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Erratum Notice

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Resumen

Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.

Resumen

plasticidad fenotípica se refiere a un fenómeno en el que las células transitoriamente adquieren rasgos de otro linaje. Durante la progresión de carcinoma, la plasticidad fenotípica impulsa la invasión, la difusión y la metástasis. De hecho, mientras que la mayoría de los estudios de plasticidad fenotípica han sido en el contexto de los carcinomas epiteliales derivadas, resulta que los sarcomas, que son de origen mesenquimal, también exhiben plasticidad fenotípica, con un subconjunto de los sarcomas de someterse a un fenómeno que se asemeja a un mesenchymal- transición epitelial (MET). Aquí, hemos desarrollado un método que comprende la familia miR-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2) para imitar este fenómeno MET-como observados en paciente sarcoma samples.We expresan secuencialmente GRHL2 y la familia miR-200 usando la transducción de células y transfección, respectivamente , para entender mejor las bases moleculares de estas transiciones fenotípicas en células de sarcoma. células de sarcoma que expresan de miR-200 y GRHL2 demostraron mejorada, ambie epitelialics en la morfología celular y la alteración de epiteliales y mesenquimales biomarcadores. Futuros estudios utilizando estos métodos se pueden utilizar para comprender mejor las consecuencias fenotípicas de procesos MET-como en células de sarcoma, como la migración, invasión, la propensión metastásica, y resistencia a la terapia.

Introducción

plasticidad fenotípica se refiere a una transición reversible entre fenotipos celulares, y es comúnmente dividido en dos tipos, epitelial-a-mesenquimal (EMT) transiciones y transiciones-mesenquimal-a epitelial (MET). Esta plasticidad fenotípica juega un papel importante en los procesos normales de los organismos multicelulares, como el desarrollo y la cicatrización de la herida 1; sin embargo, estas mismas vías y programas de expresión génica también pueden conducir a la enfermedad, tales como fibrosis (revisado en 2, 3, 4) y metástasis de carcinoma (revisado en las referencias 5, 6, 7, 8). Durante la metástasis, por ejemplo, EMT interrumpe la polaridad celular, interacciones célula-célula, y promueve la invasión 9, 10. En conjunto, contribuyen EMTs de un estado fenotípico que facilitan la divulgación de las células cancerosas. Además, EMT también conduce a una serie de otras alteraciones fenotípicas que impulsan un fenotipo agresivo, incluyendo la desregulación del metabolismo de la célula de cáncer 6, el desarrollo de resistencia a los medicamentos 11, 12, mayor capacidad tumor-iniciación 13, 14 y el anfitrión de la evasión inmune 15.

plasticidad fenotípica se ha estudiado bien en la progresión del carcinoma; sin embargo, sarcomas también exhiben plasticidad fenotípica. Curiosamente, parece como si algunos de los mismos controladores de plasticidad fenotípica en los carcinomas también contribuyen a la plasticidad del sarcoma y agresividad. Por ejemplo, se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) de pacientes con sarcoma de expresar EpCAM, una proteína de superficie celular que se encuentra típicamente en las células epiteliales 16. Addicionalmente, 250 muestras de sarcoma de tejido blando se clasificaron como de tipo epitelial o mesenquimal-como basado en la expresión génica. Los pacientes de la firma biomarcador epitelial tuvieron un mejor pronóstico que los pacientes con la firma biomarcador mesenquimal 17. Esto es coherente con muchos carcinomas, en los que los pacientes con más carcinomas epiteliales-como tienen mejores resultados en comparación con los pacientes con más tumores mesenquimales-como 18.

Mientras que algunos sarcomas muestran biomarcadores y vías de expresión génica consistentes con MET, las bases moleculares de esta plasticidad fenotípica siguen siendo poco conocidos. Para estudiar los mecanismos y los conductores de MET en el sarcoma hemos desarrollado un modelo de inducción MET utilizando dos factores-epiteliales específica, el microRNA (MIR) -200 familia y Grainyhead-como 2 (GRHL2). El MIR-200 son una familia de pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica mediante la unión a los 3' UTRs de messenger ARN y la prevención de traducción en proteína. La familia miR-200 se compone de dos subgrupos - uno que contiene miR-141 y miR-200a, y el otro incluyendo miR-200b, miR-200c, y miR-429. Los miembros de la familia miR-200 se enriquecen en tejidos epiteliales, y la pérdida de miR-200 se asocia con metástasis en carcinomas 19. La familia miR-200 también es downregulated en sarcomas de tejidos blandos en comparación con el tejido normal 20. Al igual que en los miR-200, GRHL2 es un regulador clave que es importante para el desarrollo del epitelio 21. El factor de transcripción GRHL2 actúa de dos formas de regular por incremento genes epiteliales, tales como E-cadherina: 1) en las células epiteliales, GRHL2 directamente reprime el regulador maestro EMT, ZEB1 22; y 2) GRHL2 activa directamente la transcripción de genes epiteliales 23. Nuestras investigaciones anteriores han demostrado que la expresión combinada de miR-200 y GRHL2 en las células del sarcomainduce un fenotipo MET-como 24. A continuación, presentamos un protocolo detallado para crear un modelo in vitro de la inducción de MET en células de sarcoma usando la expresión ectópica de miR-200 y GRHL2.

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Protocolo

1. Preparación de los reactivos

  1. Preparar DMEM para el cultivo celular mediante la adición de 50 ml de suero fetal bovino (FBS) y 5 ml de penicilina-estreptomicina (5000 U / ml) a 500 ml de DMEM. Este medio se puede almacenar a 4 ° C durante hasta seis meses.
  2. Resuspender cebadores liofilizado en agua libre de nucleasa a una concentración final de 10? M. cebadores de las tiendas re-suspendieron a -20 ° C.
  3. Preparar tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, 0,1% SDS, Tris 50 mM, pH 8,0). Suplemento con cóctel inhibidor de proteasa antes de usar y mantener tampón en hielo cuando está en uso. Almacenar a 4 ° C.
  4. Preparar 10 mg / ml de polibreno (bromuro de hexadimetrina) en el filtro de agua y la jeringa para esterilizar utilizando un filtro de polietersulfona 0,45 m. Solution se puede almacenar a 4 ° C durante hasta seis meses.
  5. Preparar una solución de 1 mg / mL de trabajo de cloruro de tetrazolio azul nitro disolviendo 10 mg en 10 ml de PBS. Almacenar a 4 ° C.

2. Lentiviral Transducción de GRHL2

Día 1

  1. Placa 3 x 10 5 células HEK293T por pocillo de una placa de 6 pocillos en 2 ml de DMEM suplementado. Cuantificar las células utilizando un contador de células automatizado. Las células deben ser 40 - 60% confluentes después de cultivo durante la noche a 37 ° C con 5% de CO2.

Dia 2

  1. Diluir 2 g de vector vacío (pCMV-UBC-EGFP) o 2 g de pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 en 200 l de medio libre de suero junto con 1,8 g de pΔ8.9 y 0,2 g de pCMV-VSV plásmidos auxiliares -G. En un tubo separado, se diluye 4 l de un reactivo de transfección basado en lípidos en 200 l de medio libre de suero por transfección (8 l en 400! L para dos muestras). Añadir 200? L de mezcla de reactivo de transfección a cada solución de plásmido y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
  2. Durante el Incubadorasción, lavar las células HEK293T retirando el medio por aspiración al vacío y aclarado células con 1 ml de PBS. Sustituir el PBS con 800 l de medio libre de suero. Después de 20 min, añadir 200 l de reactivo de transfección: mezcla de plásmido de la etapa 2.2 gota a gota a cada pocillo e incubar las células durante 2 horas a 37 ° C en 5% de CO2.
  3. Retire cuidadosamente medio de transfección por aspiración al vacío y reemplazar con 2 ml de DMEM suplementado. Devolver las células a la incubadora para cultivo de una noche.
    NOTA: Las células HEK293T son poco adheridos. reemplazo de los medios de comunicación debe ser realizado con precaución para limitar la eliminación de las células de la parte inferior del plato o frasco.

Día 3

  1. Actualizar los medios de comunicación en las células HEK293T transfectadas y la placa 3 x 10 5 células RD por pocillo de una placa de 6 pocillos en 2 ml de DMEM suplementado. células de cultivo durante la noche. células RD son una línea celular de rabdomiosarcoma humano comercialmente disponible.

Día 4

  1. Recoger los medios de comunicación viral a partir de células HEK293T. Pipetear los medios DMEM de las células HEK293T y lugar en un nuevo 15 ml cónico. Vuelva a colocar cuidadosamente con los nuevos medios DMEM y las células HEK293T lugar atrás en la incubadora para el día siguiente.
  2. Añadir 2 l de 10 mg / ml de polibreno por ml de medios de comunicación virales en dos nuevos tubos cónicos de 50 ml (una para la transfección del vector vacío y otro para la transfección GRHL2). filtro de jeringa de medios de comunicación viral mediante la eliminación del émbolo de una jeringa de 3 ml y adjuntar un filtro de 0,45 micras polietersulfona a la punta.
    1. Añadir los medios de comunicación virales recogidos en el paso 2.6 en el barril de la jeringa, y hundir los medios de comunicación en los nuevos tubos cónicos de 50 ml que contenían polibreno. Retire el medio de las células RD por aspiración al vacío y añadir medios viral se filtró a células RD.

día 5

  1. Día 4. células HEK293T repetidas pueden ser desechados después de los medios de comunicación viral que se ha recogido.

día 7

  1. Lavar las células RD con 1 ml de PBS y añadir 200? l de tripsina al 0,05% por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 5 min, añadir 2 ml de medio suplementado, y mover suspensión celular a un nuevo 15 ml cónico. Centrifugar las células a 250 xg durante 5 min a temperatura ambiente y los medios de aspiración. Resuspender en 1 ml de DMEM (suplementado con 5% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina).
    NOTA: El uso de un mayor porcentaje de FBS puede causar la obstrucción durante la citometría de flujo
    1. células de filtro para citometría de flujo. Utilizar una pipeta para aplicar la suspensión de células ml RD 1 a través de un filtro de 30 micras en citometría de flujo tubos y Colocar los tubos en hielo.
    2. Ordenar EGFP + células 26 en 1,5 tubos de microcentrífuga ml que contenían 0,5 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y lugar en hielo. Plate EGFP + células en total de 1 ml de DMEM suplementado ordenadas en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos y el lugar en la incubadora para cultivo.
      ; NOTA: El rendimiento de las células eGFP + de citometría de flujo después de este transducción es por lo general bajas (50.000-100.000 células). Las células pueden necesitar ser cultivado durante 10 - 14 días antes de proceder al paso 3.

3. La transfección inversa de miR-200

  1. Preparar 50 M existencias de miR-200 imita utilizando libre de nucleasa H 2 poblaciones de O. alícuotas y almacenar a -20 ° C para evitar ciclos de congelación / descongelación repetidos.
  2. Añadir 3 l de cada 50? M miR-200 imitador (miR-200a, miR-200b, y miR-200c) a 300 l de medio libre de suero o 9 l de 50! M miARN de control negativo a medio libre de suero 300 mL.
  3. Añadir 6 l de reactivo de transfección-siRNA a 600 l de medio libre de suero y dividir 300! L de esta mezcla en dos tubos, uno para cada una de las dos mezclas de miR de la etapa 3.2. Combinar los 300! L de cada mezcla de miR de la etapa 3.2 con una mezcla de 300 l de reactivo de transfección. Incubar durante 20 min a te habitaciónmperatura.
  4. Mientras que la incubación, preparar una suspensión celular de 600.000 células EGFP + RD que expresan EV o GRHL2 creado en la Sección 2 en 2,4 ml (250 células / ml) de medio libre de suero por tratamiento.
  5. En una placa de 24 pocillos, añadir 100 l por pocillo de miR-200 de mezcla o mezcla de control negativo de la etapa 3.3 en seis pozos, y a continuación, añadir 400 l de cada suspensión de células en tres pocillos de cada mezcla de MIR.
  6. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche y cambiar los medios de comunicación a suplementado totalmente DMEM al día siguiente. Recoger las células 2 días más tarde para el análisis utilizando el tampón apropiado (véase más adelante). Time-lapse de las células del sarcoma RD sometidos a MET está disponible como material suplementario. Imagen cada pocillo cada 2 h con un objetivo de 10X utilizando un generador de imágenes en vivo de células automatizado 27.

extracción 4. ARN, la transcripción inversa, y qPCR

  1. Extraer ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un estándar de ARNkit de extracción 24. ARN extraído se puede almacenar a -80 ° C.
  2. Cuantificar la concentración de ARN. Descongelar y trabajar con ARN en hielo. Para cuantificar las concentraciones de ARN, medir la absorbancia UV a 260 nm con un espectrofotómetro lector de placas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Diluir todas las muestras a la concentración más baja con agua libre de nucleasa.
  3. Realizar la transcripción inversa del ARN total en ADN complementario (ADNc). Combinar no menos de 100 ng de ARN total con tampón de PCR, mezcla de dNTP (100 mM), cebadores hexámeros aleatorios, la transcriptasa inversa y agua libre de nucleasa en un volumen de reacción de 20! L 24. Ejecutar ciclos de RT de acuerdo con el protocolo del fabricante. cDNA se puede almacenar a largo plazo a -20 ° C.
  4. Diluir 20 reacciones mu l a 100 l con 80 l de nucleasa libre de H 2 O.
  5. Mezclar 5 l de un colorante intercalante basado en la fluorescencia 2x qPCR mezcla maestra, 0,06 l de cada cebador 10? M, unand 2 l de reacción RT diluida por muestra.
  6. Ejecutar qPCR de acuerdo con el protocolo del fabricante para la mezcla maestra basada en fluorescencia.
  7. Cuantificar cantidades relativas de mRNA por el método CT delta y normalizar a GAPDH. Trazar la expresión de ARNm de media de réplicas biológicas ± desviación estándar para cada grupo de tratamiento.
    NOTA: precauciones especiales deben tomarse cuando se trabaja con RNA para evitar el contacto con RNasas, tales como el uso de plásticos y reactivos libres de RNasa. equipo no desechable debe ser tratada antes de su uso para eliminar RNasas.

5. La tinción de inmunofluorescencia

  1. Después de la etapa 3.6, los medios de aspirado por la aspiración por vacío a partir de las células RD en el formato de 24 pocillos.
  2. Fijar las células mediante la adición de 500 l de paraformaldehído al 4% (PFA) por pocillo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Después de la fijación, las células de lugar en tampón fosfato salino (PBS) y se almacena a 4 ° C durante la noche si es necesario.
  3. permeabilizarcélulas mediante la adición de 500 l de PBS + 0,2% de Triton-X100 e incubar 30 min a TA. Por la aspiración al vacío, eliminar el tampón de permeabilización y lavar tres veces con PBS.
  4. Bloque en 500 l de 5% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS y se incuban las células durante 30 min a RT. Las células se pueden almacenar a 4 ° C durante la noche si es necesario.
  5. Prepare la dilución de anticuerpo primario. Pipetear 200 l de 5% de BSA / PBS por pocillo en una cónica 15 ml (12 pozos = 2,4 ml) y añadir 1 l de anticuerpo primario por ml de 5% BSA / PBS necesario. Eliminar el tampón de bloqueo por aspiración al vacío y dispensar 200 l de anticuerpo primario diluido a cada pocillo.
    1. Se incuban las células en 1: 1.000 diluidas anticuerpos primarios en 5% de BSA / PBS durante 1 h a RT o durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación, lavar las células dos veces con PBS.
  6. Preparar la dilución de anticuerpo secundario en el mismo volumen de 5% BSA / PBS como anteriormente. Añadir el anticuerpo secundario conjugado con colorante rojo lejano usando una dilución 1: 2000. Además añadir1 mg / ml de Hoechst colorante a la mezcla. Retire el PBS y añadir 200? L de la mezcla a cada pocillo.
    1. Incubar a TA durante 1 h en la oscuridad. Lavar 3 veces con PBS, dejar las células en PBS, y proteger las células de la luz usando papel de aluminio. Las células se pueden almacenar a 4 ° C si es necesario.
  7. células de imagen a la ampliación total de 400X en un microscopio de epifluorescencia invertido con longitud de onda de excitación de 594 a 650 nm.

6. Transferencia Western

  1. Lavar las células de 3,6 dos veces con PBS enfriado en hielo. En hielo, las células se lisan con 50 l de 1x tampón RIPA suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa.
  2. lisados ​​de roca en 4 ° C durante 15 min, recogen los lisados ​​en tubos de 1,5 ml, y se centrífuga a alta velocidad (20.000 xg) durante 5 min para aclarar las muestras. Los lisados ​​celulares se pueden almacenar a largo plazo a -80 ° C si es necesario.
  3. Cuantificar la proteína total usando un ensayo de Bradford y alícuota una cantidad igual de proteína en nuevos 1,5 tubos de microcentrífuga ml. Bring de muestras a igual volumen usando tampón RIPA y tampón de carga 3x Laemmli suplementado con 2-mercaptoetanol.
  4. Incubar las muestras en tampón de carga de muestra 1x Laemmli durante 5 min a 95 ° C y ejecutar SDS-PAGE usando un 4-12% de gel de Tris-glicina a 200 V durante 45 min. La cantidad de rangos cargadas de proteína, dependiendo de la línea celular. En algunos casos, se necesita 50-100 g de proteína total para detectar E-cadherina en líneas de células mesenquimales.
  5. proteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa durante 2 horas a 50 V en tampón de transferencia 1x Tris-glicina.
  6. membrana Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en un tampón de bloqueo a base de BSA.
  7. Diluir los anticuerpos primarios a 1: 1000 de concentración en 5 ml de tampón de bloqueo, añadir la dilución a la membrana, y se incuba con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. membrana Lavar 3 veces en PBS con 0,05% de Tween-20.
  8. Incubar las membranas durante 1 h a TA con secondar fluorescente acoplado infrarrojosy anticuerpo a 1: 20.000 de dilución en tampón de bloqueo como anteriormente.
  9. Lavar la membrana dos veces en PBS con 0,05% de Tween-20 y, a continuación una vez en PBS.
  10. membrana de imágenes con detección de fluorescencia de infrarrojos estándar.

7. Ensayos de crecimiento independiente de anclaje

NOTA: Para un protocolo de ensayo de agar blando detallada, consulte 28.

  1. Warm medios 2x DMEM estéril a 42 ° C en baño de agua caliente. Durante este tiempo, el calor pre-autoclave 1% de agarosa en el microondas durante 3 min. Microondas durante 30 s en un momento en que sea necesario o hasta que esté completamente derretido. Mueva de agarosa para un baño de agua C 42 °.
  2. Colocar un tubo cónico de 50 ml en un vaso de precipitados con 42 ° C de agua en una campana estéril y mezclar 1% de agarosa y los medios 2x DMEM en una relación 1: 1 de contabilidad para 1,5 ml de mezcla por pocillo en una placa de 6 pocillos. Siempre prepare adicional DMEM / agarosa para dar cuenta de error de pipeteado y para evitar burbujas.
  3. Añadir a la mezcla deparedes del pozo, asegurando que no se formen burbujas y dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Mientras que la capa inferior está solidificando, preparar cada grupo de células RD transfectadas en el paso 3 mediante la aspiración de los medios y lavar una vez con 1 ml de PBS. Aspirar PBS y añadir 0,2 ml de tripsina al 0,05% y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
  5. Neutralizar la tripsina en 0,8 ml de medio y células de triturado para formar una suspensión de una sola célula. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
  6. Contar las células y calcular el volumen de la suspensión celular requerida para 10.000 células por pocillo.
  7. Calentar 0,6% de agarosa en el microondas durante 3 min, seguido de 30 s en un momento hasta que esté completamente fundido. Mueva de agarosa a 42 ° C baño de agua.
  8. Colocar un tubo cónico de 50 ml en un vaso de precipitados con 42 ° C de agua en una campana estéril. Mezclar 0,6% de agarosa y la suspensión celular diluida en una proporción de 1: 1 para preparar 1,5 ml de mezcla por pocillo en una placa de 6 pocillos. Siempre prepare suspensión celular extra / agarosa mezclar para dar cuenta de error de pipeteado ypara evitar burbujas.
    NOTA: Es importante trabajar a 42ºC aquí. Si la temperatura es demasiado baja, la mezcla se solidifique antes de chapado, y temperaturas superiores a 42 ° C afectará a la viabilidad celular.
  9. Mezclar bien por trituración células varias veces y añadir mezcla de células a los pocillos, asegurándose de no formar burbujas, y dejar solidificar durante 20 min a TA.
  10. Añadir 2 ml de medio suplementado a cada pocillo y mover las placas a la incubadora.
    1. Cambiar los medios de comunicación una vez por semana durante 3-4 semanas o hasta que las colonias multicelulares forman. Tenga cuidado de no tocar el agar al retirar los medios por aspiración al vacío. Alternativamente, utilizar un P1000 para eliminar la capa superior de medios líquidos.
    2. Teñir placas de agar suave mediante la adición de solución de cloruro de 200 l de Nitro azul tetrazolio (1 mg / ml en PBS) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Reemplazar los medios de comunicación al día siguiente con PBS para la imagen.
    3. pozos de imagen a 40X aumento total en un microscopio invertido.
    4. Realizar análisis de ImageJ para el área de la colonia y el número. Parcela número medio de colonias de réplicas biológicas ± desviación estándar.

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Resultados

Esquema para la inducción de MET en células de sarcoma

Una línea de tiempo general para la inducción de cambios MET-como en células de sarcoma se muestra en la Figura 1. El protocolo comienza por transducción de GRHL2 (Figura 1A), seguido de transfección de la familia miR-200 (Figura 1B). miembros de la familia GRHL2 o miR-200 no fueron capaces de afectar la apariencia de ...

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Discusión

Los sarcomas son cánceres raros, pero altamente agresivas de un linaje mesenquimal. A pesar de su linaje mesenquimal, un subconjunto de sarcomas parece experimentar una transición fenotípica a un estado más epitelial-similares. Este interruptor MET-como tiene relevancia pronóstica, ya que los pacientes con más tumores epiteliales como son menos agresivos 24. A pesar de su importancia clínica, hay pocos estudios sobre los mecanismos moleculares de conducción estas transiciones fenotípicas...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

JAS reconoce el apoyo del Instituto del Cáncer de Duke, El Laboratorio de Oncología genitourinario Universidad de Duke, y el Departamento de Ortopedia de la Universidad de Duke. HL fue apoyada por la National Science Foundation (NSF) Centro de Física Biológica Teórica (NSF PHY-1427654) y NSF DMS-1361411, y como CPRIT Académico (Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas) en la Investigación del Cáncer del Estado de Texas en la Universidad Rice. KEW fue apoyado por el NIH F32 CA192630 MKJ y HL benefició de discusiones útiles con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, y Donald S. Coffey.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

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Shenghan Xu

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