Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos ARNs não codificados que regulam a expressão de ARN mensageiro pós-transcrição. O perfil de expressão de miARN foi investigado em vários órgãos e tecidos em ratos. No entanto, os métodos padrão para a purificação de miRNAs e a detecção de sua expressão na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos. Desenvolvemos um método eficaz e confiável para purificar e quantificar miARNs usando reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa (qRT-PCR) em membrana peritoneal de rato. Este protocolo consiste em quatro etapas: 1) purificação da amostra de membrana peritoneal; 2) purificação do ARN total, incluindo o miARN da amostra de membrana peritoneal; 3) transcrição reversa de miARN para produzir cDNA; E 4) qRT-PCR para detectar a expressão de miARN. Usando este protocolo, determinamos com sucesso que a expressão de seis miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) aumentaramSignificativamente na membrana peritoneal de um modelo de fibrose peritoneal do rato em comparação com aqueles em grupos controle. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos em muitas condições patológicas.

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são curtos, não codificando RNAs que post-transcriptionally regulam o mensageiro RNA (mRNA) expressão ¹ . Alterações na expressão de miARNs regulam a expressão de muitos mRNAs que desempenham papéis fundamentais em várias condições patológicas, incluindo câncer, inflamação, distúrbios metabólicos e fibrose ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Portanto, os miARN têm potencial como novos biomarcadores e alvos terapêuticos ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . O perfil de expressão de miARN foi determinado em vários ratosÓrgãos e tecidos, incluindo fígado, coração, pulmão e rim ⁹ . No entanto, os métodos padrão para a purificação e detecção de miRNAs na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos.

O objetivo geral deste protocolo é purificar com sucesso e detectar miARN na membrana peritoneal do rato. Primeiro, a amostra de membrana peritoneal foi homogeneizada usando um homogeneizador de vidro, seguido de exposição a um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga ¹⁰ . Em seguida, o ARN total incluindo o miARN foi purificado a partir da amostra de membrana peritoneal usando uma coluna de rotação à base de sílica ¹⁰ . Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir do ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e oligo-dT iniciador ¹¹ . Finalmente, a expressão de miARN foi determinada por qRT-PCR usando um corante intercalador ¹¹ . A lógica deste protocolo é bEm estudos anteriores que mostraram uma purificação e detecção significativa de miARN em tecidos por um processo simples ^{8 , 10 , 11} . Foi relatado que o uso de um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga e coluna de rotação baseada em membrana de sílica pode purificar ARN total de alta qualidade a partir dos tecidos ¹⁰ . O método de síntese de cDNA a partir de ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT, e o método de detecção de expressão de miARN por qRT-PCR utilizando corante intercalante neste protocolo foram relatados para mostrar alta precisão e Sensibilidade ¹¹ . Além disso, este é um processo simples, que economiza tempo e evita erros técnicos. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção altamente precisa e sensível de miARN em membrana peritoneal de ratos em uma ampla gama de condições patológicas.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais de animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade Médica de Jichi e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidados de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica de Jichi para animais de laboratório.

1. Coleção de amostra de peritônio

1. Colecione os seguintes itens: tubo de centrífuga de 50 ml com algodão encharcado em isoflurano, folha de cortiça, placa de Petri com solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura cirúrgica e fórceps.
2. Eutanásie um rato com uma overdose de isofluorano, depois pulverize a pele abdominal do rato com 70% de etanol e monte o rato na folha de cortiça nas costas.
3. Faça uma incisão longitudinal na pele abdominal, músculo e membrana peritoneal usando a tesoura e fórceps.
4. Pegue a membrana peritoneal usando a pinça e faça incisões horizontais na sua parte superior ao longo do osso mais baixo da costela sob o diafragma e no seu lOwer lado na região lateral usando a tesoura cirúrgica. Em seguida, faça incisões longitudinais laterais para remover a membrana peritoneal do corpo usando as tesouras cirúrgicas. Em seguida, lave-o com PBS em uma placa de Petri.
5. Corte e corte 20 mg (3-5 mm ² ) de amostras de membranas peritoneais, que é um tamanho adequado para as seguintes etapas, usando a tesoura cirúrgica e fórceps.

2. ARN total purificante de amostras de membrana peritoneal

NOTA: Aqui, amostras de membranas peritoneais pesando 20 mg são homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga. Em seguida, o ARN total da amostra de membrana peritoneal é isolado utilizando uma coluna de rotação à base de sílica.

1. Coletar os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 ou 2,0 mL, 100% de etanol, clorofórmio, homogeneizador de vidro, gelo, sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga ¹⁰ , coluna de rotação à base de sílica ¹⁰ , reagente de lise à base de fenol / guanidina, tampão de lavagem incluindo guanidina e etanol (tampão de lavagem 1) e tampão de lavagem incluindo etanol (tampão de lavagem 2).
2. Coloque uma amostra de membrana peritoneal de 20 mg em um homogeneizador de vidro e adicione 700 μL do reagente de lise à base de fenol / guanidina.
3. Homogeneizar a amostra de membrana peritoneal pressionando lentamente o pilão sobre a amostra com torção. Repita este processo várias dúzias de vezes em gelo até a amostra de membrana peritoneal se dissolver completamente no reagente de lise à base de fenol / guanidina.
4. Para uma maior homogeneização, transferir lisado homogeneizado para o sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de rotação de microcentrífuga em um tubo de coleta de 2,0 mL. Em seguida, centrifugá-lo a 14.000 xg durante 3 min a 4 ° C.
5. Transfira o lisado homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga.
6. Adicionar 140 μL de clorofórmio ao lisado homogeneizado e tapar a cubaE de forma segura. Em seguida, misture o tubo por inversão por 15 s.
7. Incubar as amostras durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugá-los a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
8. Transfira o sobrenadante (geralmente 300 μL) para um novo tubo de microcentrífuga sem perturbar o precipitado e adicione 1.5x seu volume (geralmente 450 μL) de 100% de etanol. Em seguida, misture a amostra por vórtice por 5 s.
9. Pipetar até 700 μL da amostra em uma coluna de rotação à base de sílica colocada em um tubo de coleta de 2,0 mL. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
10. Adicione 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna de rotação à base de sílica para lavar rigorosamente a amostra. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
11. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à sílica-membColuna de rotação baseada em rane para remover qualquer vestígio de sal. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
12. Repita 2.11.
13. Centrifugue novamente a coluna de rotação à base de sílica a 15 000 xg durante 1 min. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
14. Coloque a coluna de rotação à base de sílica em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Em seguida, transferir 25 μL de água sem RNase para a coluna. Feche a tampa da coluna. Deixe a amostra à temperatura ambiente durante 5 min. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 1 min.
15. Transfira o eluído de 25 μL contendo RNA total para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, guarde-o a -80 ° C antes de usar.

3. Transcrição reversa do ARN total

NOTA: Referência e adesão à Informação Mínima para Publicação da Experiência quantitativa em PCR em Tempo RealAs diretrizes de iments (MIQE) incentivam melhores práticas e ajudam na obtenção de resultados confiáveis ​​e inequívocos ¹² .
NOTA: Aqui, um total de 1,0 μg de ARN isolado é transcrita de forma reversa usando a transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT.

1. Coletar os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL; Tubos de tiragem de oito poços; Água sem RNase; gelo; Kit de transcriptase reversa (ver tabela de materiais) ¹¹ .
2. Prepare uma solução de mistura principal que contenha 2,0 μL de mistura de ácido nucleico 10x, 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa (do kit) e 4,0 μL de 5x tampão hi-spec para um total de 8,0 μL por tubo.
3. Dispense 8,0 μL de solução de mistura principal (do kit) em cada tubo.
4. Meça a quantidade de RNAs totais usando um espectrofotômetro. Adicione 1,0 μg de RNAs isolados purificados da amostra de membrana peritoneal para cada tubo.
   NOTA: qRT-PCR pode ser executado usiNg ARNs totais como um modelo sem transcrição reversa para o controle de qualidade de RNAs purificados. Se algum DNA estiver contaminado, os produtos de amplificação inesperados são observados por qRT-PCR.
5. Adicione água livre de RNase a cada tubo para um total de 20 μL. Em seguida, misture bem por pipetagem e centrifugá-lo por 15 s.
6. Incubar as amostras durante 60 min a 37 ° C. Inmediatamente incubar durante 5 min a 95 ° C.
   NOTA: Esta etapa pode ser realizada em um termociclador.
7. Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga e dilua dez vezes (1:10) com água sem RNase.
8. Armazene o cDNA diluído no gelo temporariamente e a -80 ° C por longo prazo antes do uso.

4. qRT-PCR de miARN

NOTA: qRT-PCR de miARN é realizado usando corante intercalante. Aqui, primers para RNA, U6 pequeno nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p foram usados.

1. Colecione os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, placa de reação de 96 poços para qRT-PCR, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, iniciadores específicos de miARN, kit de PCR com base de corante verde (ver tabela de materiais) ¹¹ e um Instrumento de PCR em tempo real.
2. Prepare uma mistura principal contendo 12,5 μL de mistura mestre de PCR 2x, 2,5 μL de 5 μM de implante de miARN dissolvido em água livre de nuclease e 1,25 μL de primário universal 10x para cada poço.
3. Distribua 22,5 μL de mistura principal em cada poço da placa de 96 poços.
4. Adicione 2,5 μL de ADNc de molde a cada poço.
5. Selar a placa com filme adesivo para a placa de reação de 96 poços. Em seguida, centrifugue a placa a 1000 xg por 30 s.
6. Execute o programa de ciclagem PCR com o instrumento de PCR em tempo real e o software da seguinte maneira.
   1. Defina a placa no instrumento de PCR em tempo real. No software de PCR em tempo real, defina propriedades experimentais (entrada experimentalNome, escolha "96-poços" para o tipo de instrumento experimental, escolha "Método 2 ^{- ΔΔCT} " para o método de quantificação, escolha "Reagentes verdes SYBR" para o reagente para detectar a seqüência-alvo, escolha "Velocidade de rampa padrão" para o Execução de instrumento).
   2. Em seguida, atribua nomes às amostras e meta miARNs em cada poço. As amostras são sempre testadas em duplicado ou triplicado para obter dados suficientes para validação dos resultados. Selecione amostra de referência e controle endógeno. Selecione "nenhum" para que o corante use como referência passiva.
   3. Insira um volume de reação de "20 μL" e as seguintes condições de ciclagem de PCR no software de PCR em tempo real de acordo com as instruções: pré-incubação a 95 ° C por 15 min e então 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 15 s , Recozimento a 55 ° C durante 30 s, e extensão a 70 ° C durante 30 s.
7. Analise dados qRT-PCR vocêCante o software do instrumento de PCR em tempo real. Confirme se o limite e a linha de base que são determinados automaticamente pelo software são apropriados em cada poço.
8. Verifique o ciclo de limiar dos miRNAs alvo em cada amostra. O ciclo limiar é a interseção entre uma curva de amplificação e uma linha de limiar. Então, normalize o nível de expressão dos miRNAs alvo contra RNU6-2 como controle endógeno e calcule o nível de expressão relativa dos miRNAs alvo usando o método 2 ^{- ΔΔCT 13} .
   NOTA: Note-se que a estabilidade do nível de expressão do miARN de controle endógeno deve ser verificada. Nesta experiência, a RNU6-2 foi confirmada para ser expressa em alto nível e relativamente invariante em cada grupo.

Resultados

Os resultados apresentados aqui são baseados em nosso estudo relatado anteriormente ⁸ . Nós investigamos o perfil de expressão de miARN na fibrose peritoneal. A fibrose peritoneal é uma importante complicação na diálise peritoneal. É caracterizada pela perda da monocamada de células mesoteliais e pelo excesso de acumulação de componentes da matriz extracelular e está associada à insuficiência da membrana peritoneal ^{14 ,}

Discussão

Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs na membrana peritoneal de ratos foram purificados com sucesso e detectados usando qRT-PCR. A confiabilidade da análise de dados de qRT-PCR depende da qualidade dos miARN purificados. Portanto, a pureza dos miRNAs pode ser verificada antes da qRT-PCR pela proporção de absorvência a 260 nm para a de 280 nm, que pode ser medida usando um espectrofotômetro. Quando a amplificação significativa do miARN não pode ser obtida usando qRT-PCR, a concentração de ADNc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign