JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Мы представляем здесь способ культивирования клеток для индукции мезенхимальных-эпителиальные переходы (MET) в клетках саркомы на основе комбинированного эктопической экспрессии микроРНК-200 членов семьи и grainyhead-типа 2 (GRHL2). Этот метод подходит для лучшего понимания биологического воздействия фенотипической пластичности на агрессивности рака и лечении.

Аннотация

Фенотипическая пластичность относится к явлению, в котором клетка транзиторна получить черты другого рода. Во время прогрессирования рака, фенотипическая пластичность дисков вторжения, распространение и метастазирование. В самом деле, в то время как большинство исследований фенотипической пластичности было в контексте эпителиальных полученных карцином, оказывается, саркомы, которые являются мезенхимальными по происхождению, также демонстрируют фенотипическую пластичность, с подмножеством сарком переживают феномен, который напоминает mesenchymal- эпителиальный переход (МЕТЫ). Здесь, мы разработали способ, включающий семейство микроРНК-200 и grainyhead-типа 2 (GRHL2), чтобы имитировать этот MET-подобный феномен, наблюдаемый в саркому пациента samples.We последовательно выразить GRHL2 и семейство микроРНК-200 клеток с помощью трансдукции и трансфекции, соответственно, , чтобы лучше понять молекулярные основы этих фенотипических переходов в клетках саркомы. Саркома клетки, экспрессирующие MIR-200s и GRHL2 продемонстрировал повышенную эпителиальной characteristИКС в морфологии клеток и изменения эпителиальных и мезенхимальных биомаркеров. Дальнейшие исследования с использованием этих методов могут быть использовано, чтобы лучше понять последствия фенотипических из МЕТ-подобных процессов на клетки саркомы, такие как миграция, инвазия, метастатическая склонность и устойчивость к терапии.

Введение

Фенотипическая пластичность относится к обратимому переходу между клеточными фенотипами, и обычно делится на два типа, эпителиально-к-мезенхимальный (ЕМТ) переходы и мезенхимальных-к-эпителиальные переходы (Met). Это фенотипическая пластичность играет важную роль в нормальных процессах многоклеточных организмов, такие как развитие и заживление ран 1; Однако, эти же пути и программа экспрессии генов также могут привести к болезни, такие как фиброз (обзор в 2, 3, 4) и карциноме метастазы (обзор в ссылках 5, 6, 7, 8). Во время метастазирования, например, ЕМТ нарушает полярность клеток, межклеточные взаимодействия, а также способствует инвазии 9, 10. Вместе EMT вкладs в фенотипическое состояние, что способствует распространению раковых клеток. Кроме того, ЕМТ также приводит к целому ряду других фенотипических изменений , которые ведут агрессивный фенотип, в то числе дерегуляции раковых клеток метаболизма 6, развития лекарственной устойчивости 11, 12, увеличенная способностью опухоли инициации 13, 14 и принимающей иммунное уклонение от 15.

Фенотипическая пластичность хорошо изучена в прогрессировании рака; Однако, саркомы также демонстрируют фенотипическую пластичность. Интересно, что кажется, как будто некоторые из тех же водителей фенотипической пластичности в карциномах также способствуют саркомам пластичности и агрессивности. Так , например, циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) у пациентов с саркомой , как были показаны , чтобы выразить EpCAM, белок клеточной поверхности , которые , как правило , найденные на эпителиальные клетках 16. Аддиционно, 250 мягких тканей саркома образцы были классифицированы как эпителиальные-типа или мезенхимальные-как на основе экспрессии генов. Пациенты в эпителиального типа биомаркеров подписи имели лучший прогноз , чем у пациентов с мезенхимальной типа биомаркеров подписи 17. Это согласуется со многими карцином, в которых пациенты с более эпителиальных карцином , как имеют лучшие результаты по сравнению с пациентами с более мезенхимальных подобных опухолей 18.

В то время как некоторые саркомы отображения биомаркеров и экспрессии генов пути в соответствии с MET, молекулярные подкрепления этой фенотипической пластичности остаются мало изучены. Изучить механизмы и движущие MET саркомы мы разработали модель MET индукции с использованием двух факторов эпителиальных конкретным, микроРНК (микроРНК) -200 семьи и grainyhead типа 2 (GRHL2). В MIR-200s представляют собой семейство небольших некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов путем связывания с 3'-UTRs в MESSENгер РНК и предотвращения перевода в белок. МикроРНК-200 семейство состоит из двух подгрупп - один, содержащий MIR-141 и MIR-200a, а другой в том числе MIR-200b, MIR-200c, и MIR-429. Члены семейства микроРНК-200 обогащены эпителиальных тканей, а потеря MIR-200s связан с метастазами в карцином 19. Семейство микроРНК-200 также подавляется в сарком мягких тканей по сравнению с нормальной тканью 20. Подобно MIR-200s, GRHL2 является ключевым регулятором , который имеет важное значение для развития эпителиальных 21. Фактор транскрипции GRHL2 действует в двух способах активируют эпителиальные гены, такие как E-кадгерин: 1) В эпителиальных клетках, GRHL2 непосредственно репрессирует главный регулятор ЕМТА, ZEB1 22; и 2) GRHL2 непосредственно активирует транскрипцию генов эпителиальных 23. Наши предыдущие исследования показали, что комбинированное выражение MIR-200s и GRHL2 в клетках саркомыиндуцирует МЕТ-подобный фенотип 24. Здесь мы представляем подробный протокол для создания модели ин витро MET индукции в клетках саркомы с помощью эктопической экспрессии микроРНК-200s и GRHL2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление реагентов

  1. Подготовка DMEM для культивирования клеток путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мл пенициллина-стрептомицина (5000 ед / мл) до 500 мл DMEM. Эта среда может храниться при температуре 4 ° С в течение до шести месяцев.
  2. Ресуспендируют лиофилизированные праймеры в нуклеазах без воды до конечной концентрации 10 мкМ. Хранить ресуспендировали праймеры при -20 ° С.
  3. Подготовьте радиоиммунопреципитации анализа (Ripa) буфера (150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолат натри, 0,1% SDS, 50 мМ Трис, рН 8,0). Дополнение с ингибитором протеаз перед использованием и сохранить буфер на льду при использовании. Хранить при 4 ° С.
  4. Подготовьте 10 мг / мл полибрена (полибрен) в воде и шприцевой фильтр для стерилизации с использованием полиэфирсульфона фильтр 0,45 мкм. Решение может храниться при температуре 4 ° С в течение шести месяцев.
  5. Подготовьте 1 мг / мл рабочего раствора нитро-синего тетразолия хлорида путем растворения 10 мг в 10 мл PBS. Хранить при 4 ° С.

2. Lentiviral трансдукция GRHL2

1 день

  1. Пластина 3 х 10 5 HEK293T клеток на лунку 6-луночного планшета в 2 мл DMEM , дополненной. Количественно клетки с использованием автоматического счетчика клеток. Клетки должны быть в пределах 40 - 60% сплошности , после культивирования в течение ночи при 37 ° С с 5% CO 2.

День 2

  1. Развести 2 мкг пустого вектора (PCMV-UBC-EGFP) или 2 мкг PCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 в 200 мкл сыворотки среды наряду с 1,8 мкг pΔ8.9 и 0,2 мкг PCMV-VSV -G хелперы плазмид. В отдельную пробирку, разбавляют 4 мкл липидной основе трансфекции реагента в 200 мкл сыворотки среды на трансфекцию (8 мкл в 400 мкл для двух образцов). Добавьте 200 мкл смеси реагентов трансфекции для каждой плазмиды раствора и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
  2. Во время Инкубаторыции, мыть HEK293T клетки путем удаления среды с помощью вакуумной аспирации и промывки клеток с 1 мл PBS. Заменить PBS с 800 мкл не содержащей сыворотки среде. Через 20 мин добавл ют 200 мкл реагента для трансфекции: плазмидной смесь со стадии 2.2 по каплям в каждую лунку и инкубируют клетки в течение 2 ч при 37 ° С в 5% CO 2.
  3. Осторожно снимите трансфекции среды с помощью вакуумной аспирации и заменить 2 мл DMEM, дополненные. Вернуть клетки в инкубатор для ночной культуры.
    Примечание: HEK293T клетка свободно присоединенная. Замена СМИ должна выполняться с осторожностью, чтобы ограничить удаление клеток из нижней части блюда или колбы.

День 3

  1. Обновить носитель на трансфицированных клетках HEK293T и пластины 3 × 10 5 RD клеток на лунку 6-луночного планшета в 2 мл DMEM , дополненной. Культуры клеток в течение ночи. RD клетки представляют собой коммерчески доступная человеческая линию клеток рабдомиосаркомы.

День 4

  1. Собрать вирусный носитель из HEK293T клеток. Пипетировать носитель DMEM из HEK293T клеток и места в новые 15 мл конических. Тщательно заменить новое DMEM СМИ и место HEK293T клеток обратно в инкубаторе на следующий день.
  2. Добавьте 2 мкл 10 мг / мл полибрена на мл вирусных сред на две новые 50 мл конические пробирки (по одному на пустой вектор трансфекции, а другой для трансфекции GRHL2). Шприц фильтр вирусного носителя путем удаления плунжера из 3 мл шприца и прикрепить 0,45 мкм фильтра полиэфирсульфона к кончику.
    1. Добавьте вирусные носители, собранные на этапе 2.6 в цилиндр шприца, и погрузить носитель в новые 50 мл конических пробирок, содержащих полибрены. Удалить материал из RD клеток с помощью вакуумной аспирации и добавить отфильтрованный вирусный носитель для RD клеток.

День 5

  1. Повторные День 4. HEK293T клетки могут быть отброшены после того, как вирусные средства массовой информации была собрана.

День 7

  1. Промывочный RD клеток с 1 мл PBS и добавляют 200 мкл 0,05% трипсина на каждую лунку. Инкубирую при 37 ° С в течение 5 мин, добавляют 2 мл дополненных средств массовой информации, и переместить суспензии клеток в новых 15 мл конических. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата средств массовой информации. Ресуспендируют в 1 мл DMEM (с добавлением 5% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина).
    Примечание: Используя более высокий процент FBS может вызвать засорение в процессе проточной цитометрии
    1. Фильтрующие элементы для проточной цитометрии. С помощью пипетки применять 1 мл суспензии клеток RD через фильтр 30 мкм в проточной цитометрии трубок и трубок место на льду.
    2. Сортировка EGFP + клетки 26 в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках , содержащих 0,5 мл среды DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина и место на льду. Пластина EGFP + клетки сортируются в общей сложности 1 мл дополненной DMEM в одну лунку 12-луночного планшета и место в инкубаторе для культуры.
      ; Примечание: Выход EGFP + клетки из проточной цитометрии после этой трансдукции, как правило, низкие (50000-100000 клеток). Клетки возможно, должны быть культивировали в течение 10 - 14 дней, прежде чем перейти к шагу 3.

3. Обратный Трансфекция MIR-200s

  1. Готовят 50 мкМ запасов микроРНКа-200 имитаторов с использованием нуклеазы без H 2 O. Аликвотных запасов и хранят при -20 ° C , чтобы избежать повторных циклов замораживания / оттаивания.
  2. Добавьте 3 мкл каждого 50 мкМ микроРНК-200 мимической (MIR-200а, MIR-200b, и MIR-200с) к 300 мкл сыворотки среды или 9 мкл 50 мкМ миРНК отрицательный контроль до 300 мкл сыворотки среды.
  3. Добавить 6 мкл миРНК конкретного реагента для трансфекции до 600 мкл сыворотки среды и разделить 300 мкл этой смеси на две трубки, по одному для каждой из двух смесей MIR из шага 3.2. Смешайте 300 мкл каждой смеси микроРНК со стадии 3.2 со смесью 300 мкл реагента для трансфекции. Инкубируют в течение 20 мин при комнатной Temperature.
  4. В то время инкубации, подготовить клеточную суспензию 600000 клеток EGFP + RD, экспрессирующих EV или GRHL2 созданную в разделе 2 в 2,4 мл (250 клеток / мкл) сыворотки среды на обработку.
  5. В 24-луночный планшет, добавьте 100 мкл на лунку микроРНК-200 или смеси отрицательного контроля смеси со стадии 3.3, в шесть лунок, а затем добавить 400 мкл каждой клеточной суспензии на три лунки каждой смеси микроРНК.
  6. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO 2 в течение ночи и изменить носитель полностью дополнен DMEM на следующий день. Сбор клеток через 2 дня для анализа с использованием соответствующего буфера (см. Ниже) Время покадровой визуализации клеток саркомы RD, проходящих MET доступен в качестве дополнительного материала. Изображение в каждую лунку , каждые 2 ч с целью 10X с использованием автоматизированного формирования изображения живых клеток 27.

4. экстракции РНК, обратной транскрипции, и КПЦР

  1. Извлечение РНК в соответствии с инструкциями производителя, используя стандартную РНККомплект для слива 24. Извлеченный РНК можно хранить при -80 ° С.
  2. Количественная концентрации РНК. Оттепель и работать с РНК на льду. Для количественной оценки концентрации РНК, измерения УФ-поглощению при 260 нм с помощью планшет-ридер спектрофотометра в соответствии с протоколом производителя. Развести все образцы к самой низкой концентрации с нуклеазы без воды.
  3. Выполнение обратной транскрипции суммарной РНК в комплементарной ДНК (кДНК). Смешайте не менее чем 100 нг тотальной РНК с ПЦР буфера, дНТФ смеси (100 мМ), случайных праймеров гексамере, обратной транскриптазы и нуклеазы без воды в объеме 24 мкл реакционной 20. Запуск циклов RT в соответствии с протоколом изготовления. кДНК можно хранить долгосрочные при -20 ° С.
  4. Развести 20 мкл реакции на 100 мкл с 80 мкл нуклеазы без H 2 O.
  5. Смешайте 5 мкл флуоресценции на основе красителя Интеркалирующий 2x КПЦР мастер смеси, 0,06 мкл каждого 10 мкМ праймера, A2-й мкл разбавленного реакции RT в образце.
  6. Выполнить КПЦР в соответствии с протоколом производителя для флуоресценции на основе мастер-микс.
  7. Количественно относительных количеств мРНК дельта-метода КТ и нормализовать к GAPDH. Участок среднего экспрессии мРНК биологических повторностей ± стандартное отклонение для каждой группы обработки.
    Примечание: Особые меры предосторожности следует соблюдать осторожность при работе с РНК, чтобы избежать контакта с РНКазами, например, с использованием РНКазы свободной пластики и реагентов. Номера одноразовое оборудование должно быть обработано перед использованием, чтобы удалить РНКазы.

5. иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. После этапа 3.6, аспирация средств массовой информации путем вакуумной аспирации из клеток RD в формате 24-луночного.
  2. Закрепить клетки путем добавления 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) на лунку и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). После фиксации, место клеток в фосфатно-солевом буфере (PBS) и хранят при температуре 4 ° С в течение ночи, если это необходимо.
  3. проницаемымиклетки путем добавления 500 мкл PBS + 0,2% Triton-X100 и инкубировать 30 мин при комнатной температуре. По вакуумной аспирации, удалить пермеабилизации буфер и промыть три раза PBS.
  4. Блок в 500 мкл 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) / PBS и инкубируют клетки в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки можно хранить при температуре 4 ° С в течение ночи, если это необходимо.
  5. Готовят разбавления первичного антитела. Пипетка 200 мкл 5% BSA / PBS в каждую лунку в 15 мл конические (12 лунок = 2,4 мл) и добавляют 1 мкл первичного антитела на мл 5% BSA / PBS, необходимо. Удалить блокирующий буфер с помощью вакуумной аспирации и дозирования 200 мкл разбавленного первичного антитела в каждую лунку.
    1. Инкубируйте клетки в соотношении 1: 1000, разбавленные первичных антител в 5% BSA / PBS в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. После инкубации, мыть клетки два раза PBS.
  6. Подготовка вторичного разведения антител в том же объеме 5% BSA / PBS, как описано выше. Добавьте далеко красный краситель-конъюгированные вторичные антитела с использованием 1: 2000 разбавление. Кроме того, добавить1 мкг / мл Hoechst красителя к смеси. Удалить PBS и добавьте 200 мкл смеси в каждую лунку.
    1. Инкубирую при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Промыть 3 раза PBS, оставить клетки в PBS, и защищают клетки от света, используя фольгу. Клетки можно хранить при температуре 4 ° С, если это необходимо.
  7. Клетки изображения на 400X общее увеличение на перевернутой эпифлуоресцентной микроскопа с длиной волны возбуждения 594 - 650 нм.

6. Вестерн блот

  1. Промыть клетки от 3,6 раза охлажденным льдом PBS. На льду, лизируют клетки с 50 мкл 1x RIPA буфера с добавлением 1x ингибиторов протеаз.
  2. Рок лизаты при 4 ° С в течение 15 мин, собирают лизаты во 1,5 мл пробирки и центрифуге при высокой скорости (20000 Xg) в течение 5 мин, чтобы уточнить образцы. Клеточные лизаты могут быть сохранены в долгосрочной перспективе при -80 ° С в случае необходимости.
  3. Количественно общий белок с использованием анализа Брэдфорда и аликвота равного количества белка в новые 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Бринг образцов в равном объеме с использованием RIPA буфера и 3x Laemmli загрузки буфера с добавлением 2-меркаптоэтанола.
  4. Инкубируйте образцы в 1x Лэммли загрузки образца буфера в течение 5 мин при температуре 95 ° C и запустить SDS-PAGE с использованием 4-12% Трис-глицин гель с при 200 V в течение 45 мин. Количество белка загружены диапазоны в зависимости от клеточной линии. В некоторых случаях, 50-100 мкг общего белка необходимы для обнаружения E-кадгерина в мезенхимальных клеточных линиях.
  5. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 ч при 50 V в 1x Трис-глицин буфере передачи.
  6. Блок мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С в блокирующем буфере БСА основе.
  7. Развести первичные антитела 1: 1000 концентрации в 5 мл блокирующего буфера, добавляет разбавление к мембране, и инкубировать с нежной качалкой в ​​течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Промывочные мембраны 3 раза в PBS с 0,05% Tween-20.
  8. Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре с инфракрасным флуоресцентной связью secondarу антитела 1: 20000 разбавления в блокирующем буфере, как описано выше.
  9. Промыть мембранные два раза в PBS с 0,05% Tween-20, а затем один раз в PBS.
  10. Изображение мембрана с использованием стандартной ИК-обнаружения флуоресценции.

7. Анализы роста Анкерного-независимой

Примечание: Для детального мягкого агара протокола анализа, см 28.

  1. Теплый стерильная 2x DMEM, носитель до 42 ° С в ванне с горячей водой. В течение этого времени, тепло предварительно выдерживают в автоклаве 1% агарозы в микроволновой печи в течение 3 мин. Микроволновая печь дополнительно в течение 30 с в то время, по мере необходимости, или до тех пор, пока полностью расплавленным. Перемещение агарозном до С водяной бане при 42 °.
  2. Поместите 50 мл коническую трубку в химическом стакане с 42 ° C водой в стерильных капот и смешать 1% агарозы и 2x DMEM носитель в соотношении 1: 1 соотношение учета по 1,5 мл смеси на лунку в 6-луночный планшет. Всегда готовьте дополнительные DMEM / агарозы, чтобы учесть ошибки пипетирования и избежать пузырей.
  3. Добавить смесь встороны хорошо, что гарантирует отсутствие пузырьков формы и дайте отстояться в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. В то время как нижний слой твердеть, готовит каждую группу RD клеток, трансфецированные на шаге 3 аспирации средства массовой информации и промываниях один раз 1 мл PBS. Аспирируйте PBS и добавляют 0,2 мл 0,05% трипсина и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
  5. Нейтрализовать трипсина в 0,8 мл среды и растирают клеток с образованием одной клеточной суспензии. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
  6. Граф клеток и рассчитать объем клеточной суспензии, необходимую для 10000 клеток на лунку.
  7. Тепло 0,6% агарозы в микроволновой печи в течение 3 мин, затем 30 секунд в то время, пока полностью не растает. Перемещение агарозном до 42 ° С на водяной бане.
  8. Поместите 50 мл коническую трубку в химическом стакане с 42 ° C воды в стерильной крышкой. Смешайте 0,6% агарозы и разбавленную суспензию клеток в соотношении 1: 1, чтобы подготовить 1,5 мл смеси на лунку в 6-луночный планшет. Всегда готовьте дополнительные суспензии клеток / агарозном перемешайте, чтобы учесть ошибки пипетирования ичтобы избежать пузырей.
    Примечание: Важно, чтобы работать при температуре 42 ° C здесь. Если температура слишком низка смесь затвердевает прежде, чем обшивкой, а температура выше 42 ° C будет влиять на жизнеспособность клеток.
  9. Хорошо перемешать растирание клеток несколько раз и добавьте смесь клеток в лунки, не обеспечивает никакой формы пузыри, и пусть затвердеваем в течение 20 мин при комнатной температуре.
  10. Добавляют 2 мл дополненных СМИ в каждую лунке и перемещать пластины инкубатора.
    1. Изменение средств массовой информации раз в неделю в течение 3-4 недель или до многоклеточные колонии образуют. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться агаром при удалении средств массовой информации с помощью вакуумной аспирации. В качестве альтернативы, использовать P1000, чтобы удалить верхний слой жидких сред.
    2. Пятно мягкого агара добавления 200 мкл раствора хлорида в нитро- тетразолии (1 мг / мл в PBS) и инкубируют планшет в течение ночи при 37 ° С. Заменить СМИ на следующий день с PBS для работы с изображениями.
    3. Изображение скважин на 40Х общее увеличение на инвертированный микроскоп.
    4. Провести анализ на ImageJ для зоны колонии и числа. Участок среднего числа колоний биологических повторностей ± стандартное отклонение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схема для MET индукции в клетках саркомы

Общий график для индукции МЕТ-подобных изменений в клетках саркомы показан на рисунке 1. Протокол начинается трансдукции GRHL2 (Фигура 1А), а затем путем трансфекции семейства микро?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Саркомы являются редкими, но очень агрессивные раковые мезенхимной линии. Несмотря на их мезенхимальное происхождение, подмножество сарком, как представляется, пройти фенотипический переход к более эпителиальным подобным состояниям. Это МЕТ-подобный переключатель имеет прогностиче...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

JAS признает поддержку со стороны Института Дьюка рака, мочеполовой онкологической лаборатории Duke University и Университета Дьюка отдела ортопедии. HL была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Центр теоретической биологической физики (НФС PHY-1427654) и NSF DMS-1361411, а также в качестве CPRIT (Профилактика рака и Научно-исследовательский институт Техас) Scholar в Cancer Research штата Техас в университете Райса. KEW была поддержана NIH F32 CA192630 MKJ и HL выгоду от полезных дискуссий с Мэри C Фарак-Carson, JN Onuchic Самир M Ханаш, Кеннет J Пиента и Дональд S Коффи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

Ссылки

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39(2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241(2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998(2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Shenghan Xu

to:

Shengnan Xu

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122200GRHL2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены