定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

要約

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。

要約

マイクロRNA（miRNA）は、転写後にメッセンジャーRNAの発現を調節する小さな非コードRNAです。 miRNA発現プロファイルは、ラットの様々な器官および組織において研究されている。しかしながら、miRNAの精製およびラット腹膜におけるそれらの発現の検出のための標準的な方法は十分に確立されていない。我々は、ラット腹膜における定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて、miRNAを精製および定量するための効果的かつ信頼できる方法を開発した。このプロトコルは、4つのステップからなる：1）腹膜試料の精製; 2）腹膜試料からのmiRNAを含む全RNAの精製; 3）cDNAを産生するためのmiRNAの逆転写;および4）miRNA発現を検出するためのqRT-PCR。このプロトコールを用いて、6つのmiRNA（miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327、およびmiRNA-34a-5p）の発現が増加したラット腹膜線維症モデルの腹膜が対照群に比べて有意に高かった。このプロトコルは、多くの病的状態におけるラットの腹膜におけるmiRNA発現のプロファイルを研究するために使用することができる。

概要

マイクロRNA（miRNA）は、メッセンジャーRNA（mRNA）発現を転写後調節する短い非コーディングRNAです。 miRNAの発現の変化は、癌、炎症、代謝障害、および線維症2,3,4,5,6,7,8を含む様々な病理学的状態において重要な役割を果たす多くのmRNAの発現を調節する。したがって、miRNAは、新規バイオマーカーおよび治療標的2,3,4,5,6,7,8として潜在的可能性を有する。 miRNA発現プロファイルは、様々なラットにおいて決定されている肝臓、心臓、肺、および腎臓を含む器官および組織⁹ 。しかしながら、ラット腹膜におけるmiRNAの精製および検出のための標準的方法は十分に確立されていない。

このプロトコールの全体的な目標は、ラット腹膜中のmiRNAを首尾よく精製および検出することである。最初に、腹膜試料をガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、続いて微量遠心分離機スピンカラム¹⁰内のバイオポリマー - 細断システムに曝露した。次に、シリカ膜を用いたスピンカラム¹⁰を用いて、腹膜試料からmiRNAを含む全RNAを精製した。次に、逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、oligo-dTプライマー¹¹を用いて精製トータルRNAからcDNAを合成した。最後に、挿入色素¹¹を用いてqRT-PCRによりmiRNAの発現を決定した。このプロトコルの理論的根拠はbこれまでの研究では、単純なプロセスでmiRNAの組織内での有意な精製および検出が示された8,10,11。ミクロ遠心分離スピンカラムとシリカ膜ベースのスピンカラムでのバイオポリマー粉砕システムの使用は、組織からの高品質の全RNAを精製できることが報告されています¹⁰ 。逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、オリゴdTプライマーを用いた精製トータルRNAからcDNAを合成する方法、およびインターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の検出法は、感度¹¹ 。さらに、これは簡単なプロセスであり、時間を節約し、技術的なエラーを防止します。したがって、このプロトコルは、広範囲の病理学的状態におけるラット腹膜におけるmiRNAの高精度かつ高感度な検出を必要とする研究において有用である。

プロトコル

全ての動物実験プロトコールは、Jichi Medical Universityの動物倫理委員会によって承認され、実験動物のためのJichi Medical University GuideのExperimental Animals Use and Care of Experimental Animalsガイドラインに従って行われた。

1.腹膜試料採取

1. イソフルラン、コルクシート、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れたペトリ皿、外科用ハサミ、および鉗子に綿を掛けた50 mL遠心チューブ。
2. イソフルランの過量でラットを安楽死させ、70％エタノールでラットの腹部の皮膚に噴霧し、その背中のコルクシートにラットをマウントする。
3. はさみと鉗子を使用して、腹部の皮膚、筋肉、および腹膜に縦に切開する。
4. 鉗子を使用して腹膜をピックアップし、ダイアフラムの下の最も低い肋骨に沿ってその上部に水平切開を行い、そのl外科用ハサミを使用して側方領域の上にある。次に、外科用ハサミを使用して身体から腹膜を除去するために横方向の縦方向の切開を行う。次に、ペトリ皿でPBSで洗浄します。
5. 外科用はさみと鉗子を使用して、次のステップに適したサイズの腹膜サンプルを20mg（3〜5mm ² ）切り取り、整える。

2.腹膜試料からの全RNAの精製

注：ここでは、体重20mgの腹膜サンプルを、ガラスホモジナイザーおよび微量遠心分離機スピンカラム内のバイオポリマー粉砕システムを使用してホモジナイズする。次いで、腹膜試料からの全RNAを、シリカ膜ベースのスピンカラムを用いて単離する。

1. 以下の項目を採取する：1.5または2.0 mLのマイクロ遠心チューブ、100％エタノール、クロロホルム、ガラスホモジナイザー、氷、バイオ遠心分離システム、マイクロ遠心分離スピンカラム¹⁰
2. 20mgの腹膜サンプルをガラスホモジナイザーに入れ、700μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加える。
3. 腹をゆっくりと試料にねじって腹膜試料を均質化する。腹膜試料がフェノール/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、このプロセスを氷上で数十回繰り返す。
4. さらなるホモジナイゼーションのために、ホモジナイズしたライセートを、2.0mLのコレクションチューブ内のマイクロ遠心分離スピンカラムのバイオポリマー粉砕システムに移す。次に、14,000 xgで4℃で3分間遠心します。
5. ホモジナイズしたライセートを新しいマイクロ遠心チューブに移す。
6. ホモジナイズしたライセートに140μLのクロロホルムを加え、タブをキャップする。安全に。次に、チューブを反転させて15秒間混合する。
7. サンプルを室温で2〜3分間インキュベートする。次に、12,000 xgで4℃、15分間遠心します。
8. 沈殿物を乱さずに上清（通常300μL）を新しい微量遠心管に移し、100倍エタノールの容量（通常450μL）を1.5倍加える。次に、5秒間ボルテックスしてサンプルを混合します。
9. サンプル700μLを2.0mLのコレクションチューブに入れたシリカ膜ベースのスピンカラムにピペットで移します。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
10. ストリンジェント洗浄するために700μLの洗浄バッファー1をシリカ膜ベースのスピンカラムに加えます。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
11. 500μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンに加えますラーンベースのスピンカラムを使用して塩の痕跡を除去します。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
12. 2.11を繰り返します。
13. シリカ膜ベースのスピンカラムを再び15,000 xgで1分間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
14. シリカ膜ベースのスピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。次に、25μLのRNaseフリー水をカラムに移す。カラムのキャップを閉めます。サンプルを室温で5分間放置する。その後、15,000 xgで1分間遠心します。
15. 全RNAを含む25μLの溶出液を新しいマイクロ遠心チューブに移す。その後、使用する前に-80℃で保存してください。

3.全RNAの逆転写

注：定量的リアルタイムPCR実験の発表のための最小情報への参照と遵守iments（MIQE）ガイドラインは、より良いプラクティスを奨励し、信頼性の高い明瞭な結果を得るのを助けます¹² 。
注：ここでは、逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを使用して、合計1.0μgの単離されたRNAを逆転写する。

1. 以下の項目を採取する：1.5mLのマイクロ遠心チューブ; 8ウェルストリップチューブ; RNアーゼフリー水;氷;逆転写酵素キット（材料表参照） ¹¹ 。
2. 2.0μLの10x核酸ミックス、2.0μLの逆転写酵素ミックス（キットから）、4.0μLの5xハイスペックバッファーを含むマスターミックス溶液をチューブあたり合計8.0μLに調製します。
3. 8.0μLのマスターミックス溶液（キットから）を各チューブに分注する。
4. 分光光度計を用いて総RNA量を測定する。腹膜サンプルから精製した1.0μgの単離された全RNAを各チューブに添加する。
   注：qRT-PCRは、精製された全RNAの品質管理のために、逆転写を伴わずに鋳型としての全RNAを含む。いずれかのDNAが汚染されている場合、予想外の増幅産物がqRT-PCRによって観察される。
5. 各チューブにRNaseフリー水を加えて合計20μLとします。次に、ピペッティングにより完全に混合し、15秒間遠心分離する。
6. サンプルを37℃で60分間インキュベートする。直ちに95℃で5分間インキュベートする。
   注：このステップは、サーマルサイクラーで行うことができます。
7. 新しい微量遠心管にcDNAを移し、RNaseフリー水で10倍に希釈する（1:10）。
8. 希釈したcDNAを氷上に一時保存し、長期間使用する前に-80℃で保存する。

4. miRNAのqRT-PCR

注：miRNAのqRT-PCRは、挿入色素を用いて行われる。ここで、RNA、U6小核2（RNU6-2）、miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327、miRNA-34a-5pに使われていた。

1. qRT-PCRのための96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレートの接着フィルム、miRNA特異的プライマー、緑色染料ベースのPCRキット（材料表参照） ¹¹ 、およびリアルタイムPCR装置。
2. 12.5μLの2x PCRマスターミックス、ヌクレアーゼフリー水に溶解した5μMの各miRNAプライマー2.5μL、および各ウェルの10倍ユニバーサルプライマー1.25μLを含むマスターミックスを調製します。
3. 96ウェルプレートの各ウェルに22.5μLのマスターミックスを分注する。
4. 2.5μLの鋳型cDNAを各ウェルに加える。
5. 96ウェル反応プレート用の接着フィルムでプレートをシールする。次にプレートを1000 xgで30秒間遠心します。
6. 以下のようにリアルタイムPCR装置およびソフトウェアを用いてPCRサイクリングプログラムを実行する。
   1. プレートをリアルタイムPCR装置にセットする。リアルタイムPCRソフトウェアでは、実験的特性を定義する（実験的実験装置のタイプに "96-wells"を選択し、定量方法に "2 ^{- ΔΔCT}法"を選択し、試薬に標的配列を検出させる "SYBR緑色試薬"を選択し、計器運転）。
   2. 次に、各ウェルのサンプルおよび標的miRNAに名前を割り当てる。サンプルは、結果を検証するのに十分なデータを得るために、常に二重または三重にテストされます。参照サンプルと内因性コントロールを選択する。染料を受動参照として使用する場合は、「なし」を選択します。
   3. 以下の指示に従って、反応液量「20μL」および以下のPCRサイクル条件を指示に従って入力する：95℃で15分間のプレインキュベーション、次いで94℃で15秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、および70℃で30秒間の伸長を含む。
7. qRT-PCRデータの解析リアルタイムPCR装置のソフトウェアを歌います。ソフトウェアによって自動的に決定される閾値およびベースラインが各ウェルに適切であることを確認する。
8. 各サンプルのターゲットmiRNAの閾値サイクルを確認してください。閾値サイクルは、増幅曲線と閾値線との間の交差点である。次に、内因性対照としてのRNU6-2に対する標的miRNAの発現レベルを標準化し、2 ^{- ΔΔCT}法¹³を用いて標的miRNAの相対発現レベルを算出する。
   注：内因性コントロールmiRNAの発現レベルの安定性を検証する必要があることに注意する必要があります。この実験において、RNU6-2は、高レベルで発現され、各群にわたって比較的不変であることが確認された。

結果

ここに示した結果は、これまでに報告された研究^8に基づいています。我々は、腹膜線維症におけるmiRNA発現プロファイルを調べた。腹膜線維症は、腹膜透析における主要な合併症である。これは、中皮細胞単層の喪失および細胞外マトリックス成分の過剰蓄積を特徴とし、腹膜破壊を伴う^14,15 。腹膜線維症ラットモデルを、100mL / kg...

ディスカッション

この原稿に示されたプロトコールを用いて、ラット腹膜のmiRNAを首尾よく精製し、qRT-PCRを用いて検出した。 qRT-PCRデータ分析の信頼性は、精製されたmiRNAの品質に依存する。したがって、miRNAの純度は、分光光度計を用いて測定することができる280nmの吸光度に対する260nmの吸光度の比によって、qRT-PCRの前に調べることができる。 qRT-PCRを使用してmiRNAの有意な増幅が得られない場合、鋳型cDNAの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign