Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

Résumé

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Résumé

Poisson zèbre phénotypes mutants sont souvent incomplètement par ressuage, se manifestant uniquement chez certains mutants. Des phénotypes intéressants qui apparaissent de manière irrégulière peuvent être difficiles à étudier et peuvent mener à la confusion des résultats. Le protocole décrit ici est un paradigme de reproduction simple pour augmenter ou diminuer la pénétrance chez les mutants squelettique létale de poisson-zèbre. Parce que des mutants létaux ne peuvent être sélectivement directement, la stratégie de reproduction sélective classique des tests de descendance est employée. Cette méthode comprend également les protocoles pour Kompetitive allèle spécifique PCR (KASP) génotypage poisson zèbre et coloration larves de poisson zèbre cartilage et OS. Application de la stratégie d’élevage décrite ici peut augmenter la pénétrance d’un phénotype squelettique intéressant permettant des résultats plus reproductibles dans les applications en aval. En outre, diminuant la pénétrance mutante grâce à cette stratégie de reproduction sélective peut révéler les processus de développement qui nécessitent surtout la fonction du gène muté. Le squelette est considérée comme plus précisément ici, nous proposons que cette méthodologie sera utile pour toutes les lignées mutantes de poisson-zèbre.

Introduction

Le poisson-zèbre est un système puissant modèle pour comprendre le développement du squelette. Avec des souches mutantes de poisson-zèbre, les biologistes peuvent déchiffrer la fonction du gène au cours de la formation squelettique. Cependant, les phénotypes mutants squelette de poisson-zèbre peuvent présenter avec une pénétrance variable^1,2,3,4 qui peut gêner les analyses génétiques et de développement. Le but de cette méthode est triple. Tout d’abord, générant zebrafish lignées mutantes qui produisent régulièrement des phénotypes sévères permet des études sur le développement en aval comme enregistrement Time-lapse⁵ et transplantation⁶. Ces sortes d’études peuvent être paralysés en essayant d’étudier les phénotypes qui seulement manifestent de façon incohérente. Deuxièmement, consanguinité zebrafish souches peut diminuer la variation génétique, favorisant ainsi la reproductibilité et la cohérence expérimentale. Par exemple, les analyses d’hybridation sur une souche consanguine sélectivement tous in situ peuvent réduire la variabilité confondant et renforcer les conclusions. En troisième lieu, générant des souches sévères et douces vous révélera toute la série phénotypique qui peut résulter d’une mutation particulière.

À première vue, un élevage sélectif de mutants létaux semble impossible. Comment une race pour la pénétrance lorsque les animaux sont marqués pour la sélection sont morts ? Heureusement, méthodes d’élevage sélectif de sélection familiale, spécifiquement les descendants essais, ont démontré l’efficacité dans l’élevage des programmes pour les nombreuses années^7,8. Ces programmes sont principalement utilisés pour la reproduction sélective pour les caractères qui ne sont présentes que dans un sexe, comme la production de lait chez la vache ou la production d’oeufs chez les poules. Les mâles de ces espèces ne peuvent être marqués directement, mais leur progéniture est notés et une valeur est alors attribuée aux parents. Empruntant cette stratégie, le protocole présenté ici consiste à marquer la progéniture mutante fixe et teintée d’une paire de poisson-zèbre qui sont hétérozygotes pour un gène mutant d’intérêt. La pénétrance d’un phénotype dans la descendance mutante mortelle homozygote est attribuée aux parents lorsqu’ils décident quels individus vont produire la prochaine génération de la ligne. Nous constatons que cette méthode est un moyen efficace de déplacer une pénétrance in zebrafish mutants squelettique létale¹.

Semblable à d’autres études, ce protocole de reproduction sélective prend en vertu de critères d’examen comme couvée, la survie de la progéniture, développement normal des embryons et sex-ratio⁹. Toutefois, ces facteurs sont tous considérés dans le contexte d’un fond de mutants dans le but de déplacer la pénétrance mutante. Par conséquent, ce protocole étend précédent paradigmes de reproduction sélective en proposant une méthode pour renforcer les analyses mutants du développement ainsi que pour accroître l’homogénéité de l’arrière-plan.

Ce protocole requiert une vaste génotypage, aussi est-il important de développer un protocole fiable et rapide de génotypage à l’avance. Il y a nombreux génotypage protocoles disponibles^10,11, cependant, nous trouvons le KASP génotypage^12,13,14 est plus rapide, plus efficace et plus fiable que les méthodes de coût issu des enzymes de restriction le clivage des séquences amplifiées¹⁰. Par conséquent, nous incluons un protocole KASP dans ce travail. En outre, nous concentrer sur les phénotypes mutants squelettiques dans le présent protocole et incluent une procédure pour une coloration modifiée de précédents protocoles¹⁵Alcian bleu/alizarine rouge.

La méthode décrite ici est une stratégie simple pour déplacer une pénétrance mutante mortelle vers le haut ou vers le bas. Alors que ce protocole met l’accent sur les phénotypes mutants squelettiques, nous pensons que ce sera une stratégie utile pour l’élevage de poisson-zèbre mutant toutes les lignes. En fait, l’utilité de cette stratégie de reproduction susceptible s’étend au-delà de poisson-zèbre. Nous prédisons que ce protocole peut être modifié pour décaler la pénétrance dans un large éventail d’organismes. Décalant pénétrance létale de tests de descendance peut aider à faire avancer l’état d’avancement d’un généticien du développement.

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Protocole

toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été achevés en conformité et le respect de l’Université du Colorado et de l’Université de l’Oregon animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC).

1. préparer le Stock de départ non sélectionnés

1. Identify hétérozygotes porteurs de l’allèle mutant d’intérêt par la nageoire clip ¹¹ et génotypage un stock d’animaux plein-frère par une méthode de choix, tels que KASP ^{12 , 13 , 14}. Ce protocole a été réalisé avec la souche de mef2ca ^b1086 de poisson-zèbre.
2. Génotypage KASP
   Remarque : Des amorces spécifiques pour KASP allèle sont conçus par la société qui fournit les réactifs (voir Table des matières). Pour obtenir la concentration de colorant 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) appropriée pour la machine PCR en temps réel spécifique visitez le site Web de l’entreprise.
   1. Place le tissu de queue de poisson-zèbre dans 50 µL de tampon de lyse (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl ₂ surfactant non ionique de 0,3 %, 0,3 % octylphényle-polyéthylène glycol). Ajouter 10 µL de 10 mg/mL protéinase-K / puits d’une plaque PCR 96 puits et digérer dans un thermocycleur à 55 ° C pendant 2 à 5 h, suivie d’une étape d’inactivation de 94 ° C 20 min. Réfrigérer le produit lyse après digestion.
      Remarque : produits de lyse peuvent être utilisés avec succès pendant plusieurs mois après sa préparation. Lorsque le tissu a été lysé en utilisant 50 mM NaOH, les réactions de KASP ont échoué. Ces résultats suggèrent que la méthode de NaOH de préparation d’ADN génomique n’est pas compatible avec KASP.
   2. Quantifier l’ADN génomique à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer la matrice d’ADN génomique à l’aide de l’eau de qualité biologie moléculaire afin que chaque réaction contient environ 20-30 ng.
      NOTE : Quantifier les 4 ou 5 échantillons, leur poule, puis préparer des dilutions pour tous les échantillons en que se basés sur la moyenne. Lorsque vous utilisez ce protocole pour tissu adulte queue, une dilution au 1/100 est souvent suffisante. La quantification précise de la concentration d’ADN n’est pas nécessaire.
   3. Ajouter 0,14 µL de l’apprêt KASP mélanger et 5 µL du maître KASP mélanger par exemple sur la glace dans un tube de microtubes de 1,5 mL et mélanger bien avant la centrifugation brièvement pour collecter le contenu au fond du tube.
      Remarque : Mélange maître KASP est chaleur et lumière sensible, garder le stock sur la glace et éviter la lumière directe.
   4. Pipette 5 µL d’apprêt/master mélanger la solution dans les puits d’une plaque PCR 96 puits optique pour la machine PCR en temps réel utilisée.
   5. Pipette 5 µL de dilué (environ 5-7 ng/µL) des échantillons d’ADN modèle dans chaque bien et aspirer avec une pipette pour mélanger.
   6. Ajouter 5 µL d’eau exempte de nucléase à 3 puits servent de commandes non-modèle (NTC) et ajouter 5 µL de dilué hétérozygote et homozygote matrice d’ADN mutant pour contrôles positifs type confirmé homozygote sauvage,.
   7. Placer un joint de film transparent sur la plaque en veillant à ce que le film est entièrement étanche sur chaque puits.
   8. Centrifuger brièvement la plaque à 600 g pour collecter le contenu en bas et retirer le mélange de bulles.
      NOTE : Garder la plaque sur la glace et le bouclier de lumière jusqu’au moment de procéder.
   9. Utiliser le programme cyclisme indiqué au tableau 1 pour effectuer la réaction principale de KASP.
   10. Découvre le diagramme qui en résulte produit par l’ordinateur d’analyse. Une réaction fructueuse montrera 4 groupes distincts de points sur le terrain ( Figure 3) : trois exemples de groupements correspondant au génotype et un regroupement des NTCs près de l’origine. Les témoins positifs doivent séparer avec le groupement d’échantillon approprié.
   11. Si le logiciel ne reconnaît pas l’intrigue groupements comme correspondant à des génotypes spécifiques, cyclisme jeux supplémentaires peuvent être nécessaires (tableau 2). Répéter le programme supplémentaire jusqu'à ce que l’ordinateur reconnaît les groupements serrés de génotype.
   12. Les résultats de génotypage d’exportation vers un fichier de feuille de calcul pour l’utilisation et l’analyse plus facile.
3. Abritent les animaux hétérozygotes identifiés ensemble sur le circuit d’eau principal.

2. la première ronde de descendance Scoring

1. Croix Pairwise hétérozygotes frère
   1. après les animaux récupérer dans le clip de nageoire, mis en place des croisements par paires. Permet de s’assurer que les embryons sont synchrones ¹⁶ diviseurs.
   2. Recueillir les embryons et garder les paires de parents isolés dans des cages d’élevage.
   3. Suivre des ailés isolés afin que les poissons agressifs peuvent être séparés ou fournis avec housse (émincé de poisson filets travail joliment). Les poissons doivent être nourris et leur eau changée suivant directives IACUC en statique de l’eau.
2. Embryon élevage
   1. stade et soulever les embryons de poisson-zèbre à larves sous conditions standard ¹⁷.
   2. Recueillir les animaux de phénotype sauvage à l’aide d’une pipette de verre 5 ou 6 jours lorsque la vessie est gonflée à 75 % de l’embrayage. Placer les types sauvages phénotypiques dans la pépinière d’enregistrement des parents ont donné leur.
      Remarque : Avec des allèles mutants qui sont récessive létale, ce qui est vrai de nombreux mutants squelettiques, mutants homozygotes ne forme la vessie natatoire ^{18 , 19}. Par conséquent, phénotypique des types sauvages peut facilement discerner leurs frères et sœurs mutant issu des vessies gonflées.
3. Alcian bleu/alizarine rouge du cartilage et des os taches
   1. anesthésier les larves qui ne pas gonflent leur vessie natatoire à l’aide de 0,17 g/L Tricaine-S dans les médias de l’embryon. Recueillir des animaux dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL avec un verre large-alésage pipette Pasteur. Ajouter pas plus de 100 larves par tube.
   2. Retirer l’eau de l’embryon dans chaque tube et Difficulté animaux dans 1 mL de paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS 1 x par tube.
      Mise en garde : PFA aqueux est combustible et provoquera une grave irritation de peau et des yeux. Porter des équipements de protection individuelle appropriés tels que des gants et des lunettes de protection et laver soigneusement les mains après utilisation.
   3. Rock pendant 1 h ; fixation plue atteinte osseuse coloration. Vérifier les tubes régulièrement au cours de cette, et toutes les étapes subséquentes de bascule pour n’assurer aucune larve ils sont collés sur le côté ou groupé en masse compacte dans le fond du tube.
   4. Retirer le fixateur de tubes à l’aide d’une pipette en verre, ajouter 1 mL d’éthanol à 50 % et le rock pendant 10 min.
   5. Préparation douce solution de coloration en ajoutant 20 µL de 0,5 % alizarine rouge par 1 mL de Alcian prémélanger (0,04 % bleu Alcian/10 mM MgCl ₂ / 80 % d’éthanol). Enlever 50 % d’éthanol, ajouter 1 mL de solution à chaque tube et le rocher de coloration du jour au lendemain. Les larves peuvent rester dans la tache jusqu'à 5 jours.
   6. Enlever la solution de coloration des tubes et ajouter 1 mL de 80 % d’éthanol/10 mM MgCl ₂ solution dans chaque tube. Rock les tubes pendant au moins 1 h ; rinçage pendant la nuit peut produire une tache plus claire de bleu Alcian.
   7. Déposer les 80 % éthanol/10 mM MgCl ₂ solution des tubes et ajouter 1 mL d’éthanol à 50 % ; rock pendant 5 min.
   8. Supprimer la solution d’éthanol de 50 % des tubes et ajouter 1 mL d’éthanol à 25 % et rock pendant 5 min.
   9. Retirer la solution d’éthanol à 50 % des tubes et ajouter 1 mL fraîchement préparé 3 % H ₂ O _{2 /0.5%. Laisser les caps ouverte et laisser les tubes sont dans un micro-portoir pendant environ 10 min ou jusqu'à ce qu’une légère coloration brune peut être vu dans la partie supérieure de la solution.
      Remarque : Une couche de forme de bulles sur le dessus de la solution. Attention calendrier est nécessaire à cette étape, comme plus de blanchiment se traduira par une pauvre tache double.}
   10. Enlever la solution de blanchiment et ajouter 1 mL de glycerol/0.1% 25 % KOH ; rock pendant 10 min à 1 h.
   11. Retirer 25 % solution de KOH glycerol/0.1% des tubes, ajouter 1 mL de solution de KOH glycerol/0.1% 50 % dans chaque tube, rock pendant 10 min pour la nuit.
   12. Retirer la solution de KOH glycerol/0.1% 50 % des tubes et ajouter encore 50 % glycerol/0.1% solution de KOH à chaque tube. Bascule du jour au lendemain permettra d’éliminer les bulles d’air qui peuvent s’accumuler à l’intérieur des larves. Magasin teinté squelettiques préparations à 4 ° C lorsque non utilisé.
4. Notation de phénotype
   1. Score teinté rejeton mutant pour la pénétrance du phénotype sélectionné. Dans Nichols et al. ¹ mutants ont été évalués pour n’importe quelle occurrence des os ectopique.
      Remarque : Parce que les parents de poisson-zèbre sont en statique de l’eau et la tache rouge d’alizarine peut s’estomper avec le temps, il est important de marquer des squelettes dans les prochains jours de l’achèvement de la préparation squelettique.
   2. Pénétrance est la proportion d’un génotype qui possède un phénotype. Calculer la pénétrance pourcentage selon la formule suivante :
      % pénétrance = (mutants avec phénotype) / (nombre total de mutants) × 100

3. Sélection famille

1. choisir deux pénétrance élevée et deux familles de pénétrance faible pour la prochaine génération. En plus de la pénétrance, il est important de considérer la fécondité et la vigueur en choisissant quelles familles se propager ; Voir la Discussion pour plus de détails sur cette.
2. Donner chaque paire parentale un identificateur stock sup : famille.01,.02, etc.
3. Maison des couples parents sur le système principal avec plusieurs sexe mixte ' compagnon ' poissons. Poisson de compagnon peut être n’importe quelle ligne de poisson-zèbre permanente, évidente des traits distinctifs, tels que structure altérée de pigmentation ou de la fin.
   Remarque : Alors que de nombreux chercheurs maintenir avec succès uniquement couples reproducteurs dans un réservoir, des résultats favorables sont vus par paires avec plusieurs poissons de compagnon de logement. Cette étape facultative permet aux couples d’animaux à être tenu dans les grandes écoles et facilement Récupérée alors qu’ils peuvent être croisés à plusieurs reprises si nécessaire. Les couples parents peuvent être croisés à plusieurs reprises pour générer des familles nombreuses de plein-frère ; attendre au moins une semaine avant la répétition traversant la même paire parentale.
4. Abattre les familles larvaires de l’étape 2.2.2. qui n’étaient pas sélectionné pour la prochaine génération.
5. Étiqueter les réservoirs contenant les larves sauvage enfant de mêmes parents de familles sélectionnées avec la pénétrance de leurs frères et soeurs mutantes et sensibiliser à l’âge adulte, comme d’habitude.
6. La prochaine génération aura au moins quatre familles de plein-sibling, deux pour la ligne vers le haut et deux pour la ligne descendante.
7. Quand les larves atteignent la maturité sexuelle, répétez le protocole à partir de la première étape avec la nouvelle génération.

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Résultats

Ce protocole est une technique d’élevage à long terme utile pour les mutants de squelette de poisson-zèbre de compréhension (Figure 1). Élevage sélectif en testant la progéniture devrait produire un changement dans une pénétrance globale aussi bien vers le bas et vers le hausse dans quelques générations (Figure 2). Dans nos travaux précédents, deux cycles de reproduction sélective a roulé la pénétrance moyenne ...

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Discussion

Élevage sélectif dévoile les subtilités de la fonction du gène

Déplacement des phénotypes mutants pour être plus ou moins graves par reproduction sélective est un moyen simple pour acquérir de nouvelles connaissances en fonction des gènes. En comparaison avec des méthodes normalisées de reproduction non sélectionnée, le protocole présenté ici peut donner une compréhension plus complète des phénotypes mutants. Plus précisément, en générant des souches qu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde, pelleted, solid	Ted Pella Co.	18501	Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid	Acros Organics	223210010
10x PBS, Aqueous	Fisher	BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid	Anatech Ltd.	867	Must be from Anatech
Alizarin Red, solid	Sigma	A5533-25G
Glycerol, liquid	Fisher	BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid	Fisher	BP263500
Potassium hydroxide,  solid	Fisher	P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine	Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	4346906
Microseal 'B' seal	BioRad	MSB1001
KASP Master Mix, High ROX	LGC	KBS-1016-022	https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix	LGC	KBS-2100-100
Tris HCl, solid	Fisher	BP153 500
potassium chloride, solid	Fisher	BP366 500
Tween-20, liquid	Fisher	BP337 100
Nonidet P40	ThermoFisher	28324
Tricaine-S	Western Chemicals
Proteinase K	Fisher	BP1700 100
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets	Fisher	13-678-30
Nanodrop	ThermoFisher		for DNA quantitation