anperitoneal membranfibrozsafla t rmasaptamaqRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır