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요약

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

초록

표현형 소성은 세포가 일시적으로 다른 혈통의 특성을 얻을하는 현상을 말한다. 암 진행하는 동안, 표현형의 가소성은 침공, 보급 및 전이를 구동한다. 표현형 가소성 연구의 대부분은 상피 유래 암의 맥락에서되었지만 실제로, 그것은 mesenchymal- 유사한 현상을 겪고 육종의 부분 집합으로, 또한 표현형의 가소성을 전시, 기원 중간 엽 있습니다 육종을 밝혀 상피 성 전이 (MET). 여기서는 각각 순차적 GRHL2 및 미르 200 패밀리는 세포 형질 도입 및 형질 전환을 이용하여 표현 육종 환자 samples.We 관찰이 메티오닌과 같은 현상을 모방 미르-200 가족 grainyhead 같은 2 (GRHL2)를 포함하는 방법을 개발 더 나은 육종 세포에서 이러한 형질 전환의 분자 토대를 이해합니다. 미르 200S 및 GRHL2 표현 육종 세포는 상피 향상된 characterist 입증세포 형태와 상피와 중간 엽 바이오 마커의 변화에 ​​ICS. 이러한 방법을 사용하여 앞으로의 연구는 더 나은 등의 이동, 침윤, 전이 성향 및 치료 저항 등의 육종 세포에 대한 MET-같은 프로세스의 표현형의 결과를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

표현형 가소성 세포 표현형 사이의 가역적 인 변화를 의미하고, 일반적으로 두 가지 유형, 상피 간 간엽 (EMT) 전환 및 중간 엽 간 상피 천이 (MET)로 분할된다. 이 표현형의 가소성은 개발 및 상처 치유 1과 다세포 생물의 정상적인 과정에서 중요한 역할을한다; 그러나,이 같은 경로 유전자 발현 프로그램 또한 섬유증, 질병을 초래할 수있다 (검토를 2, 3, 4), 암 전이 (참고 문헌 5, 6, 7의 평가 8). 전이 동안, 예를 들어, EMT 세포 극성, 세포 - 세포 상호 작용을 방해하고, 침략 9, 10 추진하고 있습니다. 함께, EMT 기여암 세포의 보급을 촉진하는 표현형 상태로의. 또한 EMT는 암 세포 대사 (6)의 규제 완화 약물 저항 (11), (12)의 개발을 포함 공격적인 표현형을 유도 다른 표현형 변화, 증가 된 종양 개시 능력 (13), (14)와 면역 회피 15 호스트의 호스트로 이끈다.

표현형 소성 잘 암의 진행에서 연구되고있다; 그러나, 육종은 표현형의 가소성을 나타낸다. 암의 표현형 가소성 같은 드라이버 중 일부는 또한 육종 소성 및 공격성에 기여하는 것처럼 흥미롭게도,이 나타납니다. 예를 들어, 육종 환자의 순환 성 종양 세포 (CTCS은)는 EpCAM, 일반적으로 상피 세포 (16)에서 발견되는 세포 표면 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. ADDI전통적으로, 250 개 연조직 육종 샘플 상피 형상 또는 간엽 같은 유전자 발현에 기초로 분류 하였다. 상피와 같은 바이오 마커의 서명이있는 환자는 중간 엽 같은 바이오 마커의 서명 (17)을 가진 환자보다 더 나은 예후를했다. 이것은 더 상피와 같은 암 환자보다 중간 엽 같은 종양 18 환자에 비해 더 나은 결과를 보유하고있는 많은 암과 일치한다.

일부 육종이 생체와 MET와 일치 유전자 발현 경로를 표시하지만,이 표현형 가소성의 분자 토대는 잘 이해되지 유지. 육종 MET의 메커니즘과 드라이버를 연구하기 위해 우리는 두 가지 상피 특정 요소를 사용하여 MET 유도의 모델을 개발, 마이크로 RNA (은 miR) -200 가족과 grainyhead 같은 2 (GRHL2). 미르-200S는 messen의 3 '의 UTRs에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는 작은 비 RNA를 코딩하는 가족게르 RNA와 단백질에 방지 번역. 미르 141, 미르 (200A)를 포함 하나, 미르-200B, 200C 미르, 미르-429을 포함한 타 - 미르-200 가족 개의 서브 그룹들로 구성된다. 미르-200 계열의 구성원은 상피 조직에 충실 미르-200S 손실은 암 (19)의 전이와 관련된다. 미르-200 계열은 정상 조직에 비해 20 연조직 육종에서 하향 조절된다. 미르-200S 유사하게, GRHL2 상피 개발 (21)에 대한 중요 핵심 레귤레이터이다. GRHL2 전사 인자는 E-cadherin의 상피 유전자를 상향 조절하는 방법은 두 가지 작용 1) 상피 세포에서 GRHL2 직접 EMT 마스터 레귤레이터 억압을 ZEB1 22; 2) GRHL2 직접 상피 유전자 (23)의 전사를 활성화합니다. 우리의 이전 연구는 것으로 나타났습니다 육종 세포 미르-200S와 GRHL2의 결합 된 표현MET-같은 표현형 (24)를 유도한다. 여기서는은 miR-200S 및 GRHL2의 이소성 발현하여 육종 세포에서 MET 유도 시험 관내 모델을 작성하는 구체적인 프로토콜을 제안한다.

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프로토콜

시약의 제조 1.

  1. 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 (5,000 U / ㎖) 500 ㎖의 DMEM에 5 mL의 50 ㎖를 첨가하여 세포를 DMEM 배양을 준비한다. 이 매체는 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 10 μM의 최종 농도 핵산 분해 효소가없는 물에 동결 건조 된 프라이머를 재현 탁. 저장 -20 ° C에서 프라이머를 재 - 중단.
  3. radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS, 50 개 mM 트리스, pH를 8.0)을 준비한다. 사용하기 전에 프로테아제 억제제 칵테일 보충 및 사용시 얼음에 버퍼를 유지한다. 4 ℃에서 보관하십시오.
  4. 0.45 ㎛의 폴리 필터를 이용하여 멸균 물 및 주사기 필터에 10 ㎎ / ㎖의 폴리 브렌 (hexadimethrine 브로마이드)를 준비한다. 솔루션은 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  5. PBS 10 ㎖의 10 ㎎을 용해시켜 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드의 1 ㎎ / ㎖ 작업 용액을 제조 하였다. 4 ℃에서 보관하십시오.

GRHL2 2. 렌티 바이러스 형질 도입

1 일

  1. 접시 보충 DMEM 2 ㎖로 6 웰 플레이트에 웰당 3 × 105 HEK293T 세포. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 정량화. 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양 한 후 60 % 융합 - 셀 40이어야한다.

제 2 일

  1. 1.8 pΔ8.9의 μg의 및을 pCMV-VSV의 0.2 μg의와 함께 혈청이없는 미디어의 200 μL에 2 빈 벡터의 μg의 (을 pCMV-UBC-EGFP) 또는 둘을 pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24 μg의 25 희석 -G 도우미 플라스미드. 별도의 튜브에, 형질 당 혈청이없는 배지 (두 샘플 400 μL 8 μL)을 200 μL의 지질 계 형질 감염 시약 4 μL 희석. 각 플라스미드 용액으로 형질 전환 시약 혼합물을 200 μL를 첨가하고 실온에서 20 분 동안 배양한다.
  2. incuba 동안능은, 진공 흡인에 의해 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖로 세포를 세척함으로써 HEK293T 세포를 세척한다. 혈청이없는 미디어의 800 μL와 PBS를 교체합니다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 2 시간 동안 세포를 각 웰에 적하 단계 2.2에서 플라스미드 혼합물을 배양하고 20 분 후에, 트랜 스펙 션 시약 200 μL를 추가한다.
  3. 조심스럽게 진공 흡인 형질 감염 배지를 제거하고 보충 된 DMEM 2 mL로 교체한다. 하룻밤 문화 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
    참고 : HEK293T 세포는 느슨하게 부착합니다. 미디어 교체 접시 또는 플라스크의 바닥으로부터 세포를 제거하기 위해주의를 제한하여 수행되어야한다.

3 일

  1. 보충 된 DMEM 2 ㎖로 형질 HEK293T 세포 플레이트에 6 웰 플레이트의 웰 당 3 × 105 RD 세포를 새로 고침 매체. 하룻밤 문화 전지. RD 세포는 시판 인간 횡문근 육종 세포주이다.

4 일

  1. HEK293T 세포에서 바이러스 성 미디어를 수집합니다. 새로운 15ml의 원뿔형으로 HEK293T 세포 장소로부터 DMEM 배지 피펫. 조심스럽게 다시 다음 날을위한 인큐베이터에서 새로운 DMEM 매체와 장소 HEK293T 세포로 대체합니다.
  2. 두 개의 새로운 50ml의 원뿔형 튜브 (GRHL2 형질 대한 빈 벡터 형질 다른 하나)로 10 밀리그램 / 바이러스 미디어 1 ㎖ 당 용액의 폴리 브렌 2 μL를 추가한다. 3 ml 주사기의 플런저를 제거하고 선단에 0.45 ㎛의 폴리 필터를 부착하여 주사기 필터 바이러스 매체.
    1. 주사기 배럴로 단계 260에서 수집 된 바이러스 미디어를 추가하고, 폴리 브렌을 함유하는 새로운 50 개 ㎖ 원뿔형 튜브에 미디어를 뛰어. 진공 흡인 RD 세포로부터 용지를 분리 RD 세포 바이러스 여과 매체를 추가한다.

5 일

  1. 바이러스 미디어가 수집 한 후 반복 일 4. HEK293T 세포는 폐기 될 수있다.

7 일

  1. 워시 RD의 PBS 1 ㎖로 세포를 200 0.05 % 트립신 μL 웰 당을 추가한다. 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션 보충 미디어 2 ㎖를 추가하고, 새로운 15ml의 원뿔에 세포 현탁액을 이동. 실온 대기음 매체에서 5 분 동안 원심 분리기 (250) XG 세포. DMEM 1 ㎖에 재현 탁은 (5 % FBS 및 1 %의 페니실린 스트렙토 마이신이 보충).
    참고 : FBS의 높은 비율을 사용하여 유동 세포 계측법 동안 막힘이 발생할 수 있습니다
    1. 유동 세포 계측법에 대한 필터 세포. 얼음 튜브 대신 파이프를 유세포 분석기로 30 μm의 필터를 사용하여 1 ㎖의 RD 세포 현탁액을 적용하기 위해 피펫을 사용한다.
    2. 0.5ml의 DMEM을 함유하는 1.5 mL의의 마이크로 원심 튜브에 놓아 + EGFP 셀 26 얼음에 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충 장소. 플레이트는 EGFP + 배양 인큐베이터에서 12 웰 플레이트와 장소의 단일 웰에 첨가 DMEM 1 ㎖의 총 세포를 분류.
      ; 참고 : 흐름 계측법이 전달 후 EGFP + 세포의 수율은 일반적으로 저 (50000 개 세포)이다. 3 단계로 진행하기 14 일 전 - 세포는 10 배양해야 할 수도 있습니다.

미르 200S 3. 역방향 형질

  1. 반복 된 동결 / 해동 사이클을 피하기 위하여 -20 ° C에서 클레아없는 H 2 O. 나누어 축적량 및 저장소를 사용하여 결과 miR-200 모방 50 개 μM 주식을 준비한다.
  2. 혈청이없는 배지 300 μL 300 μL의 혈청이없는 배지에서 50 μM 음성 대조군 miRNA를 9 μL 각 50 μM은 miR-200 모방 (미르 200A 미르-200B, 미르-200C) 3 μL를 추가한다.
  3. 혈청이없는 배지 600 μL에 siRNA를 형질 특정 시약 6 μL를 첨가하고 두 튜브, 단계 3.2에서 두 미르 혼합물의 각 하나에이 혼합물을 300 μL를 나눈다. 형질 전환 시약 300 μL를 혼합하여, 각 단계에서 3.2 미르 혼합물의 300 μL를 결합. 방 TE에서 20 분 동안 인큐베이션mperature.
  4. 배양하는 동안, 2.4 ㎖의 생성 된 제 2 또는 EV GRHL2 EGFP 발현 600000 개 + RD 세포의 세포 현탁액 처리 당 혈청 매체 (250 세포 / μL)을 준비한다.
  5. 24- 웰 플레이트에서, 여섯 개 웰로은 miR-200 혼합 또는 단계 3.3 대조군 혼합물의 웰 당 100 μL를 추가 한 다음 각 미르 믹스 세 웰에 각각의 세포 현탁액을 400 μL를 추가한다.
  6. 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 밤새 인큐베이션 미디어 변경 완전히 다음날 DMEM을 첨가한다. 적절한 완충액 (하기 참조)을 이용하여 분석을 2 일 후, 세포를 수집한다. MET를 겪고 RD 육종 세포의 시간 경과 영상은 보충 자료로 사용할 수 있습니다. 이미지 자동 라이브 셀 이미 저 (27)를 사용하여 10 배 목적으로 각 웰마다 2 시간.

4. RNA 추출, 역전사 및 qPCR에

  1. 표준 RNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출추출 키트 (24). 추출 된 RNA는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. RNA 농도를 정량화. 해동 얼음에 RNA와 함께 작동합니다. , RNA 농도를 정량화 제조사의 프로토콜에 따라 플레이트 리더 분광 광도계로 260 nm에서 UV 흡광도를 측정한다. 핵산 분해 효소가없는 물을 낮은 농도의 모든 샘플을 희석.
  3. 상보 적 DNA (cDNA의) 총 RNA로 역전사를 수행한다. 20 μL의 반응 부피 24 효소 및 뉴 클레아없는 물을 역 PCR 완충액의 dNTP 믹스 (100 mM)을 랜덤 헥사 머 프라이머와 총 RNA의 덜 100 NG를 결합하지 않는다. 제조의 프로토콜에 따라 RT주기를 실행합니다. cDNA를 -20 ° C에서 장기 저장할 수 있습니다.
  4. 뉴 클레아 제 무 H 2 O 80 μL에 100 μL에 20 μL 반응 희석
  5. 형광 기반 인터 염료 배 qPCR의 마스터 믹스를 5 μL, 각각 10 μM의 프라이머 0.06 μL를 섞어샘플 당 희석 RT 반응 ND 2 μL.
  6. 형광 기반의 마스터 믹스 제조 업체의 프로토콜에 따라 실행 qPCR에.
  7. 델타 CT 법에 의해 mRNA의 상대적인 양을 정량화 GAPDH로 정상화. 각 치료 그룹에 대한 표준 편차 ± 생물 복제의 평균 mRNA 발현을 그린다.
    참고 : 등의 RNase없는 플라스틱 및 시약을 사용하는 등 RNases과 접촉을 피하기 위해 RNA로 작업 할 때 특별한 예방 조치가 취해 져야한다. 비 일회용 장비는 RNases을 제거하기 위해 사용하기 전에 처리해야합니다.

5. 면역 형광 염색

  1. 24- 웰 포맷에서 RD 세포로부터 진공 흡인 단계 3.6 대기음 미디어 다음.
  2. 웰당 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 500 μL를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 15 분 (RT) 동안 배양. 정착 이후, 인산 장소 세포 밤새 필요한 경우 39 ° C에서 생리 식염수 (PBS) 및 스토어 버퍼.
  3. Permeabilize 하시려면PBS + 0.2 % 트리톤 X100 500 μL를 첨가하고, RT에서 30 분 동안 배양하여 세포. 진공 흡인, permeabilization 버퍼를 제거하고 PBS로 3 회 세척 하였다.
  4. 5 % 소 혈청 알부민 500 μL (BSA) / PBS에서 차단하고 RT에서 30 분 동안 세포를 배양한다. 세포를 밤새 필요한 경우 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  5. 차 항체 희석을 준비한다. 15 ML 원뿔로 5 % BSA 피펫 200 μL / 웰 당 PBS (12 웰 = 2.4 mL) 및 5 % BSA 1 ㎖ 당 1 차 항체 μL를 추가 / PBS를 필요로했다. 진공 흡인 차단 완충액을 제거하고, 각 웰에 희석 된 일차 항체의 200 μL 분주.
    1. 1 세포를 인큐베이션 : 5 % BSA에서 희석 된 1000 개 차 항체 / PBS 실온에서 1 시간 동안 또는 밤새 4 ℃에서. 부화 후, PBS로 세포를 두 번 씻는다.
  6. 상기와 같이, 5 % BSA / PBS 동량의 차 항체 희석을 준비한다. 2,000 희석 : 1을 사용하여 원적외선 염료 복합 이차 항체를 추가합니다. 또한 추가믹스 훽스트 염료 1 ㎍ / mL로. PBS를 제거하고 각 웰에 믹스 200 μL를 추가합니다.
    1. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. PBS로 3 회 세척, PBS에서 셀을두고 호일을 사용하여 빛으로부터 세포를 보호합니다. 필요한 경우 세포를 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  7. 650 나노 미터 - 여기 파장 (594)와 반전 된 표면 형광 현미경의 400 배의 총 배율에서 이미지 셀.

6. 웨스턴 블로 팅

  1. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 3.6에서 세포를 씻으십시오. 얼음, 1X RIPA 50 μL와 세포를 Lyse 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 버퍼입니다.
  2. 15 분 동안 4 ℃에서 락 해물을 5 분 샘플을 명확히하기위한 고속 (20,000 XG)에 1.5 ㎖의 튜브에 해물을 원심 분리 수집. 필요한 경우 세포 용 해물은 -80 ° C에서 장기 저장할 수 있습니다.
  3. 브래드 포드 분석을 이용하여 총 단백질을 정량화 된 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질의 동일한 양 나누어지는. 브린2- 머 캅토 에탄올이 보충 된 RIPA 완충액과 3X 램리 로딩 완충액을 사용하여 동일한 부피 샘플 g.
  4. 95 ° C에서 5 분 동안 1X 램 믈리 시료 완충액 로딩 샘플을 인큐베이션하고 45 분 동안 200 V에서 4-12 % 트리스 - 글리신 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 실행. 세포주에 따라 단백질 적재 범위의 양. 어떤 경우에는, 총 단백질의 50 ~ 100 μg의는 중간 엽 세포 라인에서 E-cadherin의를 감지하기 위해 필요합니다.
  5. 1X 트리스 - 글리신 전송 버퍼에서 50 V에서 2 시간 동안 니트로 셀룰로오스 막 상으로 전달 단백질.
  6. 실온에서 밤새 또는 BSA 기반 차단 완충액 4 ° C에서 1 시간 동안 차단 막.
  7. 차단 완충액 5 mL 중에 1000 농도로 희석 멤브레인을 추가하고 부드러운 실온에서 또는 밤새 4 ℃에서 1 시간 동안 흔들 함께 배양 1 주에서 항체를 희석. 0.05 % 트윈 20과 함께 PBS에서 세척 막을 3 회.
  8. 적외선 형광 결합 secondar 함께 RT에서 1 시간 동안 막을 인큐베이션예 1에서 항체 : 위와 블로킹 완충액에 희석 20,000.
  9. 0.05 % 트윈 20과 함께 PBS로 막 두 번 세척하고 PBS에 다음 한 시간.
  10. 표준 적외선 형광 검출을 이용하여, 화상을 막.

7. 앵커리지 독립적 인 성장 분석

참고 : 자세한 부드러운 한천 분석 프로토콜의 28을 참조하십시오.

  1. 온수욕에서 42 ° C로 예열 멸균 배 DMEM 배지. 이 시간 동안, 열은 3 분 동안 전자 레인지에서 1 % 아가로 미리 멸균. 필요하거나 완전히 용해 될 때까지로 한 번에 추가로 30 초 동안 전자 레인지. 42 ° C의 물을 욕조에 아가로 이동합니다.
  2. 무균 후드에서 42 ° C의 물과 함께 비이커에 50ml의 원뿔형 튜브를 배치하고, 1을 1 % 아가 로즈 및 배 DMEM 배지를 혼합 : 6 웰 플레이트에 웰 당 혼합물을 1.5 mL의 1 비율 회계. 항상 DMEM 아가로 오스 피펫 오류에 대해 설명 할 / 추가로 준비하고 거품을 피하기 위해.
  3. 받는 사람 혼합물을 추가기포를 확보하지 웰의 측면, 형태 및 RT에서 30 분 동안 방치하자.
  4. 하부 층이 고화되는 동안 미디어를 흡입하고 1 ㎖의 PBS로 한번 세척 3 단계에서 형질 RD 세포의 각 그룹을 준비한다. 대기음 PBS 및 0.05 % 트립신, 0.2 mL를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  5. 단일 세포 현탁액을 형성하기 위하여 미디어 씹다 세포를 0.8 mL의 트립신을 중화. 15 mL의 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 전송.
  6. 세포를 세어 웰 당 10,000 세포에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산한다.
  7. 완전히 용해 될 때까지 한 번에 30 초 다음 3 분 동안 전자 레인지에서 0.6 % 아가로 가열한다. 42 ° C의 물을 욕조에 아가로 이동합니다.
  8. 무균 후드에서 42 ° C의 물과 함께 비이커에 50ml의 원뿔형 튜브를 놓는다. 6 웰 플레이트에 웰 당 1.5 ㎖의 혼합물을 제조 한 비 : 1의 0.6 % 아가로 희석 세포 현탁액을 혼합한다. 항상 피펫 오류를 설명하는 혼합 아가로 오스 / 여분의 세포 현탁액을 준비하고거품을 방지한다.
    참고 : 여기에 42 ° C에서 작동하는 것이 중요합니다. 온도가 너무 낮 으면, 혼합물 도금 전에 고체화되고, 42 ° C 이상의 온도가 세포 생존에 영향을 미칠 것이다.
  9. 세포를 여러 번으로 분쇄하여 잘 혼합 및 기포 형태를 보장하지 웰에 세포 혼합액을 추가하고, 실온에서 20 분 동안 응고하자.
  10. 각 보충 미디어 2 용액을 웰에 첨가하고 플레이트를 인큐베이터를 이동.
    1. 3~4주 또는 다세포 식민지 형성 할 때까지 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 진공 흡인에 의해 용지를 제거 할 때 한천을 만지지 않도록주의하십시오. 대안 적으로, 액체 매질의 상층을 제거하는 P1000을 사용한다.
    2. 200 μL 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 용액을 첨가하여 (1 밀리그램 / PBS 용액에서) 소프트 한천 플레이트 얼룩과 37 ℃에서 밤새 배양 접시. 영상 PBS로 다음날 매체를 교체합니다.
    3. 거꾸로 현미경에 40X 총 배율에서 이미지 우물.
    4. 식민지 지역 및 번호 ImageJ에에 분석을 수행합니다. 플롯은 생물 복제의 콜로니 수는 표준 편차를 ± 의미한다.

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결과

육종 세포에서 MET 유도를위한 스키마

육종 세포에서 MET와 같은 변화의 도입을위한 일반적인 타임 라인은도 1에 도시되어있다. 프로토콜은 미르-200 계열 (도 1b)의 형질 GRHL2 하였다 (도 1a)을 열 변환하는 것으로 시작한다. GRHL2 또는은 miR-200 가족만으로는 표현할 때 RD 세포의 모양에 영향을 ?...

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토론

육종은 중간 엽 계보의 희귀하지만, 매우 공격적인 암이다. 자신의 중간 엽 혈통에도 불구하고, 육종의 부분 집합은 더 상피와 같은 상태로 형질 전환을 겪을 것으로 보인다. 더 상피와 같은 종양을 가진 환자가 24 덜 공격적으로이 MET-같은 스위치는, 예후 관련이있다. 임상 관련성에도 불구하고, 육종 이러한 형질 전환을 운전하는 분자 메커니즘을 해결 몇몇 연구가있다.

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공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

JAS는 듀크 암 연구소, 듀크 대학 비뇨 생식기 종양학 연구소 및 정형 외과의 듀크 대학교의 지원을 인정합니다. HL은 이론 생물 물리학에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation, NSF) 센터에 의해 지원되었다 (NSF PHY-1427654)와 NSF DMS-1361411, 텍사스 주 암 연구에 CPRIT로 (암 예방 및 텍사스 연구소) 학술 라이스 대학 (Rice University)에서. KEW는 NIH F32 CA192630 MKJ 지원하고 HL 메리 C. Farach-카슨 JN Onuchic 사미르 M. Hanash, 케네스 J 피엔타, 도널드 S. 코피 유용한 논의 혜택.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

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Shengnan Xu

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