JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для обнаружения экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крысы с использованием количественной цепной реакции обратной транскрипции в реальном времени. Этот метод подходит для изучения профиля экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крысы в ​​нескольких патологических состояниях.

Аннотация

МикроРНК (miRNAs) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию РНК-посланников после транскрипции. Профиль экспрессии miRNA был исследован в различных органах и тканях крысы. Однако стандартные методы очистки miRNAs и обнаружения их экспрессии в крысиной перитонеальной мембране не были установлены. Мы разработали эффективный и надежный метод очистки и количественной оценки miRNAs с использованием количественной реакции обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) в перитонеальной мембране крысы. Этот протокол состоит из четырех этапов: 1) очистка образца перитонеальной мембраны; 2) очистка полной РНК, включая miRNA от образца брюшной мембраны; 3) обратная транскрипция miRNA для получения кДНК; И 4) qRT-PCR для определения экспрессии miRNA. Используя этот протокол, мы успешно определили, что экспрессия шести miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 и miRNA-34a-5p) увеличиласьЗначительно в перитонеальной мембране модели крысиного перитонеального фиброза по сравнению с таковой в контрольных группах. Этот протокол можно использовать для изучения профиля экспрессии miRNA в перитонеальной мембране крыс во многих патологических состояниях.

Введение

МикроРНК (miRNAs) представляют собой короткие, некодирующие РНК, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию РНК (мРНК) мессенджера 1 . Изменения экспрессии miRNAs регулируют экспрессию многих мРНК, которые играют ключевую роль в различных патологических состояниях, включая рак, воспаление, нарушения обмена веществ и фиброз 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Таким образом, miRNAs обладают потенциалом в качестве новых биомаркеров и терапевтических мишеней 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Профиль экспрессии miRNA был определен у разных крысОрганов и тканей, включая печень, сердце, легкие и почки 9 . Однако стандартные методы очистки и обнаружения miRNAs в перитонеальной мембране крысы не были установлены.

Общая цель этого протокола заключается в успешной очистке и обнаружении miRNAs в перитонеальной мембране крысы. Во-первых, образец перитонеальной мембраны гомогенизировали с использованием стеклянного гомогенизатора с последующим воздействием системы измельчения биополимера в колонку 10 микроцентрифужного спирта. Затем общую РНК, включая miRNA, очищали из образца перитонеальной мембраны с использованием спиновой колонки 10 на основе диоксида кремния. Затем кДНК синтезировали из очищенной полной РНК с использованием обратной транскриптазы, поли (А) полимеразы и олиго-dT-праймера 11 . Наконец, экспрессию miRNA определяли с помощью qRT-PCR с использованием интеркалирующего красителя 11 . Обоснованием этого протокола является bСогласно предыдущим исследованиям, которые показали значительную очистку и обнаружение miRNA в тканях простым процессом 8 , 10 , 11 . Сообщается, что использование системы измельчения биополимера в спин-колонке с микроцентрифугой и спиновой колонке на основе диоксида кремния может очищать высококачественную общую РНК из тканей 10 . Сообщалось, что способ синтеза кДНК из очищенной полной РНК с использованием обратной транскриптазы, поли (А)-полимеразы и олиго-dT-праймера и способ детектирования экспрессии miRNA с помощью qRT-PCR с использованием интеркалирующего красителя в этом протоколе показывают высокую точность и Чувствительность 11 . Кроме того, это простой процесс, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Поэтому этот протокол полезен в исследованиях, которые требуют высокоточного и чувствительного обнаружения miRNA в перитонеальной мембране крысы в ​​широком диапазоне патологических состояний,

протокол

Все экспериментальные протоколы животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и были выполнены в соответствии с Руководством по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства медицинских лабораторий Jichi для лабораторных животных.

1. Сбор проб брюшины

  1. Соберите следующие предметы: пробирку с центрифугой на 50 мл с хлопком, пропитанным изофлюраном, пробковым листом, чашкой Петри с фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), хирургическими ножницами и щипцами.
  2. Усыпьте крысу с передозировкой изофлуораном, затем распылите брюшную кожу крысы с помощью 70% этанола и установите крысу на пробирке на спине.
  3. Сделайте продольный разрез в брюшной коже, мышцах и брюшной мембране, используя ножницы и щипцы.
  4. Возьмите перитонеальную мембрану с помощью щипцов и сделайте горизонтальные разрезы на ее верхней части вдоль нижней реберной кости под диафрагмой и на ее lСо стороны бота на боковой области, используя хирургические ножницы. Затем сделайте поперечные продольные разрезы, чтобы удалить перитонеальную мембрану из тела с помощью хирургических ножниц. Затем вымойте его PBS в чашке Петри.
  5. Вырезать и обрезать 20 мг (3-5 мм 2 ) образцов перитонеальной мембраны, подходящий размер для следующих этапов, используя хирургические ножницы и щипцы.

2. Очистка суммарной РНК от перитонеальных мембранных образцов

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь образцы перитонеальной мембраны массой 20 мг гомогенизируют, используя стеклянный гомогенизатор и систему измельчения биополимера в спин-колонке с микроцентрифугой. Затем общую РНК из образца перитонеальной мембраны выделяют с использованием спиновой колонки на основе диоксида кремния.

  1. Соберите следующие предметы: 1,5 или 2,0 мл микроцентрифужные пробирки, 100% этанол, хлороформ, стеклянный гомогенизатор, лед, систему измельчения биополимера в колонке с микроцентрифужной спинкой 10 10 на основе диоксида кремния на мембране, реагент лизиса на основе фенола / гуанидина, промывочный буфер, включающий гуанидин и этанол (промывочный буфер 1), и промывочный буфер, включая этанол (промывочный буфер 2).
  2. Поместите образец 20 мг перитонеальной мембраны в стеклянный гомогенизатор и добавьте 700 мкл реагента для лизиса на основе фенола / гуанидина.
  3. Гомогенизируйте образец перитонеальной мембраны, медленно нажав пестик на образец с скручиванием. Повторите этот процесс несколько десятков раз на льду до тех пор, пока образец перитонеальной мембраны полностью не растворится в реакторе лизиса на основе фенола / гуанидина.
  4. Для дальнейшей гомогенизации переносят гомогенизированный лизат в систему измельчения биополимера в микроцентрифужную спиновую колонку в 2,0 мл приемной трубке. Затем центрифугируют при 14000 × g в течение 3 мин при 4 ° C.
  5. Перенесите гомогенизированный лизат в новую микроцентрифужную пробирку.
  6. Добавить 140 мкл хлороформа в гомогенизированный лизат и закрыть бакБезопасно. Затем смешайте трубку с помощью инверсии в течение 15 с.
  7. Инкубируйте образцы в течение 2-3 минут при комнатной температуре. Затем центрифугируют их при 12000 × g в течение 15 минут при 4 ° C.
  8. Перенесите супернатант (обычно 300 мкл) в новую микроцентрифужную пробирку, не нарушая осадок, и добавьте 1,5 раза ее объем (обычно 450 мкл) 100% этанола. Затем смешайте образец, встряхивая в течение 5 с.
  9. Пипетируйте до 700 мкл образца в спин-колонку на основе диоксида кремния, помещенную в 2,0 мл приемную трубку. Закройте крышку колонны. Затем центрифугируют его при 15000 мкг в течение 15 с. После центрифугирования отбросьте поток в сборной трубе.
  10. Добавьте 700 мкл промывочного буфера 1 в спин-колонку на основе диоксида кремния, чтобы интенсивно промыть образец. Закройте крышку колонны. Затем центрифугируют его при 15000 мкг в течение 15 с. После центрифугирования отбросьте поток в сборной трубе.
  11. Добавить 500 мкл промывочного буфера 2 в силикагельRane-based spin column для удаления следов соли. Закройте крышку колонны. Затем центрифугируют его при 15000 мкг в течение 15 с. После центрифугирования отбросьте поток в сборной трубе.
  12. Повторите 2.11.
  13. Центрифугируйте спин-колонку на основе кремнеземной мембраны снова при 15000 × g в течение 1 мин. После центрифугирования отбросьте поток в сборной трубе.
  14. Поместите спин-колонку на основе диоксида кремния в новую трубку для сбора 1,5 мл. Затем перенесите 25 мкл воды, свободной от РНКазы, в колонку. Закройте крышку колонны. Оставьте образец при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем центрифугируют при 15000 мкг в течение 1 мин.
  15. Перенесите 25 мкл элюата, содержащего общую РНК, в новую микроцентрифужную пробирку. Затем храните его при -80 ° C перед использованием.

3. Обратная транскрипция полной РНК

ПРИМЕЧАНИЕ. Ссылка и соблюдение минимальной информации для публикации количественного опыта PCR в реальном времениIments (MIQE) поощряют более эффективную практику и помогают в получении надежных и недвусмысленных результатов 12 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь в общей сложности 1,0 мкг выделенной РНК транскрибируют с обратной транскрипцией с использованием обратной транскриптазы, поли (А) полимеразы и олиго-dT-праймера.

  1. Соберите следующие предметы: 1,5 мл микроцентрифужные пробирки; Пробирки с восемью лунками; RNase-free вода; лед; Комплект обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов) 11 .
  2. Подготовьте раствор основной смеси, содержащий 2,0 мкл 10х смеси нуклеиновых кислот, 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы (из набора) и 4,0 мкл 5-кратного высокоспецифического буфера в общей сложности 8,0 мкл на пробирку.
  3. Внесите в каждую пробирку 8,0 мкл раствора основной смеси (из набора).
  4. Измерьте количество общих РНК с помощью спектрофотометра. Добавьте 1,0 мкг изолированных полных РНК, очищенных от образца перитонеальной мембраны, в каждую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. QRT-PCR может быть выполнена usiNg в качестве матрицы без обратной транскрипции для контроля качества очищенных тотальных РНК. Если какая-либо ДНК заражена, неожиданные продукты амплификации наблюдаются с помощью qRT-PCR.
  5. Добавьте воду без RNase в каждую пробирку до 20 мкл. Затем тщательно перемешайте пипетированием и центрифугируйте его в течение 15 с.
  6. Инкубируйте образцы в течение 60 мин при 37 ° С. Немедленно инкубируйте в течение 5 мин при 95 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг может быть выполнен в термоциклере.
  7. Перенесите кДНК в новую микроцентрифужную пробирку и разбавьте 10 раз (1:10) водой, свободной от РНКазы.
  8. Хранить разбавленную кДНК на льду временно и при -80 ° C в течение длительного времени перед использованием.

4. qRT-ПЦР miRNA

ПРИМЕЧАНИЕ. QRT-PCR miRNA выполняется с использованием интеркалирующего красителя. В этом случае праймеры для РНК, малой ядерной энергии U6 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 и miRNA-34a-5p были использованы.

  1. Соберите следующие предметы: 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, 96-луночную реакционную пластину для qRT-PCR, клейкую пленку для 96-луночного реакционного планшета, miRNA-специфические праймеры, набор на основе PCR на зеленой окраске (см. Таблицу материалов) 11 и Инструмент ПЦР реального времени.
  2. Подготовьте основную смесь, содержащую 12,5 мкл основной смеси для ПЦР, 2,5 мкл 5 мкМ каждого миРНК-праймера, растворенного в воде без нуклеазы, и 1,25 мкл 10-кратного универсального праймера для каждой лунки.
  3. Внесите 22,5 мкл основной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
  4. Добавить 2,5 мкл матрицы кДНК в каждую лунку.
  5. Уплотните пластину клеящей пленкой для 96-луночного реакционного планшета. Затем центрифугируют планшет при 1000 мкг в течение 30 с.
  6. Запустите программу циклического ПЦР с помощью инструмента и программного обеспечения PCR в реальном времени, как показано ниже.
    1. Установите планшет в прибор ПЦР реального времени. В программном обеспечении PCR реального времени определите экспериментальные свойства (входные экспериментальныеИмя, выберите «96 лунок» для экспериментального типа инструмента, выберите «2 - ΔΔT метод» для метода количественного определения, выберите «SYBR green reagents» для реагента, чтобы определить целевую последовательность, выберите «стандартную скорость рампы» для Запуск прибора).
    2. Затем назначьте имена образцам и целевым miRNAs в каждой лунке. Образцы всегда проверяются в двух экземплярах или в трех экземплярах, чтобы получить достаточное количество данных для проверки результатов. Выберите контрольный образец и эндогенный контроль. Выберите «none» для красителя, который будет использоваться в качестве пассивной ссылки.
    3. Введите реакционный объем «20 мкл» и следующие условия циклирования ПЦР в программном обеспечении ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями: предварительная инкубация при 95 ° С в течение 15 мин, а затем 40 циклов денатурации при 94 ° С в течение 15 с , Отжиг при 55 ° С в течение 30 с и удлинение при 70 ° С в течение 30 с.
  7. Анализ данных qRT-PCR uПеть программное обеспечение инструмента ПЦР реального времени. Убедитесь, что порог и базовая линия, которые автоматически определяются программным обеспечением, являются подходящими в каждой лунке.
  8. Проверьте пороговый цикл целевых миРНК в каждом образце. Пороговый цикл - это пересечение кривой усиления и пороговой линии. Затем нормализуйте уровень экспрессии целевых miRNAs против RNU6-2 в качестве эндогенного контроля и вычислите относительный уровень экспрессии целевых miRNAs с использованием метода 2 - ΔΔTT 13 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Следует отметить, что стабильность уровня экспрессии эндогенной контрольной miRNA должна быть проверена. В этом эксперименте RNU6-2 подтвердили, что он экспрессируется на высоком уровне и относительно инвариантен по каждой группе.

Результаты

Представленные здесь результаты основаны на нашем ранее опубликованном исследовании 8 . Мы исследовали профиль экспрессии miRNA при перитонеальном фиброзе. Перитонеальный фиброз является основным осложнением при перитонеальном диализе. Он характеризует?...

Обсуждение

Используя протокол, представленный в этой рукописи, miRNAs в крысиной перитонеальной мембране были успешно очищены и обнаружены с использованием qRT-PCR. Надежность анализа данных qRT-PCR зависит от качества очищенных miRNA. Поэтому чистоту miRNAs можно проверить до qRT-PCR соотношением поглощения при...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Мияко Шигету за отличную техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI (грант № 25461252).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
QIA shredderQiagen79654biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kitQiagen217004silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLTQiagen79216wash buffer 1
Buffer RWTQiagen1067933wash buffer 2
miScript II RT kit Qiagen218161includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer  QiagenMS00033740not disclosed
miRNA-142-3p primerQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'  
miRNA-21-5p primerQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primerQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primerQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primerQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primerQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific4311971adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument software
methylglyoxalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumonot assign peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley ratsSLCnot assign 

Ссылки

  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124qRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены