JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Erratum Notice
  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Erratum
  • Ristampe e Autorizzazioni

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Riepilogo

Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell'impatto biologico della plasticità fenotipica sull'aggressività cancro e trattamenti.

Abstract

plasticità fenotipica si riferisce a un fenomeno in cui le cellule transitoriamente ottenere tratti di un altro lineage. Durante la progressione del carcinoma, plasticità fenotipica spinge l'invasione, la diffusione e le metastasi. Infatti, mentre la maggior parte degli studi di plasticità fenotipica sono stati nel contesto di carcinomi epiteliali derivate, si scopre sarcomi, che sono mesenchimali in origine, anche esibire plasticità fenotipica, con un sottoinsieme di sarcomi subire un fenomeno che assomiglia a un mesenchymal- transizione epiteliale (TEM). Qui, abbiamo sviluppato un metodo comprendendo la famiglia miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) per imitare questo fenomeno MET-come osservato nel sarcoma paziente samples.we sequenzialmente esprimono GRHL2 e la famiglia miR-200 utilizzando la trasduzione delle cellule e trasfezione, rispettivamente , per meglio comprendere le basi molecolari di queste transizioni fenotipiche in cellule di sarcoma. cellule di sarcoma che esprimono miR-200 e GRHL2 hanno dimostrato una maggiore caratteristica atmosfera epitelialeCI della morfologia cellulare e le modificazioni del epiteliali e mesenchimali biomarker. Studi futuri usando questi metodi possono essere utilizzati per comprendere meglio le conseguenze fenotipiche dei processi MET simili su cellule di sarcoma, quali la migrazione, invasione, propensione metastatica, e resistenza alla terapia.

Introduzione

plasticità fenotipica si riferisce ad una transizione reversibile tra fenotipi cellulari, ed è generalmente suddiviso in due tipi, epiteliali-to-mesenchimale (EMT) transizioni e mesenchimali-to-epiteliale transizioni (TEM). Questa plasticità fenotipica gioca un ruolo importante nei normali processi di organismi multicellulari, come lo sviluppo e la guarigione della ferita 1; tuttavia, questi stessi percorsi e programmi di espressione genica può anche portare a malattie come la fibrosi (valutata in 2, 3, 4) e carcinoma metastasi (valutata in riferimento 5, 6, 7, 8). Durante la metastasi, per esempio, EMT sconvolge la polarità delle cellule, le interazioni cellula-cellula, e promuove l'invasione 9, 10. Insieme, EMT contribuires ad uno stato fenotipico che facilita la diffusione delle cellule tumorali. Inoltre, EMT comporta anche una serie di altre alterazioni fenotipiche che guidano un fenotipo aggressivo, tra deregolazione del metabolismo delle cellule del cancro 6, lo sviluppo di resistenza ai farmaci 11, 12, maggiore capacità tumore-apertura 13, 14 e ospitare evasione immune 15.

plasticità fenotipica è stato ben studiato nella progressione carcinoma; Tuttavia, sarcomi presentano inoltre plasticità fenotipica. È interessante notare che sembra come se alcuni degli stessi conducenti di plasticità fenotipica in carcinomi contribuiscono anche al sarcoma plasticità e l'aggressività. Ad esempio, è stato dimostrato cellule tumorali circolanti (CTC) di pazienti con sarcoma di esprimere EpCAM, una proteina di superficie cellulare che si trova in genere su cellule epiteliali 16. Addizionale, 250 campioni sarcomi dei tessuti molli sono stati classificati come epiteliali simile o mesenchimali come base di espressione genica. I pazienti nella firma biomarker epiteliale simile hanno avuto una prognosi migliore rispetto ai pazienti con la firma biomarcatore mesenchimali simil-17. Ciò è coerente con molti carcinomi, in cui i pazienti con più carcinomi epiteliali-come hanno risultati migliori rispetto ai pazienti con più tumori mesenchimali simil-18.

Mentre alcuni sarcomi visualizzano biomarker e percorsi di espressione genica coerenti con il TEM, le basi molecolari di questa plasticità fenotipica rimangono poco compresi. Per studiare i meccanismi e gli autisti di MET nel sarcoma abbiamo sviluppato un modello di induzione MET usando due fattori specifici epiteliali, il microRNA (miR) -200 famiglia e grainyhead-like 2 (GRHL2). I miR-200 sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica legandosi alla UTR di messen 3'ger RNA e prevenire traduzione in proteina. La famiglia miR-200 è costituito da due sottogruppi - uno contenente miR-141 e miR-200a, e l'altro tra cui miR-200b, 200c-miR, e miR-429. I membri della famiglia miR-200 sono arricchite nei tessuti epiteliali, e la perdita di miR-200 è associata con metastasi nei carcinomi 19. La famiglia miR-200 è anche downregulated in sarcomi dei tessuti molli rispetto al tessuto normale 20. Simile alle MIR-200s, GRHL2 è un regolatore chiave che è importante per lo sviluppo epiteliale 21. Il fattore di trascrizione GRHL2 agisce in due modi per upregulate geni epiteliali, come E-caderina: 1) Nelle cellule epiteliali, GRHL2 reprime direttamente il principale regolatore EMT, ZEB1 22; e 2) GRHL2 direttamente attiva la trascrizione dei geni epiteliali 23. Le nostre indagini precedenti hanno dimostrato che l'espressione combinata di miR-200 e GRHL2 in cellule di sarcomainduce un fenotipo MET simile 24. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per creare un modello in vitro del TEM induzione in cellule di sarcoma usando l'espressione ectopica di miR-200 e GRHL2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare DMEM per coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 mL di penicillina-streptomicina (5.000 U / ml) a 500 ml di DMEM. Questo terreno può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi.
  2. Risospendere primer liofilizzati in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 10 uM. primer negozio risospese a -20 ° C.
  3. Preparare dosaggio radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone (150 mM NaCl, 0.5% desossicolato sodico, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Supplemento con cocktail inibitore della proteasi prima dell'uso e mantenere tampone sul ghiaccio quando è in uso. Conservare a 4 ° C.
  4. Preparare 10 mg / mL polibrene (hexadimethrine bromuro) filtro acqua e la siringa per sterilizzare utilizzando un filtro polietersulfone 0,45 um. Soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi.
  5. Preparare una soluzione di 1 mg / ml di lavoro del nitro blu tetrazolio cloruro sciogliendo 10 mg in 10 ml di PBS. Conservare a 4 ° C.

2. lentivirali trasduzione del GRHL2

Giorno 1

  1. Piastra 3 x 10 5 cellule HEK293T per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. Quantificare cellule utilizzando un contatore automatico di cellule. Le cellule devono essere 40 - 60% confluenti dopo coltura di una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

Giorno 2

  1. Diluire 2 pg di vettore vuoto (pCMV-UBC-EGFP) o 2 pg di pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 in 200 ml di mezzo privo di siero insieme con 1,8 ug di pΔ8.9 e 0,2 pg di pCMV-VSV plasmidi helper -G. In un tubo separato, diluire 4 ml di una base lipidica reagente di trasfezione in 200 ml di mezzo privo di siero per ogni trasfezione (8 ml in 400 microlitri per due campioni). Aggiungere 200 microlitri di miscela reagente di trasfezione per ogni soluzione plasmide e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  2. Durante l'incubazione, lavare le cellule HEK293T rimuovendo il mezzo mediante aspirazione sottovuoto e risciacquo cellule con 1 ml di PBS. Sostituire il PBS con 800 ml di mezzi senza siero. Dopo 20 minuti, aggiungere 200 ml di reagente di trasfezione: miscela plasmide dal punto 2.2 a gocce a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C in 5% CO 2.
  3. rimuovere accuratamente mezzo trasfezione mediante aspirazione a vuoto e sostituirlo con 2 mL di supplementato DMEM. Riportare le cellule per l'incubatore per la cultura durante la notte.
    NOTA: le cellule HEK293T sono vagamente aderente. sostituzione dei supporti deve essere effettuata con cautela per limitare la rimozione delle cellule dal fondo del piatto o del matraccio.

3 ° giorno

  1. Aggiornare multimediale su cellule trasfettate e HEK293T piastra 3 x 10 5 cellule RD per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. cellule cultura durante la notte. cellule RD sono una linea cellulare di rabdomiosarcoma umano disponibile in commercio.

4 ° giorno

  1. Raccogliere media virali dalle cellule HEK293T. Pipettare il supporto DMEM dalle cellule HEK293T e posto in un nuovo 15 ml conica. Ricollocare accuratamente con i nuovi media e cellule DMEM posto HEK293T indietro in incubatrice per il giorno successivo.
  2. Aggiungere 2 ml di 10 mg / mL polibrene per mL di mezzi virali in due nuove provette coniche 50 ml (uno per il vettore trasfezione vuota e un'altra per la trasfezione GRHL2). Filtro per siringa media virali rimuovendo lo stantuffo di una siringa da 3 ml e allegare un filtro da 0,45 micron polietersulfone alla punta.
    1. Aggiungere i media virali raccolti nella fase 2.6 nel cilindro della siringa, e immergersi supporti nelle nuove provette coniche da 50 ml contenente polibrene. Rimozione di supporti da cellule RD mediante aspirazione a vuoto e aggiungere media viral filtrato cellule RD.

5 ° giorno

  1. Ripetere Giorno 4. Cellule HEK293T possono essere scartati dopo che i media virale è stato raccolto.

giorno 7

  1. Lavare le cellule RD con 1 ml di PBS e aggiungere 200 ml di 0,05% tripsina per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 5 minuti, aggiungere 2 ml di terreni integrati, e spostare sospensione cellulare in un 15 ml conica. cellule centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e dei media aspirare. Risospendere in 1 ml di DMEM (supplementato con 5% FBS e 1% di penicillina-streptomicina).
    NOTA: Utilizzando una percentuale maggiore di FBS può causare intasamenti durante citofluorimetria
    1. celle filtranti per citometria di flusso. Utilizzare una pipetta per applicare la sospensione cellulare 1 mL RD attraverso un filtro 30 um in citofluorimetria tubi e Consiglio di tubi su ghiaccio.
    2. EGFP + cellule Ordina 26 in provette da 1,5 ml microcentrifuga contenenti 0,5 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina e posto sul ghiaccio. Piastra EGFP + cellule in totale di 1 ml di DMEM supplementato ordinati in un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti e posto in incubatore per coltura.
      ; NOTA: La resa di cellule EGFP + da citofluorimetria dopo trasduzione è solitamente bassa (50.000-100.000 cellule). Le cellule possono avere bisogno di essere in coltura per 10 - 14 giorni prima di procedere alla fase 3.

3. Reverse trasfezione di Mir-200s

  1. Preparare 50 uM scorte di miR-200 imita utilizzando priva di nucleasi H 2 O. scorte aliquote e conservare a -20 ° C per evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento.
  2. Aggiungere 3 ml di ogni 50 pM miR-200 mimico (miR-200a, miR-200b, e miR-200c) a 300 ml di mezzo privo di siero o 9 ml di 50 mM miRNA controllo negativo a mezzo privo di siero 300 microlitri.
  3. Aggiungere 6 ml di specifici siRNA reagente di trasfezione per 600 ml di mezzo privo di siero e dividere 300 ml di questa miscela in due tubi, uno per ciascuna delle due miscele miR dal punto 3.2. Combinare i 300 ml di ciascuna miscela miR dal passo 3.2 con una miscela di 300 ml di reagente di trasfezione. Incubare per 20 min a camera temperature.
  4. Durante l'incubazione preparare una sospensione cellulare di 600.000 cellule EGFP + RD esprimenti EV o GRHL2 creato nella sezione 2 in 2.4 mL (250 cellule / pl) di mezzo privo di siero per ogni trattamento.
  5. In una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di miR-200 della miscela o della miscela di controllo negativo dal punto 3.3 in sei pozzetti e quindi aggiungere 400 ml di ciascuna sospensione cellulare in tre pozzetti di ogni miscela miR.
  6. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2 durante la notte e cambiare media per integrati pienamente DMEM il giorno seguente. Raccogliere celle 2 giorni più tardi per analisi utilizzando tampone appropriato (vedi sotto). time-lapse imaging di cellule di sarcoma RD sottoposti TEM è disponibile come materiale supplementare. Immagine ciascun pozzetto ogni 2 h con un obiettivo 10X utilizzando un processo automatizzato imager live-cell 27.

4. estrazione dell'RNA, trascrizione inversa e qPCR

  1. Estrarre l'RNA secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando un RNA di seriekit di estrazione 24. RNA estratto può essere conservato a -80 ° C.
  2. Quantificare concentrazione di RNA. Scongelare e lavorare con l'RNA sul ghiaccio. Per quantificare le concentrazioni di RNA, misurare l'assorbanza UV a 260 nm con uno spettrofotometro lettore di piastre secondo il protocollo del produttore. Diluire tutti i campioni per la più bassa concentrazione di acqua priva di nucleasi.
  3. Eseguire la trascrizione inversa di RNA totale in DNA complementare (cDNA). Combinare non inferiore a 100 ng di RNA totale con tampone PCR, miscela dNTP (100 mM), primer esameriche casuali, trascrittasi inversa e acqua priva di nucleasi in un volume di reazione di 20 microlitri 24. Eseguire cicli RT secondo il protocollo del produttore. cDNA può essere immagazzinato a lungo termine a -20 ° C.
  4. Diluire 20 reazioni microlitri a 100 microlitri con 80 ml di priva di nucleasi H 2 O.
  5. Mescolare 5 ml di una fluorescenza a base di colorante intercalante 2x qPCR master mix, 0,06 ml di ogni 10 micron di primer, unnd 2 microlitri di reazione RT diluito per campione.
  6. Eseguire qPCR secondo il protocollo del produttore per il master mix basato sulla fluorescenza.
  7. Quantificare quantità relative di mRNA mediante il metodo CT delta e normalizzare a GAPDH. Tracciare l'espressione dell'mRNA medio di repliche biologiche ± deviazione standard per ciascun gruppo di trattamento.
    NOTA: devono essere prese precauzioni speciali quando si lavora con l'RNA per evitare il contatto con RNasi, come l'utilizzo della plastica e dei reagenti RNasi-free. materiali riutilizzabili devono essere trattati prima dell'uso per rimuovere RNasi.

5. Immunofluorescenza

  1. Seguendo passo 3.6, supporti aspirato mediante aspirazione a vuoto da cellule RD in formato a 24 pozzetti.
  2. Fissare cellule aggiungendo 500 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Seguendo fissazione, Consiglio di cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare a 4 ° C per una notte, se necessario.
  3. permeabilizecellule aggiungendo 500 ml di PBS + 0,2% Triton-X100 e incubare 30 minuti a temperatura ambiente. Mediante aspirazione a vuoto, rimuovere il tampone permeabilizzazione e lavare tre volte con PBS.
  4. Blocco in 500 ml di 5% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS e incubare le cellule per 30 minuti a RT. Cellule possono essere conservate a 4 ° C per una notte, se necessario.
  5. Preparare la diluizione anticorpo primario. Pipettare 200 ml di 5% BSA / PBS per pozzetto in una conica 15 mL (12 pozzetti = 2,4 mL) e aggiungere 1 ml di anticorpo primario per ml di 5% BSA / PBS necessaria. Rimuovere tampone bloccante mediante aspirazione a vuoto e dispensare 200 microlitri di anticorpo primario diluito ad ogni pozzetto.
    1. Incubare le cellule in 1: 1.000 diluiti anticorpi primari in 5% BSA / PBS per 1 ora a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS.
  6. Preparare la diluizione anticorpo secondario nello stesso volume di 5% BSA / PBS come sopra. Aggiungere l'anticorpo secondario rosso lontano colorante-coniugato con una diluizione 1: 2.000. Inoltre aggiungi1 mg / mL di Hoechst colorante per il mix. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 ml di miscela per ogni pozzetto.
    1. Incubare a RT per 1 ora al buio. Lavare 3 volte con PBS, le cellule lasciare in PBS, e proteggere le cellule dalla luce con un foglio. Cellule possono essere conservate a 4 ° C, se necessario.
  7. celle di immagine a 400X ingrandimento totale con un microscopio a epifluorescenza invertita con lunghezza d'onda di eccitazione 594 - 650 nm.

6. Western Blotting

  1. Lavare le cellule da 3.6 due volte con PBS ghiacciato. In ghiaccio, le cellule Lisare con 50 ml di 1x RIPA buffer di integrate con 1x cocktail di inibitori delle proteasi.
  2. lisati Rock a 4 ° C per 15 min, raccolgono lisati in provette da 1,5 mL, e centrifugare ad alta velocità (20.000 xg) per 5 minuti per chiarire campioni. I lisati cellulari possono essere conservati a lungo termine a -80 ° C, se necessario.
  3. Quantificare proteina totale utilizzando un saggio Bradford e un'aliquota una pari quantità di proteina in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Brincampioni g a parità di volume, con tampone RIPA e tampone di caricamento 3x Laemmli integrato con 2-mercaptoetanolo.
  4. Incubare campioni in 1x Laemmli buffer di caricamento del campione per 5 min a 95 ° C ed eseguire SDS-PAGE usando un gel Tris-glicina 4-12% a 200 V per 45 minuti. La quantità di catene proteiche caricata a seconda della linea cellulare. In alcuni casi, è necessario 50-100 pg di proteina totale per rilevare E-caderina in cellule mesenchimali.
  5. proteine ​​di trasferimento su una membrana di nitrocellulosa per 2 ore a 50 V in tampone di trasferimento 1x Tris-glicina.
  6. Blocco membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C in tampone bloccante BSA-based.
  7. Diluire anticorpi primari a 1: 1.000 concentrazione in 5 mL di tampone bloccante, aggiungere diluizione alla membrana, e incubare con delicata dondolo per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. membrana lavata 3 volte in PBS con 0,05% Tween-20.
  8. Incubare membrane per 1 ora a temperatura ambiente con secondar fluorescente accoppiati infrarossiy anticorpo a 1: 20.000 diluizione nel tampone di bloccaggio come sopra.
  9. Lavare membrana due volte in PBS con 0,05% Tween-20 e poi una volta in PBS.
  10. Membrana Immagine utilizzando il rilevamento della fluorescenza a raggi infrarossi standard.

7. saggi crescita ancoraggio-indipendente

NOTA: Per una dettagliata morbido protocollo del test agar, vedere 28.

  1. Calda sterile supporti 2x DMEM al 42 ° C in bagno di acqua calda. Durante questo tempo, il calore pre-autoclave 1% agarosio nel microonde per 3 minuti. Microonde per altri 30 s per volta, se necessario o fino a quando completamente sciolto. Spostare agarosio ad un bagno d'acqua C 42 °.
  2. Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile e mescolare 1% agarosio e supporti 2x DMEM in un rapporto 1: 1 contabilità per 1,5 ml di miscuglio per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare in più DMEM / agarosio per tenere conto di errori di pipettamento e per evitare le bolle.
  3. Aggiungete il composto alpareti del pozzo, assicurando bolle si formano e lasciate riposare per 30 minuti a RT.
  4. Mentre lo strato inferiore è solidificazione, preparare ciascun gruppo di cellule trasfettate RD nel passaggio 3 aspirando media e lavare una volta con 1 ml di PBS. Aspirare PBS e aggiungere 0,2 ml di 0,05% tripsina e incubare a 37 ° C per 5 min.
  5. Neutralizzare tripsina in 0,8 mL di media e cellule Triturare per formare una cella singola sospensione. Trasferimento sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
  6. Contare le cellule e calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per 10.000 cellule per pozzetto.
  7. Riscaldare 0,6% agarosio nel microonde per 3 min, seguiti da 30 s alla volta fino completamente sciolto. Spostare agarosio a 42 ° C bagnomaria.
  8. Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile. Mescolare 0,6% agarosio e sospensione cellulare diluita in un rapporto 1: 1 per preparare 1,5 ml di miscela per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare sospensione cellulare extra / agarosio mix per tenere conto di errori pipettaggio eper evitare bolle.
    NOTA: E 'importante lavorare a 42 ° C qui. Se la temperatura è troppo bassa la miscela solidificare prima placcatura, e temperature superiori a 42 ° C influenzerà vitalità cellulare.
  9. Mescolare bene triturando cellule diverse volte e aggiungere miscela di cellule nei pozzetti, garantendo che non forma bolle e lasciate solidificare per 20 minuti a RT.
  10. Aggiungere 2 ml di media integrate ad ogni bene e passare piastre per incubatrice.
    1. Modificare i media una volta alla settimana per 3-4 settimane o fino a quando le colonie multicellulari formano. Fare attenzione a non toccare l'agar quando si rimuove media da parte aspirazione a vuoto. In alternativa, utilizzare un P1000 per rimuovere lo strato superiore di liquidi.
    2. Macchiare molli piastre di agar aggiungendo 200 ml di soluzione di cloruro Nitro Blu tetrazolo (1 mg / ml in PBS) e incubare la piastra per una notte a 37 ° C. Sostituire i media il giorno dopo con PBS per l'imaging.
    3. pozzi Immagine a 40X di ingrandimento totale di un microscopio invertito.
    4. Eseguire l'analisi su ImageJ per l'area della colonia e il numero. Trama numero medio colonia di repliche biologiche ± deviazione standard.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Schema per l'induzione MET in cellule di sarcoma

Una cronologia generale per l'induzione di modifiche MET simili in cellule di sarcoma è mostrato in Figura 1. Il protocollo inizia trasduzione GRHL2 (Figura 1A), seguita da trasfezione della famiglia miR-200 (Figura 1B). familiari GRHL2 o miR-200 non erano in grado di influenzare l'aspetto delle cellule RD quando espre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I sarcomi sono rari, ma altamente aggressivi tumori di un lignaggio mesenchimale. Nonostante la loro lignaggio mesenchimali, un sottogruppo di sarcomi sembra subire una transizione fenotipica ad un epiteliale stato simile più. Questo interruttore TEM-like ha rilevanza prognostica, come pazienti con più tumori epiteliali-simili sono meno aggressivi 24. Nonostante la loro rilevanza clinica, ci sono pochi studi che riguardano i meccanismi molecolari mappa queste transizioni fenotipiche in sarcomi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

JAS riconosce il sostegno del duca Cancer Institute, The Duke University genito-urinario Laboratorio di Oncologia, e il Dipartimento di Ortopedia dell'Università Duke. HL è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Centro di Fisica Teorica biologica (NSF PHY-1.427.654) e NSF DMS-1.361.411, e come un CPRIT (prevenzione del cancro e Research Institute del Texas) Scholar Ricerca sul Cancro dello Stato del Texas alla Rice University. KEW stato supportato dal NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiato utili discussioni con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

Riferimenti

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39(2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241(2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998(2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Shenghan Xu

to:

Shengnan Xu

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Developmental Biologytransizioni mesenchimali epitelialesarcomatrasfezionemicroRNA 200 famigliaGRHL2coltura cellulareplasticit epiteliale

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati