JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Biz burada mikroRNA-200 aile üyeleri ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) kombine ektopik ifadesine dayalı sarkom hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişler (MET) uyarılması için bir hücre kültürü yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem kanser agresiflik ve tedavileri hakkında fenotipik esneklik biyolojik etkilerini daha iyi anlamak için uygundur.

Özet

Fenotipik plastisite hücreleri geçici olarak başka bir soy özellikleri elde ettiği bir olguya karşılık gelir. karsinoma ilerleme sırasında, fenotipik plastisite işgali, yayılmasını ve metastaz sürer. fenotipik plastisite çalışmaların çoğu epitel türetilmiş karsinom bağlamında olmuştur Nitekim, bir mesenchymal- benzer bir fenomen geçiren sarkomlar bir alt kümesi ile de fenotipik plastisite sergiler, mezenkimal kaynaklı olan sarkomu, çıkıyor epitel geçiş (MET). Burada, sırasıyla ardışık GRHL2 ve miR-200 ailesi, hücre transdüksiyonunu ve transfeksiyon kullanılarak ifade sarkom hasta samples.We gözlemlenen bu MET benzeri fenomen taklit etmek için miR-200 aile ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) içeren bir yöntem geliştirdi daha iyi sarkom hücrelerinde bu fenotipik geçişlerinin moleküler temellerini anlamak. miR-200S ve GRHL2 ifade sarkomu hücreleri gelişmiş epitel characterist gösterdiHücre morfolojisi ve epitel ve mezenkimal biyobelirteçlerinin değiştirilmesinin ics. Bu yöntemleri kullanarak gelecekteki çalışmalar ile göç, invazyon, metastatik eğilimi ve tedavi direnci gibi sarkom hücreleri üzerinde MET benzeri işlemler, fenotipik sonuçlarını anlamak için kullanılabilir.

Giriş

Fenotipik plastisite hücre fenotipleri arasında tersinir bir geçiş anlamına gelir ve genel olarak iki tip epitelyal-to-mezenşimal (EMT) geçişler ve mezenkimal-için-epitel geçişler (MET) bölünür. Bu fenotipik plastisite bu gelişme ve yara iyileşmesi 1 olarak çok hücreli organizmalardan normal süreçlerde önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, bu aynı yollar ve gen ekspresyonu programları da fibroz, hastalığa yol açabilir (inceleme 2, 3, 4) ve karsinoma metastazı (referanslar 5, 6, 7 gözden, 8). Metastaz sırasında, örneğin, EMT hücre polarite, hücre-hücre etkileşimleri bozar ve istila 9, 10 destekler. Birlikte, EMT katkıdaKanser hücresi yayılmasını kolaylaştıran bir fenotipik durumuna s. Buna ek olarak, EMT aynı zamanda kanser hücre metabolizması 6 deregülasyonu, ilaç direnci 11, 12 geliştirilmesi dahil olmak üzere agresif fenotipi sürücü diğer fenotipik değişiklikler, artmış tümör başlatma yeteneğine 13, 14 ve bağışıklık kaçırma 15 ev sahibi bir dizi yol açar.

Fenotipik esneklik de karsinoma ilerlemesinde çalışılmıştır; Bununla birlikte, sarkomlar da fenotipik plastisite sergiler. karsinom fenotipik esneklik aynı sürücülerin bazıları da sarkom plastisite ve agresiflik katkıda sanki İlginçtir, o görünür. Örneğin, sarkom hastaların dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) EpCAM'ı, tipik olarak, epitel hücreleri 16 üzerinde bulunan bir hücre yüzeyi proteinini ifade etmek için gösterilmiştir. Addiarası olarak, 250 yumuşak doku sarkomu örnekleri epitelyal benzeri veya mezenşimal benzeri gen ifadesine dayalı olarak sınıflandırılmıştır. Epitel benzeri biyomarker imzadaki hastalar mezenkimal benzeri biyomarker imza 17 olan hastalarda daha iyi bir prognozu vardı. Bu, daha fazla epitel benzeri karsinom olan hastaların daha mezenkimal benzeri tümörler 18 olan hastalarla karşılaştırıldığında daha iyi sonuçlar sahip olduğu birçok karsinom, tutarlıdır.

Bazı sarkomlar biyolojik ve MET tutarlı gen sentezleme yolları gösterilirken, bu fenotipik esneklik moleküler temelleri yeterince anlaşılamamıştır. sarkomda MET mekanizmaları ve sürücüleri incelemek için iki epitel özgü faktörleri kullanılarak MET indüksiyon bir model geliştirdi, mikroRNA (miR) -200 ailesi ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2). miR-200S Messen 3' UTR bağlanarak gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar ailesidirger RNA ve protein içine önleme çevirisi. miR-141 ve miR-200a ihtiva eden bir ve miR-200b, miR-200c ve miR-429 de dahil olmak üzere - diğer miR-200 ailesi, iki alt grup oluşur. MiR-200 ailesinin üyeleri epitel dokuları açısından zengindirler ve miR-200s kaybı karsinomları 19 metastaz ile ilişkilidir. MiR-200 ailesi de normal doku 20 ile karşılaştırıldığında yumuşak doku sarkomları aşağı regüle edilir. MiR-200'ler benzer şekilde, GRHL2 epitel gelişimi 21 için önemli olan düzenlenmesinde anahtar rol oynar. GRHL2 transkripsiyon faktörü, E-kadherin gibi epitel genleri, yukarıya doğru düzenlemek için iki şekilde hareket eder: 1) epitel hücrelerinde, GRHL2 şirketinden EMT ana regülatör bastırmaktadır, ZEB1 22; ve 2) GRHL2 direkt olarak epitel genlerin 23 transkripsiyonunu aktive eder. Bizim önceki araştırmalar göstermiştir ki sarkom hücrelerinde miR-200'ler ve GRHL2 birleşik ifadesiBir MET benzeri fenotip 24 indükler. Burada, miR-200S ve GRHL2 ektopik ekspresyonu ile sarkom hücrelerindeki MET indüksiyon in vitro bir model oluşturmak için ayrıntılı protokol mevcut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Reaktiflerin hazırlanması 1.

  1. fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (5,000 U / mL), DMEM, 500 mL, 5 mL, 50 mL ilave edilerek hücre kültürü için DMEM hazırlayın. Bu ortam, en fazla altı ay için 4 ° C'de saklanabilir.
  2. 10 uM'lik bir son konsantrasyon elde nükleaz içermeyen su içinde liyofilize primerler yeniden süspanse edin. -20 ° C'de, primerlerin yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
  3. radyoimmünopresipitasyon deneyi (RIPA), tampon (150 mM NaCl,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce, proteaz inhibitör kokteyli ile tamamlamak ve kullanım sırasında buz üzerinde tampon tutun. 4 ° C'de saklayın.
  4. 0.45 um polietersülfon filtre kullanılarak sterilize etmek için su ve şırınga filtresi 10 mg / ml polibren (heksadimetrin bromür) hazırlayın. Çözelti altı aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  5. PBS, 10 ml 10 mg nitrotetrazolivm klorür, 1 mg / ml çalışma çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.

GRHL2 2. lentiviral İletimi

1.gün

  1. Levha takviye edilmiş DMEM 2 mL, 6 gözlü bir plakanın her çukuruna 3 x 10 5 HEK293T hücreleri. Otomatik bir hücre sayacı hücreleri sayısal olarak. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece kültürden sonra,% 60 konfluent - Hücreler 40 olmalıdır.

2. gün

  1. 1.8 pΔ8.9 ug ve pCMV-VSV'nin 0.2 ug ile birlikte, serum içermeyen ortam, 200 uL 2 boş vektör ug (pCMV-UBC EGFP) ya da 2, pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24 ug, 25 seyreltin -G yardımcı plazmid. Ayrı bir tüp içinde, transfeksiyon başına serumsuz ortam (iki numune için 400 uL 8 uL), 200 uL bir lipid bazlı transfeksiyon reaktifi 4 uL seyreltin. Her plazmid çözeltisine transfeksiyon reaktifi karışımın 200 uL ilave edilir ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
  2. incuba sırasındabelirleme, vakum aspirasyon ile orta çıkarılması ve 1 mL PBS ile hücrelerin durulanarak HEK293T hücreleri yıkayın. serumsuz ortamın 800 mcL ile PBS değiştirin. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 2 saat boyunca hücrelerin her bir adım 2.2 damla damla plazmid karışımını inkübe: 20 dakika sonra, transfeksiyon tepkin maddesi 200 uL ekleyin.
  3. Dikkatle vakum aspirasyon ile transfeksiyon ortamı ortadan kaldırmak ve takviye edilmiş DMEM 2 mL ile değiştirin. Gece boyunca kültür için inkübatör hücreleri dönün.
    NOT: HEK293T hücreleri gevşek yapışık bulunmaktadır. Ortam değişimi tabak veya şişe tabanından hücrelerin çıkarılmasını sınırlamak için dikkatle gerçekleştirilmelidir.

3. Gün

  1. Takviye edilmiş DMEM 2 mL transfekte HEK293T hücrelerinin ve plaka üzerinde, 6 gözlü bir plakanın her çukuruna 3 x 10 5 RD hücreleri ortamı yenileyin. Gece boyunca Kültür hücreleri. RD hücreleri, ticari olarak temin edilebilen insan rabdomiyosarkom hücre çizgisidir.

4. Gün

  1. HEK293T hücrelerinden viral ortamı toplayın. yeni bir 15 ml konik içine HEK293T hücrelerinin ve yerden DMEM ortamı pipetle. Dikkatle geri ertesi gün için kuluçka yeni DMEM medya ve yer HEK293T hücreleri ile değiştirin.
  2. iki yeni 50 ml konik borular (GRHL2 transfeksiyon için, boş vektör transfeksiyonu için) ve başka içine, 10 mg / viral medya mL'si başına ml polibren 2 uL ekleyin. 3 ml'lik bir şırınga pistonu çıkarılması ve uç için 0.45 um polietersülfon filtre iliştirmek Şırınga filtre viral ortam.
    1. şırınganın haznesine adım 2.6 toplanan virüs ortam ekleyin ve polybrene ihtiva eden yeni bir 50 mL konik tüp içine ortam dalma. Vakum aspirasyon ile RD hücrelerinden Ortamı çıkarın ve RD hücrelerinden üzere filtre virüs ortamı eklenir.

5. Gün

  1. Viral medya toplandıktan sonra tekrarlayın Gün 4. HEK293T hücreleri atılabilir.

7. Gün

  1. Yıkama RD 1 mL PBS ile hücre ve 200% 0.05 tripsin uL çukur başına ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir takviye edilmiş bir ortam, 2 ml ekleyin ve yeni bir 15 ml konik hücre süspansiyonu hareket ettirin. Oda sıcaklığında ve aspirat ortamı 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje hücreleri. DMEM, 1 mL içinde süspanse (% 5 FBS ve% 1 ile takviye penisilin-streptomisin).
    NOT: FBS daha yüksek bir yüzdesi kullanılarak flow sitometri sırasında tıkanma neden olabilir
    1. flow sitometri için filtre hücreleri. Buz üzerinde boru ve yer tüpler akış sitometrisi bir 30 um filtre üzerinden 1 ml RD hücre süspansiyonunun tatbik edilmesi için bir pipet kullanın.
    2. DMEM, 0.5 mL içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine kriteri + EGFP hücreler 26 buz üzerinde,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ve yer ile desteklenmiştir. Plaka eGFP + kültür inkübatörü içinde 12 oyuklu plaka ve yer tek bir kuyusuna takviye edilmiş DMEM, 1 mL toplam tasnif edilen hücreler.
      ; NOT: akışından sitometri bu transdüksiyon sonra EGFP + hücrelerinin verimi, genellikle düşük (50,000-100,000 hücre). 3. adıma ilerlemeden önce, 14 gün - Hücreler 10 kültürlenebilir gerekebilir.

miR-200s 3. Ters transfeksiyonu

  1. Tekrarlanan donma / erime döngülerinden kaçınmak için -20 ° C'de nükleazsız H2O kısım stokları ve deposunu kullanan miR-200 taklit 50 uM stokları hazırlayın.
  2. serumsuz ortam 300 uL veya 300 uL serumsuz ortama 50 uM negatif kontrol miRNA'nm 9 uL, her 50 uM miR-200 mimik (miR-200a, miR-200b ve miR-200c) 3 uL ekleyin.
  3. serumsuz ortam 600 uL siRNA özgü transfeksiyon reaktifi 6 uL ekleyin ve iki boru, adım 3.2 iki mıR karışımlarının her biri için bir içine bu karışımın 300 uL bölün. transfeksiyon reaktifi 300 uL bir karışımı ile adım 3.2 'den her mıR karışımı 300 uL birleştirin. Oda te 20 dakika süreyle inkübe edinmperature.
  4. kuluçka sırasında, 2.4 mL, Bölüm 2'de oluşturulan EV veya GRHL2 eksprese 600,000 eGFP + RD hücrelerinden oluşan bir hücre süspansiyonunun muamele başına serumsuz ortam (250 hücre / ml) hazırlayın.
  5. 24 oyuklu bir plaka, altı kuyu içine miR-200 karışımı ya da adım 3.3 negatif kontrol karışımı oyuk başına 100 uL ekleyin ve daha sonra her bir miR karışımın üç kuyu içine her bir hücre süspansiyonu 400 uL ekleyin.
  6. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de hücreler bir gece boyunca inkübe edin ve ortamı değiştirmek tam ertesi gün DMEM takviye etmek. Uygun tampon (aşağıya bakınız) kullanılarak analiz için 2 gün sonra hücreler toplanır. MET geçiren RD sarkom hücrelerinin zaman atlamalı görüntüleme tamamlayıcı malzeme olarak kullanılabilir. Görüntü otomatik canlı hücre görüntüleyici 27 kullanan bir 10X amacı ile her kuyu her 2 saat.

4. RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve qPCR

  1. Standart bir RNA kullanılarak üreticinin talimatlarına göre RNA Özüekstraksiyon kiti 24. Çıkarılan RNA -80 ° C'de saklanabilir.
  2. RNA konsantrasyonu ölçmek. Çözülme ve buz üzerinde RNA ile çalışır. RNA konsantrasyonlarının ölçümü, üreticinin protokolüne uygun olarak, bir plaka okuyucu spektrofotometre ile 260 nm'de UV absorbansı ölçmek. nükleaz içermeyen su ile en düşük konsantrasyonu, tüm numuneler seyreltin.
  3. Tamamlayıcı DNA (cDNA) içine toplam RNA ters transkripsiyon gerçekleştirin. Bir 20 uL reaksiyon hacmi 24 transkriptaz ve nükleaz içermeyen su, ters PCR tamponu, dNTP karışımı (100 mM), rastgele heksamer primerleri ile total RNA en az 100 ng birleştirin. imalatçının protokolüne göre RT döngüleri çalıştırın. cDNA, -20 ° C de, uzun süreli saklanabilir.
  4. Nükleaz içermeyen H2O 80 uL 100 uL 20 uL reaksiyonları seyreltin
  5. bir floresans bazlı interkalasyon boya 2x qPCR ana karışımı 5 uL, her biri 10 uM primer 0.06 uL, karıştırınörnek başına seyreltilmiş RT reaksiyonunun nd 2 uL.
  6. floresan bazlı ana karışımı için üreticinin protokole göre çalıştırın qPCR.
  7. Delta BT yöntemi ile mRNA'nın nispi miktarlarını ölçmek ve GAPDH için normalize. Her tedavi grubu için ortalama ± standart sapma biyolojik tekrarın ortalaması mRNA ekspresyonunu çizilir.
    NOT: Bu RNaz içermeyen plastik ve reaktif maddelerin kullanıldığı olarak RNases, temastan kaçınmaya RNA ile çalışırken özel önlemler alınmalıdır. Sigara atılabilir ekipman RNases kaldırmak için kullanılmadan önce tedavi edilmelidir.

5. Bağışık Boyama

  1. 24 oyuklu bir formatta RD hücrelerinden vakum aspirasyon adım 3.6, aspirat ortam et.
  2. oyuk başına% 4 paraformaldehit (PFA), 500 uL ekleyerek hücreleri saptamak ve oda sıcaklığında 15 dakika (RT) enkübe edilir. tespit sonra, fosfat yer hücreleri gerektiğinde gece boyunca 4 ° C'de tuzlu su (PBS) ve mağaza tamponlu.
  3. PermeabilizePBS +% 0.2 Triton-X100, 500 uL ilave edilmesi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe göre hücre. vakum aspirasyon ile, permeabilizasyon tamponu çıkarın ve üç kez PBS ile yıkayın.
  4. % 5 bovin serum albümini, 500 uL (BSA) / PBS içinde Blok ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Hücreler, bir gece boyunca, gerekirse 4 ° C'de saklanabilir.
  5. Primer antikor seyreltme hazırlayın. 15 ml konik içine% 5 BSA pipetle 200 uL / ​​göz başına PBS (12 kuyu = 2.4 mL) ve% 5 BSA mL'si başına birincil antikor 1 uL ekleyin / PBS içinde gerekli. Vakum aspirasyon ile Bloklama tamponunu çıkarın ve her bir oyuğa seyreltilmiş birincil antikor 200 uL dağıtın.
    1. 1 hücreleri inkübe:% 5 BSA 1000 seyreltilmiş primer antikorlar / PBS içinde 1 saat süre ile, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de karıştırıldı. İnkübasyondan sonra, hücreler PBS ile iki kez yıkanır.
  6. yukarıdaki gibi% 5 BSA / PBS, aynı hacimde ikincil antikor seyreltme hazırlayın. 2,000 seyreltme: 1 kullanarak uzak-kırmızı boya-konjüge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Ayrıca eklemekkarışıma Hoechst boya 1 ug / ml. PBS çıkarın ve her bir oyuğa karışımdan 200 uL ekleyebilir.
    1. karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PBS ile 3 kez yıkayın, PBS hücrelerin bırakın ve folyo kullanarak ışık hücreleri korur. Gerekirse Hücreler, 4 ° C'de saklanabilir.
  7. 650 nm - eksitasyon dalga boyu 594 ile ters epifloresans mikroskop 400X toplam büyütmede Resim hücreleri.

6. Western Blot

  1. buz gibi soğuk PBS ile iki kez 3.6 hücreleri yıkayın. Buz üzerinde, 1 x RIPA 50 uL lize hücreleri 1 x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş tampon.
  2. 15 dakika boyunca 4 ° C 'de kaya lizatları, 5 dakika örnekleri açıklamak için yüksek hızda (20,000 xg) 1.5 ml tüpler içine lizatları ve santrifüj toplar. gerektiğinde hücre lizatları, -80 ° C'de uzun süreli saklanabilir.
  3. bir Bradford tahlili kullanılarak toplam protein miktarını ve yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine protein eşit miktarda kısım. Brin2-merkaptoetanol ile takviye edilmiş RIPA tamponu ve 3x Laemmli yükleme tamponu kullanılarak eşit hacme gr numune.
  4. 95 ° C'de 5 dakika süre ile 1 x Laemmli numune yükleme tamponu içinde inkübe edin ve 45 dakika boyunca 200 V'de% 4-12 Tris-glisin jel kullanılarak SDS-PAGE çalıştırın. hücre serisine bağlı olarak protein yüklü kadar artar. Bazı durumlarda, toplam proteinin 50-100 ug mezenkimal hücre çizgilerinde e-kaderin tespit etmek için gereklidir.
  5. 1x Tris-glisin transfer tampon maddesi içinde 50 V, 2 saat boyunca bir nitroselüloz zar üzerine transfer proteinleri.
  6. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca BSA tabanlı bloke edici tampon içinde 4 ° C'de 1 saat boyunca blok membran.
  7. , Bloke edici tampon 5 ml 1.000 konsantrasyon membrana olarak seyreltme ve yumuşak, oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle sallanan inkübe: 1 ile birincil antikorlar seyreltilir. % 0.05 Tween-20 ile PBS içinde yıkama zar 3 kez.
  8. Kızılötesi floresan bağlanmış İkincil ile oda sıcaklığında 1 st için membranlar inkübe1 de y antikoru: Yukarıda anlatıldığı gibi, blokaj tamponu içinde 20,000 seyrelti.
  9. % 0.05 Tween-20 ile PBS içinde membran, iki kez yıkanır ve PBS içinde daha sonra bir kez.
  10. Standart kızılötesi floresens kullanarak görüntü membran.

7. tutunmadan çoğalması Tahliller

NOT: Ayrıntılı yumuşak agar denemesi protokolü için, 28 bkz.

  1. Sıcak su banyosu içerisinde 42 ° C'ye kadar sıcak steril 2x DMEM ortamı. Bu süre boyunca, ısı 3 dakika süreyle mikrodalgada içinde% 1 agaroz önceden otoklava. gerekli ya da tamamen eriyene kadar bir zamanda, ilave bir 30 s için mikrodalga. 42 ° C su banyosu için agaroz hareket ettirin.
  2. bir steril bir muhafaza içinde 42 ° C'de su içinde bir çanak içinde bir 50 mL konik tüp yerleştirilir ve 1% 1 agaroz ve 2x DMEM ortamı karışımı: 6 gözlü bir plakada göz başına 1.5 mL karışım 1 oranı muhasebe. Her zaman DMEM agaroz pipetleme hatası hesaba / ekstra hazırlayıp kabarcıklarını önlemek için.
  3. Karışımı ekleyinhiçbir kabarcık sağlanması da kenarları oluşturur ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi.
  4. alt tabaka katılaşan edilirken, ortam aspire ve 1 ml PBS ile bir kez yıkanarak 3. adımda Transfekte edilmiş RD hücrelerinden her grup hazırlar. PBS aspire ve% 0.05 tripsin 0.2 mL eklenir ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Bir tek hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere medya ve çiğnemek hücreler 0.8 mL tripsin nötralize. 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın.
  6. Hücre sayımı ve oyuk başına 10,000 hücre için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmi hesaplamak.
  7. tamamen eriyene kadar bir seferde 30 s, ardından 3 dakika süreyle mikrodalgada% 0.6 agaroz ısıtın. 42 ° C su banyosuna agaroz hareket ettirin.
  8. bir steril bir muhafaza içinde 42 ° C'de su içinde bir çanak içinde bir 50 mL konik tüp yerleştirin. 6 gözlü bir plakada göz başına, 1.5 mL hazırlanması için 1: 1 oranında% 0.6 agaroz ve seyreltilmiş hücre süspansiyonu karıştırın. Her zaman pipetleme hatalarını hesaba mix agaroz / ekstra hücre süspansiyonu hazırlamak vekabarcıklarını önlemek için.
    NOT: Burada 42 ° C'de çalışmak önemlidir. sıcaklık çok düşükse karışım kaplama önce katılaşması olacak ve 42 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklar, hücre canlılığını etkileyecektir.
  9. hücreler bir kaç kez ezilip karıştırılarak İyice karıştırın ve kabarcık formu sağlayarak, gözlere hücre karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca katılaşmaya sağlar.
  10. Her bir takviye edilmiş bir ortam, 2 ml de ekleme ve inkübatör plakaları hareket eder.
    1. 3-4 hafta veya çok hücreli koloniler oluştururlar kadar haftada bir kez medya değiştirin. Vakum aspirasyon yoluyla ortamları çıkartırken agar dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun. Alternatif olarak, sıvı ortamın üst tabakayı kaldırmak için bir P1000 kullanın.
    2. 200 uL Nitro Mavi Tetrazolyum klorür çözeltisi eklenerek (1 mg / PBS ml) yumuşak agar plakaları leke ve 37 ° C'de gece boyunca plaka inkübe edilir. görüntüleme için PBS ile ertesi gün medya değiştirin.
    3. ters çevrilmiş bir mikroskop 40X toplam büyütmede Resim kuyular.
    4. koloni alanı ve sayısı için ImageJ analiz yapın. Arsa biyolojik çoğaltır koloni sayısı standart sapma ortalaması ±.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

sarkom hücrelerindeki MET indüksiyonu için Şema

Sarkom hücrelerindeki MET benzeri değişikliklerin indüksiyonu için genel bir zaman çizelgesi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Protokol miR-200 etti (Şekil 1B) transfeksiyonu takiben GRHL2 (Şekil 1A), transduse edilmesiyle başlar. GRHL2 veya miR-200 aile üyeleri tek basma ifade edildiğinde RD hücrelerinin görünü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sarkomları bir mezenkimal kökenli nadir fakat son derece agresif kanserlerdir. bunların mezenkimal kökenli rağmen, sarkom bir alt kümesi, bir daha epitel benzeri bir duruma fenotipik dönüşmesine görünmektedir. Daha fazla epitel benzeri tümörlü hastaların 24 daha az agresif olduğu gibi bu MET benzeri anahtarı, prognostik bir önemi vardır. klinik önemine rağmen, sarkomlarda bu fenotipik geçişlerini sürüş moleküler mekanizmalar çok az çalışma vardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

JAS Duke Kanser Enstitüsü, Duke Üniversitesi Genitoüriner Onkoloji Laboratuvarı ve Ortopedi Duke Üniversitesi Bölümü'nden destek kabul eder. HL Teorik Biyolojik Fizik Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Merkezi tarafından desteklenmiştir (NSF FİZ-1.427.654) ve NSF DMS-1361411, ve Texas Eyaleti Kanser Araştırma bir CPRIT olarak (Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü) Akademik Rice University'de. KEW NIH F32 CA192630 MKJ tarafından desteklenen ve HL Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta ve Donald S. Coffey ile yararlı tartışmalar yararlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated counterLife technologiesAMQAX1000
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
SimpliAmp Thermal CyclerThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR SystemThermo Fisher4453536
PCR microplateCorning321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR KitKAPA BiosystemsKK4602
Starting Block (PBS) Blocking BufferThermo Fisher37538BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LEGenesee Scientific20-102
10x Tris/Glycine/SDS BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0732Running buffer
10x Tris/Glycine BufferBio-Rad Laboratories Inc161-0734Transfer buffer
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocelluloseGE Healthcare Lifesciences10600012
Quick-RNA MiniPrep KitGenesee Scientific11-358
Laemmli Sample Buffer (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini Trans-Blot CellBio-Rad Laboratories Inc1703930
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSLife technologies14190-144
0.05% Trypsin-EDTALife technologies11995-065
DMEMLife technologies11995-065
Lipofectamine RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamine 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicillin StreptomycinLife technologies15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimicThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021serum-free media
anti-Ecadherin antibodyBD Bioscience610182
anti-beta actinSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anti-EpCamAb SerotecMCA18706
anti-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
anti-rabbit AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Halt Protease and Phosphatesse InhibitorThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μm filter for flow
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium SigmaN5514
hexadimethrine bromideSigmaH9268polybrene
3 mL syringeBD Bioscience309657
Sterile syringe filterVWR28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube352063flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher4368814reverse transcription kit
4% paraformaldyhydeSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
bovine serum albuminSigmaA7906

Referanslar

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39(2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241(2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998(2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Shenghan Xu

to:

Shengnan Xu

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 122Mezenkimal epitel ge i lersarkomtransfeksiyonmikroRNA 200 aileGRHL2h cre k lt repitel plastisite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır