הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

Abstract

דג זברה מוטנטים פנוטיפים לעיתים קרובות שהיישום penetrant, מתבטא רק בכמה מוטציות. מעניין פנוטיפים המופיעים באופן בלתי עקבי יכול להיות קשה ללמוד, יכול להוביל משתנה מתערב תוצאות. פרוטוקול המתואר כאן הוא פרדיגמה הרבייה פשוטה כדי להגדיל או להקטין penetrance של מוטציות שלד דג זברה קטלני. כי מוטציות קטלני לא יכול להיות bred סלקטיבי ישירות, האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא בדיקות הוא מועסק. שיטה זו כוללת גם פרוטוקולים עבור דג זברה genotyping Kompetitive אלל PCR ספציפיים (KASP), צביעת דג זברה זחל סחוס ועצם. יישום האסטרטגיה גידול שמתואר כאן יכול להגביר את penetrance של פנוטיפ השלד מעניין הפעלת עוד תוצאות לשחזור ביישומים במורד הזרם. בנוסף, הפחתת את penetrance מוטציה באמצעות אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית יכול לחשוף תהליכים התפתחותיים רוב מכריע דורשות בפונקציה של גן שעבר מוטציה. בעוד השלד במיוחד נחשב כאן, אנו מציעים כי מתודולוגיה זו יהיה שימושי עבור כל השורות דג זברה מוטנטים.

Introduction

דג זברה היא מערכת מודל רב עוצמה להבנת התפתחות השלד. עם דג זברה מוטנטים זנים, ביולוגים יכולה לפענח תפקוד הגן במהלך skeletogenesis. עם זאת, דג זברה מוטנטים פנוטיפים השלד יכול להציג עם משתנה penetrance^1,2,3,4 אשר יכול לעכב ניתוחים גנטיים ובעיות התפתחותיות. מטרת שיטה זו הוא פי שלושה. ראשית, יצירת קווי מוטציה דג זברה אשר מייצרים באופן עקבי פנוטיפים חמור מאפשר מחקרים התפתחותיים במורד הזרם כמו הקלטה זמן לשגות⁵ והשתלת⁶. אלה מיני מחקרים, יכול להיות נכה-ניסיון ללמוד פנוטיפים רק לידי ביטוי באופן בלתי עקבי. שנית, הניחוש הראשון שלי דג זברה זנים יכול להפחית וריאציה הרקע הגנטי, ובכך לקדם הפארמצבטית והעקביות ניסיוני. לדוגמה, ביצוע כל רגע בחיי עיר הכלאה ניתוחים על זן טבעי סלקטיבי אחד יכול להפחית את השתנות מבלבלים ולחזק את המסקנות. שלישית, יצירת זנים קשות ורכות תחשוף את הסידרה פנוטיפי כולה יכולה לנבוע מוטציה מסוימת.

במבט ראשון, ברירה מלאכותית של מוטציות קטלני נראה בלתי אפשרי. איך זן אחד של penetrance כאשר בעלי החיים הם הבקיע עבור הבחירה מתים? למרבה המזל, שיטות ריבוי סלקטיבי לפי בחירה משפחה, במיוחד רומא בדיקות, הדגימו יעילות תוכניות עבור שנים רבות^7,8לגידול בעלי חיים. תוכניות אלה משמשים בעיקר מלאכותית עבור התכונות קיימים רק מין אחד, כמו ייצור החלב בפרות או ייצור הביצים של התרנגולות. הזכרים של המינים הללו לא הבקיע ישירות, אבל הצאצאים שלהם הם הבקיע, לאחר מכן, ערך מוקצית עם ההורים. מגזרים של אסטרטגיה זו, פרוטוקול המובאת כאן כרוכה הבקיע את קבוע, מיטה צאצא מוטציה של זוג דג זברה כי הם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הגן המוטנטי עניין. Penetrance של הפנוטיפ של צאצא מוטציה קטלנית homozygous מוקצה ההורים כאשר מחליטים אנשים אשר יהיה לייצר את הדור הבא של הקו. אנו מוצאים כי שיטה זו היא אמצעי יעיל של הסטה penetrance דג זברה מוטנטים השלד קטלני¹.

בדומה מחקרים אחרים, פרוטוקול ריבוי סלקטיבי זה לוקח תחת שיקול קריטריונים כמו גודל תטולה, ההישרדות של הצאצאים, התפתחות תקינה של העוברים, יחס⁹. עם זאת, גורמים אלו כל נחשבים בהקשר של רקע מוטציה עם המטרה של הסטה של penetrance מוטציה. לכן, פרוטוקול זה מרחיב פרדיגמות מלאכותית הקודם על-ידי המציע שיטה כדי לחזק ניתוחים מוטציה התפתחותית, כמו גם להגביר את הרקע הומוגניות.

פרוטוקול זה דורש genotyping נרחב, לכן חשוב לפתח פרוטוקול אמין, מהיר genotyping מראש. ישנם רבים genotyping הפרוטוקולים הזמינים^10,11, עם זאת אנו מוצאים את KASP genotyping^12,13,14 הוא מהיר יותר, עלות גבוהה יותר יעילה ואמינה יותר מאשר שיטות מבוסס על אנזים הגבלה המחשוף של רצפי מוגבר¹⁰. לכן, אנו כוללים את פרוטוקול KASP בעבודה זו. בנוסף, אנו מתמקדים השלד פנוטיפים מוטציה בפרוטוקול זה, לכלול הליך של אדום כחול/Alizarin Alcian מכתים ששונה בין הפרוטוקולים הקודמים¹⁵.

השיטה המתוארת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור העברת penetrance מוטציה קטלנית כלפי מעלה או כלפי מטה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד פנוטיפים מוטציה השלד, אנו מאמינים שזה יהיה שימושי אסטרטגיה האחזקה של כל הקווים דג זברה מוטנטים. למעשה, התועלת של אסטרטגיה זו רבייה סביר חורג דג זברה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להזיז penetrance במגוון רחב של אורגניזמים. הסטה penetrance קטלני על-ידי בדיקת רומא יכול לעזור לדחוף קדימה את ההתקדמות של כל חוקר גנטיקה התפתחותית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים המתוארים פרוטוקול זה הושלמה בשנת בהתאם ותאימות עם מאוניברסיטת קולורדו, של אוניברסיטת אורגון מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש ועדות (IACUC).

1-הכנת המניה מתחילה שלא נבחרו

1. זיהוי שירות heterozygous של אלל mutant הריבית על ידי פין קליפ ¹¹ genotyping מלאי של מלא-אחים בעלי חיים על ידי שיטת הבחירה, כגון ^{13 , 12 ,} KASP ¹⁴. פרוטוקול זה בוצעה עם המתח דג זברה mef2ca ^b1086.
2. KASP genotyping
   הערה: צבעי יסוד מסוים אלל KASP תוכננו על ידי החברה המספקת את ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים). כדי להשיג 6-carboxyl-X-rhodamine (רוקס) לצבוע הריכוז המתאים עבור המכונה PCR בזמן אמת מסוימת לבקר באתר האינטרנט של החברה. µL
   1. המקום הרקמה זנב דג זברה ב-50 מאגר פירוק (טריס 10 מ מ (pH 8.3), 50 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.5 מ מ ₂, 0.3% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 0.3% Octylphenyl-פוליאתילן גליקול). להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase-K לכל טוב של 96-ובכן PCR צלחת וכן תקציר הצנטרפוגה תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2-5 h ואחריו צעד איון 94 ° C 20 דקות. להכניס למקרר תוצר פירוק לאחר עיכול.
      הערה: פירוק מוצרים יכול לשמש בהצלחה במשך מספר חודשים לאחר ההכנה. כאשר רקמות היה lysed באמצעות 50 מ"מ NaOH, התגובות KASP היו לא מוצלח. ממצאים אלה מראים כי שיטת NaOH ההכנה דנ א גנומי אינה תואמת ל- KASP.
   2. לכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תבנית DNA גנומי באמצעות מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, כך כל התגובה מכילה כ- 20-30 ננוגרם.
      הערה: לכמת דגימות 4 או 5, בריכה אותם ולאחר מכן להכין דילולים עבור כל הדגימות מבוסס על הממוצע. בעת שימוש בפרוטוקול זה על הזנב הבוגרים רקמות, לדילול מטריים לעתים קרובות מספיק. כימות מדויק של ריכוז הדנ א אינה נדרשת.
   µL
   3. הוסף 0.14 של פריימר KASP לערבב, 5 µL של המאסטר KASP לערבב עבור דגימה על קרח לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL לערבב היטב לפני בקצרה צריך שתוציאו לאסוף תוכן בתחתית השפופרת.
      הערה: מיקס מאסטר KASP חום, אור רגיש, שומרים מלאי בקרח ולהימנע אור ישיר-
   4. Pipet 5 µL של פריימר/מאסטר לערבב פתרון לתוך הבארות של צלחת PCR 96-ובכן אופטי מתאים המכונה PCR בזמן אמת בשימוש.
   5. Pipet 5 µL של מדולל (כ 5-7 ng/µL) דגימות די אן איי תבנית לתוך כל טוב ואני האחות עם פיפטה לערבב.
   6. µL 5 להוסיף מים נטולי נוקלאז 3 בארות כדי לשמש כפקדי לא-תבנית (NTC) ולהוסיף 5 µL מסוג מדולל אישר homozygous בר, משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים homozygous מוטציה דנ א בתבנית עבור פקדים חיובי.
   7. הצב של החותם שטיחות מובהק על הבטחת הצלחת הסרט הוא אטום לחלוטין על כל טוב.
   8. Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 600 כדי לאסוף את התוכן בתחתית וכדי להסיר את הבועות מהתערובת.
      הערה: למנוע את הצלחת על קרח, מגן אור עד מוכן להמשיך.
   9. להשתמש בתוכנית אופניים שמוצג בטבלה 1 לביצוע התגובה העיקרית KASP.
   10. להציג את העלילה פיזור וכתוצאה מכך המופק על ידי המחשב ניתוח. תגובת מוצלח יציג 4 קבוצות נפרדות של נקודות על המגרש ( איור 3): שלושה לטעום קיבוצים המתאים גנוטיפ, ולקיבוץ אחד NTCs ליד המקור. הפקדים חיובית צריך לארגן עם הקיבוץ הדגימה המתאימה.
   11. אם התוכנית המחשב אינו מזהה את העלילה קיבוצים כמו המקביל ספציפיים אחרים, נוסף על אופניים ערכות עשוי להיות נחוץ (טבלה 2). חזור על התוכנית נוספים עד המחשב מזהה קיבוצים חזק על ידי גנוטיפ.
   12. לייצא את התוצאות genotyping בקובץ הגיליון האלקטרוני קל לשימוש ללא ניתוח.
3. בית החיות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מזוהה יחד על מערכת המים הראשי.

2. הראשונה בסיבוב של רומא הניקוד

1. של Pairwise לחצות heterozygotes אח
   1. אחרי החיות להתאושש הסרטון סנפיר, להגדיר pairwise intercrosses. השתמש חוצצים כדי להבטיח עוברי סינכרונית ¹⁶.
   2. לאסוף את העוברים ולשמור את זוגות הורים מבודד רביה כלובים.
   3. לפקח מבוגרים מבודד כך אגרסיבי דגים יכול להיות מופרדים או מסופק עם כיסוי (דגים גרוסים רשתות יפה עבודה). הדג צריך להיות מוזן ואת המים שלהם השתנה בעקבות הנחיות IACUC בזמן במים סטטי.
2. העובר לגידול
   1. הבמה ומעלים את העוברים דג זברה רימות תחת תנאים סטנדרטיים ¹⁷ עד.
   2. לאסוף חיות phenotypically פראי-סוג באמצעות פיפטה מזכוכית ביום 5 או 6, כאשר השלפוחית מנופח ב 75% של המצמד. למקם סוגים הפרוע פנוטיפי בחדר הילדים הקלטה של הורים אשר הניב אותם.
      הערה: עם אללים mutant כי הם גן # מושגים בסיסיים קטלני, מה שנכון של מוטציות רבות השלד, מוטציות homozygous להיכשל טופס שלפוחיות שחייה ^{18 , 19}. לכן, סוגי הפרוע פנוטיפי בקלות מבחינים מן אחיהם מוטציה בהתבסס על שלפוחיות שחייה המנופח.
3. מכתים עצם סחוס אדום כחול/Alizarin Alcian
   1. עזים ומתנגד בזחלים, אל תנפח את שלפוחיות שחייה באמצעות 0.17 g/L Tricaine-S העובר בתקשורת. לאסוף חיות לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL עם כוס רחב נשא pipet פסטר. הוספת הזחלים לא יותר מ 100 למחזור.
   2. להסיר העובר מים מהצינור כל ולתקן חיות ב מ 1 ל 2% paraformaldehyde ב 1 x PBS למחזור.
      התראה: כדורגלן מימית דליק, יגרום לגירוי העור והעין רציני. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון כפפות הגנה העין, רחץ את ידיך ביסודיות לאחר שימוש.
   3. אבן 1 h; קיבוע יותר פוגע עצם מכתים. לבדוק את הצינורות באופן קבוע במהלך זה, כל והשלבים נדנדה על מנת להבטיח את הזחלים לא להיות תקוע בצד או התגבש בתחתית השפופרת.
   4. להסיר את מקבע משפופרות באמצעות פיפטה של זכוכית, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול, ו רוק במשך 10 דקות
   Premix אדום Alizarin לכל 1 מ ל Alcian
   5. הכן טרי מכתימה את הפתרון על-ידי הוספת 20 µL של 0.5% (0.04% Alcian כחול/10 מ מ MgCl ₂ / 80% אתנול). הסר את 50% אתנול, להוסיף 1 מ"ל של צביעת לפתרון כל שפופרת, ו רוק בן לילה. הזחלים יכולה להישאר בתיקייה הכתם עד 5 ימים.
   6. להסיר הפתרון כתם של הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 80% אתנול/10 מ מ MgCl ₂ פתרון כל שפופרת. רוק הצינורות במשך לפחות שעה; שטיפה לילה יכול לייצר כתם כחול Alcian ברור יותר.
   7. להסיר את 80% אתנול/10 מ מ MgCl פתרון ₂ מן הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול; אבן 5 דק.
   8. להסיר את הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 25% אתנול וביו -רוק עבור 5 דק.
   9. להסיר הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל טריה 3% H ₂ O _{2 <פתרון הלבנת KOH /sub>/0.5%. להשאיר את כמוסות פתוח ולתת הצינורות לעמוד במעמד מיקרו-שפופרת למשך כ- 10 דקות או עד צבע חום חלש ניתן לראות את החלק העליון של הפתרון.
      הערה: שכבה של טופס בועות על הפתרון. זהירות העיתוי נדרש בשלב זה, כמו מעל הלבנת וכתוצאה מכך כתם זוגי המסכן.}
   10. להסיר הפתרון הלבנה והסרת להוסיף 1 מ"ל של 25% glycerol/0.1% קו; אבן 10 דקות לח' 1
   11. ולהסיר 25% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת, רוק 10 דקות ללון.
   12. להסיר 50% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות ולהוסיף שוב 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת. נדנדה בין לילה יסייע להסיר בועות אוויר זה יכול להצטבר בתוך הזחלים. חנות צבעונית ההכנות השלד ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.
4. פנוטיפ הניקוד
   1. ציון צבעונית צאצא מוטציה. עבור penetrance של פנוטיפ שנבחר. ב. ניקולס et al. ¹ מוטציות זכו עבור כל מופע של עצם חוץ רחמי-
      הערה: מאחר דג זברה ההורים במים סטטי הכתם האדום Alizarin יכול לדעוך עם הזמן, זה חשוב להבקיע שלדים בתוך ימים ספורים של השלמת הכנת השלד.
   2. Penetrance הוא היחס גנוטיפ בעל פנוטיפ. לחשב את אחוז penetrance לפי הנוסחה הבאה:
      % penetrance = (מוטציות עם פנוטיפ) / (מספר כולל של מוטציות) × 100

3. בחירת המשפחה

penetrance גבוהה

1. בחר שתי, שתי משפחות penetrance נמוך עבור הדור הבא. בנוסף penetrance, חשוב לשקול פוריות, מרץ כאשר בוחרים אילו משפחות להפיץ; ראה דיון לקבלת פרטים נוספים על זה.
2. לתת כל זוג הורים מזהה מלאי sub: המשפחה.01,.02, וכו
3. בית זוגות הורים במערכת המרכזית בסקס מעורב מספר ' לוויה ' דגים. לוויה דגים יכולים להיות כל קו דג זברה עם תכונות מזהות קבוע, ברור, כגון מבנה פיגמנטציה או סנפיר שינו.
   הערה: בעוד חוקרים רבים לשמור בהצלחה רק זוגות בתוך מיכל רבייה, תוצאות חיוביות נראים על ידי דיור זוגות עם כמה דגים לוויה. שלב אופציונלי זה מאפשר זוגות של חיות יוחזקו בבתי ספר גדולים יותר, לאחזר בקלות אז הם יכולים להיות שוב ושוב חצו כנדרש. זוגות הורים ניתן חצה שוב ושוב כדי ליצור משפחות גדולות מלא-אחים; לחכות לפחות שבוע לפני חוזר חוצה את אותו זוג הורים-
4. ללקט את המשפחות הזחל מ שלב 2.2.2. אשר לא נבחרו עבור הדור הבא.
5. תווית המיכלים המכילים את הזחלים פראי-סוג אחים ממשפחות שנבחרו עם penetrance של אחיהם מוטציה ולגדל לבגרות כרגיל.
6. הדור הבא יהיו לפחות ארבע משפחות מלא-אחים, 2 עבור שורת כלפי מעלה ו-2 עבור שורת כלפי מטה-
7. כאשר הזחלים מגיעים לבגרות מינית, חזור על פרוטוקול החל השלב הראשון עם הדור החדש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה היא טכניקה גידול לטווח ארוך שימושי עבור הבנה דג זברה מוטנטים השלד (איור 1). ברירה מלאכותית על ידי רומא בדיקות אמור להניב משמרת ב- penetrance הכללית כלפי מטה והן כלפי מעלה תוך מספר דורות (איור 2). בעבודה הקודמת, שני סיבובים של ברירה מלאכ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ברירה מלאכותית חשפה הדקויות של הפונקציה ג'ין

הסטה פנוטיפים מוטציה כדי להיות יותר או פחות חמור על ידי ברירה מלאכותית היא דרך פשוטה לקבל תובנות חדשות הגן פונקציה. כאשר לעומת בשיטות סטנדרטיות של גידול שלא נבחרו, פרוטוקול המובאת כאן יכולות להניב הבנה יותר מלאה של פנוט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde, pelleted, solid	Ted Pella Co.	18501	Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid	Acros Organics	223210010
10x PBS, Aqueous	Fisher	BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid	Anatech Ltd.	867	Must be from Anatech
Alizarin Red, solid	Sigma	A5533-25G
Glycerol, liquid	Fisher	BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid	Fisher	BP263500
Potassium hydroxide,  solid	Fisher	P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine	Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	4346906
Microseal 'B' seal	BioRad	MSB1001
KASP Master Mix, High ROX	LGC	KBS-1016-022	https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix	LGC	KBS-2100-100
Tris HCl, solid	Fisher	BP153 500
potassium chloride, solid	Fisher	BP366 500
Tween-20, liquid	Fisher	BP337 100
Nonidet P40	ThermoFisher	28324
Tricaine-S	Western Chemicals
Proteinase K	Fisher	BP1700 100
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets	Fisher	13-678-30
Nanodrop	ThermoFisher		for DNA quantitation