JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

Abstract

גמישות פנוטיפית מתייחסת לתופעה שבה תא להשיג זמני תכונות של שושלת אחרת. במהלך התקדמות קרצינומה, גמישות פנוטיפית שמניע הפלישה, הפצת גרורות. ואכן, בעוד רוב המחקרים של גמישות פנוטיפית כבר בהקשר של קרצינומות נגזרות האפיתל, מתברר סרקומות, אשר המזנכימה במקורו, גם להפגין גמישות פנוטיפית, עם תת-קבוצה של סרקומות עוברת תופעה דומה mesenchymal- מעבר אפיתל (MET). הנה, פיתחנו שיטה המרכיבות את המשפחה miR-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2) לחקות תופעה זו נתקלה דמוי שנצפתה החולה סרקומה samples.We ברצף להביע GRHL2 ומשפחת miR-200 באמצעות התמרה התא transfection, בהתאמה , כדי להבין את הבסיס המולקולרי טוב יותר של מעברים פנוטיפי אלה בתאי סרקומה. תאי סרקומה להביע miR-200s ו GRHL2 הפגינו characterist האפיתל משופרICS במורפולוגיה התא ושינוי של סמנים ביולוגיים אפיתל mesenchymal. מחקרים עתידיים באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להבין את ההשלכות פנוטיפי טוב יותר של תהליכים MET-כמו על תאי סרקומה, כגון הגירה, פלישה, נטייה גרורתי, והתנגדות טיפול.

Introduction

גמישות פנוטיפית מתייחסת מעבר הפיך בין פנוטיפים הסלולר, והוא מחולק בדרך כלל לשני סוגים, האפיתל אל המזנכימה (EMT) מעברים מעברי המזנכימה אל האפיתל (MET). גמישות פנוטיפית זה ממלא תפקיד חשוב בתהליכים נורמליים של יצורים רב-תאיים, כגון פיתוח ריפוי פצעים 1; עם זאת, מסלולים אותם ותוכניות ביטוי גנים יכולים גם לגרום למחלות, כגון סיסטיק (הנסקרת ב 2, 3, 4) וגרורות קרצינומה (הנסקרת ב אזכור 5, 6, 7, 8). במהלך גרורות, למשל, EMT משבש קוטביות בתא, תאי תאי אינטראקציות, ומקדמת פלישה 9, 10. יחד, EMT לתרוםהים למדינה פנוטיפי המאפשר הפצת תאים סרטניים. בנוסף, EMT גם מוביל שורה של שינויים פנוטיפי אחרים שמניעים פנוטיפ אגרסיבי, כולל הסרת הפיקוח של מטבוליזם תאי סרטן 6, התפתחות עמידות לתרופות 11, 12, יכולת גידול-ייזום מוגברת 13, 14 ו לארח התחמקות החיסון 15.

גמישות פנוטיפית נחקרה היטב להתקדמות קרצינומה; עם זאת, סרקומות גם להפגין גמישות פנוטיפית. מעניין, נראה כאילו חלק מאותם נהגים של גמישות פנוטיפית בקרצינומות גם לתרום פלסטיות סרקומה ואגרסיביות. למשל, בתאי הגידול במחזור (CTCs) מחולים סרקומה הוכחו להביע EpCAM, חלבון על פני התא שנמצא בדרך כלל ב- תאי האפיתל 16. Additionally, 250 דגימות סרקומה של רקמות רכות סווגו בתור אפיתל דמוי או המזנכימה דמוי מבוסס על ביטוי גנים. מטופלי החתימה ביומרקרים דמוי אפיתל היה פרוגנוזה טוב יותר מאשר חולה עם החתימה ביומרקרים דמוי המזנכימה 17. זה עולה בקנה אחד עם קרצינומה רב, בם חולה עם יותר קרצינומות דמויות אפיתל יש תוצאות טובות יותר בהשוואה לחולים עם גידולים המזנכימה דמוית יותר 18.

בעוד שחלק סרקומות להציג סמנים ביולוגיים ומסלולי ביטוי גנים עקביים עם MET, את הבסיס המולקולרי של גמישות פנוטיפית זה להישאר ממעטים להבין. כדי לחקור את המנגנונים ואת הנהגים של נפגשו סרקומה פיתחנו מודל של אינדוקציה MET באמצעות שני גורמים ספציפיים אפיתל, microRNA (Mir) -200 בני משפחה grainyhead דמוי 2 (GRHL2). מיר-200s הם משפחה של RNA ללא קידוד קטן המווסתים ביטוי גנים באמצעות קשירה 3' UTRs של messenger RNA ותרגום מניעה לתוך חלבון. משפחת miR-200 מורכבת משתי קבוצות משנה - אחד המכיל miR-141 לבין מיר-200a, והשני כולל miR-200B, miR-200C, ומיר-429. בני משפחת miR-200 מועשרים ברקמות האפיתל, ואת אובדן miR-200s קשורה גרורות קרצינומה 19. משפחת miR-200 הוא downregulated גם סרקומות של רקמות רכות לעומת הרקמות הבריאות 20. בדומה מיר-200s, GRHL2 הוא הרגולטור, כי הוא מפתח חשוב לפיתוח האפיתל 21. גורם שכפול GRHL2 פועל בשתי דרכים כדי upregulate גני האפיתל, כגון E-cadherin: 1) בתאי האפיתל, GRHL2 ישירות מדחיק את רגולטור EMT, ZEB1 22; ו 2) GRHL2 מפעיל תעתיק ישירות של גנים האפיתל 23. החקירות הקודמות שלנו הראו כי ביטוי משולב של miR-200s ו GRHL2 בתאי סרקומהגורם פנוטיפ MET-כמו 24. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל במבחנה של אינדוקציה נפגשו תאי סרקומה באמצעות ביטוי אקטופי של miR-200s ו GRHL2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכן DMEM עבור תרבית תאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר (FBS) ו 5 מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין (5000 U / mL) 500 מ"ל של DMEM. המדיום הזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
  2. Resuspend פריימרים lyophilized במים nuclease ללא לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. חנות מחדש מושעה פריימרים ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. הכן assay radioimmunoprecipitation (ריפה) חיץ (150 מ"מ NaCl, deoxycholate נתרן 0.5%, 0.1% SDS, 50 מ"מ טריס, pH 8.0). מוסף עם מעכבי פרוטאז קוקטייל לפני השימוש ולשמור חיץ על הקרח כאשר בשימוש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכן 10 מ"ג / מ"ל ​​polybrene (ברומיד hexadimethrine) מסנן מים מזרק כדי לעקר באמצעות מסנן polyethersulfone 0.45 מיקרומטר. פתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
  5. הכן פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​עובד של כלוריד tetrazolium כחול ניטרו ידי המסת 10 מ"ג ב 10 מ"ל של PBS. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.

2. התמרה lentiviral של GRHL2

יום 1

  1. פלייט 3 x 10 5 תאים HEK293T לכל גם צלחת 6-היטב 2 מ"ל של DMEM בתוספת. לכמת תאים באמצעות נגד תא אוטומטי. תאים צריכים להיות 40 - 60% ומחוברות לאחר תרבות לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

יום 2

  1. לדלל 2 מיקרוגרם של וקטור ריק (pCMV-UBC-EGFP) או 2 מיקרוגרם של pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 ב 200 μL של סרום ללא מדיה יחד עם 1.8 מיקרוגרם של pΔ8.9 ו 0.2 מיקרוגרם של pCMV-VSV פלסמידים עוזר -G. בצינור נפרד, לדלל 4 μL של מגיב transfection השומנים מבוסס ב 200 μL של סרום ללא מדיה לכל transfection (8 μL ב 400 μL עבור שתי דגימות). הוספת 200 μL של תערובת מגיב transfection לכל פתרון פלסמיד דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. במהלך אינקובטוריםtion, לשטוף תאים HEK293T ידי הסרת בינוני על ידי שאיפה ואקום ושטיפה תאים עם 1 מ"ל של PBS. החלף את PBS עם 800 μL של סרום ללא מדיה. אחרי 20 דקות, להוסיף 200 μL של מגיב transfection: תערובת פלסמיד מן dropwise צעד 2.2 לכל היטב דגירה תאים עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% 2 CO.
  3. מוציאים בזהירות בינוני transfection ידי השאיפה ואקום ולהחליף עם 2 מ"ל של שיושלם DMEM. מחזירים את התאים החממה לתרבות לילה.
    הערה: תאי HEK293T הם חסיד רופף. החלפת מדיה חייבת להתבצע בזהירות כדי להגביל הסרת תאים מהעומק של המנה או בקבוק.

יום 3

  1. רענן התקשורת על תאים HEK293T טרנספקציה וצלחת 3 x 10 5 תאים RD לכל גם צלחת 6-היטב 2 מ"ל של DMEM בתוספת. תאי תרבות הלילה. תאי RD הם קו תא ראדומיוסרקומה אנושי, זמין מסחרי.

יום 4

  1. אסוף תקשורת ויראלי מתאי HEK293T. פיפטה DMEM התקשורת מהתאים HEK293T ומקום לתוך חרוטי 15 מ"ל חדש. בזהירות להחליף עם DMEM תקשורת חדשה ותא המקום HEK293T בחזרה בחממה למחרת.
  2. להוסיף 2 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​polybrene לכל מ"ל של התקשורת ויראלי לשני צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל (אחד עבור transfection וקטור ריק אחר עבור transfection GRHL2). מזרק מסנן התקשורת ויראלי ידי הסרת הבוכנה של מזרק מ"ל 3 ולצרף מסנן 0.45 מיקרומטר polyethersulfone אל קצה.
    1. מוסיף את התקשורת ויראלי שנאספה בשלב 2.6 לתוך החבית של המזרק, לצלול לתוך תקשורת 50 צינורות החרוטים החדשים המ"ל המכילים polybrene. סר מדיה מתאי RD ידי שאיפה ואקום ולהוסיף תקשורת ויראלי מסוננת לתאי RD.

יום 5

  1. יום 4. חזרו על תאי HEK293T יכולים להיות מושלכים לאחר בתקשורת ויראלי נאספה.

יום 7

  1. תאים RD לשטוף עם 1 מ"ל של PBS ולהוסיף 200 μL של טריפסין 0.05% בכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להוסיף 2 מ"ל של התקשורת שיושלם, ולעבור ההשעיה לתא חרוטי 15 מ"ל חדש. תאים צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ומדיה לשאוב. גלולה ב 1 מ"ל של DMEM (בתוספת FBS 5% ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין).
    הערה: שימוש אחוז גבוה יותר של FBS עלולה לגרום סתימה במהלך cytometry הזרימה
    1. תאי סינון עבור cytometry הזרימה. השתמש פיפטה ליישם את ההשעיה תא 1 מ"ל RD דרך מסנן 30 מיקרומטר לתוך זרימת cytometry צינורות ושפופרות מקום על הקרח.
    2. מיין EGFP + תאים 26 לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge המכיל 0.5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין ומניחים על קרח. EGFP פלייט + ממוינים התאים הכולל של 1 מ"ל של DMEM בתוספת לתוך הבאר אחד של צלחת 12-היטב ובמקום בחממה לתרבות.
      ; הערה: התשואה של EGFP + תאי זרימת cytometry לאחר תמרה זו היא בדרך כלל נמוכים (50,000-100,000 תאים). תאים ייתכן שיהיה צורך בתרבית למשך 10 - 14 ימים לפני שתמשיך לשלב 3.

3. Transfection ההפוך של miR-200s

  1. כן 50 מיקרומטר מניות של מחקת miR-200 באמצעות מחזורי nuclease ללא H 2 O. Aliquot מניות ולאחסן ב -20 ° C, כדי למנוע הקפאת חוזרות / פשרה.
  2. להוסיף 3 μL של כל 50 מיקרומטר miR-200 לחקות (Mir-200a, miR-200B, ומיר-200C) כדי 300 μL של סרום ללא מדיה או 9 μL של 50 מירנה הביקורת השלילית מיקרומטר 300 μL סרום ללא מדיה.
  3. להוסיף 6 μL של מגיב transfection ספציפיים siRNA כדי 600 μL של סרום ללא מדיה ולחלק 300 μL של תערובת זו לשתי צינורות, אחד עבור כל אחד משני תערובות מיר צעד 3.2. מערבבים את 300 μL של כל תערובת מיר צעד 3.2 עם שילוב של 300 μL של מגיב transfection. דגירה של 20 דקות ב חדר temperature.
  4. בעוד דוגרים, להכין ההשעיה תא של 600,000 תאים EGFP + RD להביע EV או GRHL2 נוצר בסעיף 2 ב 2.4 מ"ל (250 תאים / μL) של סרום ללא מדיה לכל טיפול.
  5. בשנת צלחת 24-היטב, להוסיף 100 μL לכל טוב של תערובת miR-200 או לערבב ביקורת שלילית משלב 3.3 לתוך שש בארות, ולאחר מכן להוסיף 400 μL של כל השעית תא לשלוש בארות של כל ערבוב של מיר.
  6. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לילה ולשנות תקשורת שתושלם במלואו DMEM למחרת. איסוף תאים 2 ימים מאוחר יותר לניתוח באמצעות המאגר המתאים (ראה להלן). זמן לשגות הדמיה של תאי סרקומה RD עוברים MET זמינה כחומר משלים. תמונה כל טוב כל 2 שעות עם מטרת 10X באמצעות תרמי-תא חי אוטומטי 27.

4. מיצוי RNA, שעתוק הפוך, ו qPCR

  1. חלץ RNA על פי הוראות היצרן באמצעות RNA סטנדרטימיצוי ערכה 24. RNA שחולץ ניתן לאחסן -80 מעלות צלזיוס.
  2. לכמת ריכוז RNA. הפשרה ולעבוד עם RNA על קרח. כדי לכמת ריכוזי RNA, למדוד ספיגת UV ב 260 ננומטר עם ספקטרופוטומטר קורא צלחת פי הפרוטוקול של היצרן. לדלל כל דגימות לריכוז הנמוך ביותר עם מים nuclease חינם.
  3. בצע שעתוק לאחור של רנ"א מכיל לתוך ה- DNA משלים (cDNA). שלב לא פחות מ 100 ננוגרם של רנ"א הכל עם חיץ PCR, תמהיל dNTP (100 מ"מ), תחל hexamer אקראית, הפוכה transcriptase ו nuclease ללא מים בנפח תגובה 20 μL 24. הפעל מחזורי RT פי הפרוטוקול של הייצור. cDNA ניתן לאחסן לטווח ארוך ב -20 ° C.
  4. לדלל 20 תגובות μL 100 μL עם 80 μL של H nuclease- חופשית 2 O.
  5. מערבבים 5 μL של צבע intercalating הקרינה מבוססי שילוב הורים 2x qPCR, 0.06 μL של כל פריימר 10 מיקרומטר, And 2 μL של התגובה בדילול RT לדגימה.
  6. הפעל qPCR על פי הפרוטוקול של היצרן עבור מיקס מאסטר הקרינה מבוססת.
  7. לכמת הכמויות היחסיות של mRNA על ידי שיטת CT דלתא לנרמל ל GAPDH. שרטט את ביטוי mRNA הממוצע של ביולוגי משכפל ± סטיית תקן לכל קבוצת טיפול.
    הערה: אמצעי זהירות מיוחדת יש לנקוט כאשר עובד עם RNA כדי להימנע ממגע עם RNases, כגון באמצעות פלסטיק RNase ללא ריאגנטים. ציוד Non-פעמי צריך להיות מטופלים לפני השימוש כדי להסיר RNases.

5. Immunofluorescence מכתים

  1. בעקבות צעד 3.6, מדיה לשאוב ידי שאיפת ואקום מתאי RD בפורמט 24-היטב.
  2. תקן תאים על ידי הוספת 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לכל היטב דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בעקבות קיבעון, תאים במקום ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
  3. Permeabilizeתאים על ידי הוספת 500 μL של PBS + 0.2% Triton-X100 דגירה 30 דקות ב RT. על ידי שאיפת ואקום, ולהסיר חיץ permeabilization ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  4. בלוק ב 500 μL של 5% אלבומין בסרום שור (BSA) / PBS דגירה תאים עבור 30 דקות ב RT. תאים ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
  5. הכן דילול נוגדן ראשוני. פיפטה 200 μL של 5% BSA / PBS לכל גם לתוך חרוטי 15 מ"ל (12 בארות = 2.4 מ"ל) ולהוסיף 1 μL של נוגדן ראשוני לכל מ"ל של 5% BSA / PBS הצורך. סור חסימת חיץ ידי שאיפת ואקום ולחלק 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל היטב כל אחד.
    1. דגירת תאים 1: 1000 נוגדנים עיקריים מדוללים 5% BSA / PBS עבור 1 ש 'ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה, לשטוף תאים פעמים עם PBS.
  6. הכן את דילול נוגדנים משני באותו נפח של 5% BSA / PBS כאמור. מוסיף את הנוגדנים משני מרחיקות האדומים מצומדות צבע באמצעות 1: דילול 2000. בנוסף להוסיף1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של צבע Hoechst לתערובת. הסר את PBS ולהוסיף 200 μL של תמהיל היטב כל אחד.
    1. לדגור על RT עבור 1 h בחושך. לשטוף 3 פעמים עם PBS, לעזוב התאים PBS, להגן על התאים מפני האור באמצעות רדיד. תאים ניתן לאחסן 4 ° C במידת הצורך.
  7. תאי תמונה בהגדלה הכוללת 400X על מיקרוסקופ epifluorescence הפוך עם גל עירור 594 - 650 ננומטר.

6. מערבי סופג

  1. שטפו תאים מן 3.6 פעמיים עם קרים כקרח PBS. על קרח, תאים lyse עם 50 μL של 1x ריפה חיץ בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x.
  2. lysates רוק בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, לאסוף lysates לתוך 1.5 צינורות מ"ל, ו צנטריפוגות במהירות גבוהה (20,000 XG) במשך 5 דקות כדי להבהיר דגימות. lysates תא ניתן לאחסן לטווח ארוך ב -80 ° C במידת הצורך.
  3. לכמת החלבון הכולל באמצעות assay ברדפורד ו aliquot כמות שווה של חלבון לתוך צינורות microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל. בריןg דגימות נפח שווה באמצעות חיץ ריפה ו חיץ טעינת 3x Laemmli בתוספת 2-mercaptoethanol.
  4. דגירה דגימות במאגר טעינת מדגם 1x Laemmli עבור 5 דקות ב 95 ° C ולהפעיל SDS-PAGE באמצעות ג'ל 4-12% טריס-גליצין ב 200 V עבור 45 דקות. כמות טווחי טעון חלבון בהתאם לקו הסלולרי. בחלק מהמקרים, 50-100 מיקרוגרם של חלבון הכוללת נדרש לזהות E-cadherin בשורות תאי המזנכימה.
  5. העברת חלבונים על גבי קרום nitrocellulose עבור 2 שעות ב 50 V ב 1x טריס-גליצין חיץ העברה.
  6. קרום בלוק עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס חיץ חסימה מבוססת BSA.
  7. מדולל נוגדנים העיקרית בבית 1: 1000 ריכוז 5 מ"ל של חיץ חסימה, להוסיף דילול של קרום, דגירה עם נדנדה עדין עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. קרום Wash 3 פעמים ב PBS עם 0.05% Tween-20.
  8. דגירה ממברנות עבור 1 ש 'ב RT עם secondar ניאון בשילוב אינפרא אדוםy נוגדן בבית 1: 20,000 דילול בחסימת המאגר כאמור.
  9. לשטוף פעמיים הממברנה ב PBS עם 0.05% Tween-20 ולאחר מכן פעם אחת ב PBS.
  10. קרום תמונה באמצעות גילוי הקרינה האינפרה-אדום סטנדרטי.

7. מבחני צמיחה Anchorage-עצמאית

הערה: עבור פרוטוקול assay רך אגר מפורט, ראו 28.

  1. 2x DMEM תקשורת סטרילי חמה כדי 42 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים. במהלך תקופה זו, חום מראש autoclaved agarose 1% במיקרוגל למשך 3 דקות. מיקרוגל עבור 30 s נוספות בכל פעם לפי הצורך או עד שהיא נמסה לחלוטין. הזז agarose כדי באמבט מים C 42 °.
  2. מניחים צינור חרוטי 50 מ"ל בכוס עם 42 ° C מים במנדף סטרילי ומערבבים agarose 1% ומדיה 2x DMEM בתוך 1: חשבונאות יחס 1 עבור 1.5 מ"ל של תערובת לכל היטב צלחת 6-היטב. תמיד להכין תוספת DMEM / agarose לתת דין וחשבון על שגיאה pipetting ולהימנע בועות.
  3. מוסיפים לתערובת אתהצדדים של הבאר, הבטחת אין בועות יוצרים ולתת לעמוד במשך 30 דקות ב RT.
  4. בעוד השכבה התחתונה היא המחזקת, להכין כל קבוצה של תאים RD טרנספקציה בשלב 3 על ידי aspirating התקשורת ושטיפת פעם עם 1 מ"ל PBS. לשאוב PBS ולהוסיף 0.2 מ"ל של טריפסין 0.05% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. לנטרל טריפסין ב 0.8 מיליליטר של תקשורת ותא triturate להקים השעית תא בודד. העבר ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל.
  6. ספירת תאים לחשב נפח תא השעיה דרושה 10,000 תאים לכל טוב.
  7. מחממים agarose 0.6% במיקרוגל למשך 3 דקות ואחריו 30 s בכל פעם, עד נמס לחלוטין. זז agarose כדי 42 מעלות צלזיוס מים באמבטיה.
  8. מניחים צינור חרוטי 50 מ"ל בכוס עם 42 ° C מים במנדף סטרילית. מערבבים 0.6% agarose ו ההשעיה תא מדולל 1: יחס 1 להכין 1.5 מ"ל של תערובת לכל היטב צלחת 6-היטב. תמיד להכין השעית תא נוספת / agarose לערבב לתת דין וחשבון על שגיאת pipetting וכדי למנוע בועות.
    הערה: חשוב לעבוד על 42 מעלות צלזיוס כאן. אם הטמפרטורה נמוכה מדי את התערובת תהיה לגבש לפני הציפוי, וטמפרטורות מעל 42 מעלות צלזיוס תשפענה על כדאיויות תא.
  9. מערבבים היטב על ידי triturating תאים מספר פעמים ולהוסיף תא תערובת אל בארות, הבטחת אין טופס בועות, ולתת לחזק עבור 20 דקות ב RT.
  10. להוסיף 2 מ"ל של התקשורת בתוספת היטב כל ולעבור צלחות חממה.
    1. שינוי בתקשורת פעם בשבוע למשך 3-4 שבועות או עד יוצרי מושבות רבות תאיות. היזהר שלא לגעת אגרו כאשר הסרת תקשורת על ידי שאיפת ואקום. לחלופין, להשתמש P1000 כדי להסיר את השכבה העליונה של תקשורת הנוזלית.
    2. הכתם צלחות אגר רך על ידי הוספת 200 μL של ניטרו פתרון כלוריד כחול tetrazolium (1 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS) דגירה את הצלחת לילה בשעה 37 ° C. חלף תקשורת למחרת עם PBS עבור הדמיה.
    3. בארות תמונה ב 40X גדלה מוחלטת על מיקרוסקופ הפוכה.
    4. ביצוע ניתוח על ImageJ עבור אזור המושבה ומספר. מגרש אומר מספר מושבה של ביולוגי משכפל ± סטיית תקן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סכימה לזירוז נפגש תאי סרקומה

ציר זמן בכלל עבור האינדוקציה של שינויי MET דמויי תאי סרקומה מוצג באיור 1. פרוטוקול מתחיל transducing GRHL2 (איור 1A), ואחריו transfection של משפחת miR-200 (איור 1B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

סרקומות הן נדירות, אבל מאוד סוגי סרטן אגרסיביים של השושלת המזנכימה. למרות השושלת המזנכימה שלהם, קבוצת משנה של סרקומות מופיע לעבור במעבר פנוטיפי למצב אפיתל דמוי יותר. יש מתג MET-ככה רלוונטי פרוגנוסטיים, כמו חולים עם גידולים אפיתל דמוית יותר הם פחות אגרסיביים 24...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

JAS מודה תמיכה ממכון הסרטן Duke, המעבדה לאונקולוגיה המין והשתן אוניברסיטת דיוק, ואת מחלקת אורתופדיה אוניברסיטת דיוק. HL נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) המרכז לפיסיקה ביולוגית תיאורטית (NSF PHY-1,427,654) ו- NSF DMS-1,361,411, וכתוצאה CPRIT (מניעת סרטן ולמחקר במכון טקסס) Scholar ב Cancer Research של מדינת טקסס בבית רייס האוניברסיטה. KEW נתמכה על ידי MKJ NIH F32 CA192630 ו HL נהנו מן הדיונים שימושי עם מרי ג Farach-קרסון, JN Onuchic, סמיר M. Hanash, קנת ג'יי Pienta, ו דונלד ס קופי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

References

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39(2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241(2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998(2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Shenghan Xu

to:

Shengnan Xu

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122mesenchymaltransfectionmicroRNA 200GRHL2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved