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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Resumo

Zebrafish fenótipos mutantes são frequentemente incompleta penetrante, manifestando-se apenas em alguns mutantes. Fenótipos interessantes que aparecem de forma inconsistente podem ser difícil de estudar e podem levar a confundir os resultados. O protocolo descrito aqui é um paradigma de reprodução simples para aumentar e diminuir penetrância em mutantes esquelético zebrafish letal. Porque os mutantes letais não podem ser seletivamente criados diretamente, a estratégia de reprodução seletiva clássico de teste de progênie é empregada. Esse método também inclui protocolos para Kompetitive alelo específico do PCR (KASP) genotipagem zebrafish e coloração zebrafish larval de cartilagem e osso. Aplicar a estratégia de criação descrita aqui pode aumentar a penetrância de um fenótipo esquelético interessante, permitindo que mais resultados reprodutíveis em aplicações a jusante. Além disso, diminuindo a penetrância mutante através desta estratégia de reprodução seletiva pode revelar os processos de desenvolvimento que requerem mais crucialmente a função do gene mutado. Enquanto o esqueleto é especificamente considerado aqui, propomos que esta metodologia será útil para todas as linhas mutantes zebrafish.

Introdução

O peixe-zebra é um sistema poderoso modelo para a compreensão do desenvolvimento esquelético. Com cepas mutantes zebrafish, biólogos podem decifrar a função dos genes durante a skeletogenesis. No entanto, zebrafish esquelético fenótipos mutantes podem apresentar com penetrância variável1,2,3,,4 que pode dificultar as análises genéticas e do desenvolvimento. A finalidade desse método é triplo. Primeiro, gerar zebrafish linhas mutantes que consistentemente produzem fenótipos graves permite a jusante do desenvolvimento estudos como lapso de tempo de gravação transplantação de5 e6. Esses tipos de estudos podem ficar inválidos ao tentar estudar fenótipos que apenas manifestam inconsistentemente. Em segundo lugar, consanguinidade zebrafish cepas pode diminuir a variação do fundo genético, promovendo assim a reprodutibilidade e consistência experimental. Por exemplo, realizando todos os em situ podem reduzir variabilidade confundimento e reforçar conclusões análises de hibridação em uma estirpe seletivamente pura. Em terceiro lugar, gerar tensões graves e suaves irá revelar toda a série fenotípica que pode resultar de uma mutação específica.

À primeira vista, a reprodução seletiva de mutantes letais parece impossível. Como pode uma raça para penetrância quando os animais que são marcados para seleção estão mortos? Felizmente, métodos de reprodução seletiva por seleção de família, especificamente a descendência testes, demonstraram eficácia na pecuária programas para muitos anos7,8. Estes programas são usados principalmente para reprodução seletiva para os traços que só estão presentes em um sexo, como a produção de leite em vacas ou produção de ovos em galinhas. Os machos destas espécies não podem ser marcados diretamente, mas seus descendentes são marcados e um valor é atribuído aos pais. Endividamento a partir desta estratégia, o protocolo aqui apresentado envolve marcando o fixo e manchados mutante prole de um par de zebrafish que são heterozigotos para um gene mutante de interesse. A penetrância de um fenótipo na prole mutantes letais homozigotos é atribuída aos pais quando decidir quais indivíduos irão produzir a próxima geração da linha. Achamos que este método é um meio eficaz de deslocamento penetrância em zebrafish mutantes esquelética letal1.

Similar a outros estudos, este protocolo de reprodução seletiva leva sob critérios de consideração como tamanho da embreagem, sobrevivência da prole, normal desenvolvimento de embriões e uma relação de sexo9. No entanto, esses fatores são considerados no contexto de um fundo mutante com o objetivo de desviar a penetrância mutante. Portanto, este protocolo amplia paradigmas anteriores de reprodução seletiva, oferecendo um método para fortalecer as análises mutantes do desenvolvimento, bem como aumentar a homogeneidade de fundo.

Este protocolo requer genotipagem extensa, por isso é importante desenvolver um protocolo confiável, rápida genotipagem com antecedência. Existem muitos genotipagem protocolos disponíveis10,11, no entanto, encontramos o KASP genotipagem12,13,14 é mais rápido, de custo mais eficiente e mais confiável do que os métodos baseada na clivagem de enzima de restrição de sequências amplificadas10. Portanto, nós incluímos um protocolo KASP neste trabalho. Além disso, podemos focar esqueléticos fenótipos mutantes neste protocolo e incluir um procedimento para Alcian Blue/alizarina Red coloração modificada de anteriores protocolos15.

O método descrito aqui é uma estratégia simples para comutação penetrância mutante letal para cima ou para baixo. Enquanto este protocolo incide sobre fenótipos mutantes esqueléticos, acreditamos que vai ser uma estratégia útil para a criação de todas as linhas de zebrafish mutante. De fato, a utilidade desta estratégia de reprodução provável estende-se além do zebrafish. Prevemos que este protocolo pode ser modificado para deslocar penetrância em uma ampla gama de organismos. Penetrância letal de movimento através do teste de progênie pode ajudar a impulsionar o progresso de qualquer geneticista do desenvolvimento.

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Protocolo

todos os experimentos descritos neste protocolo foram concluídos em conformidade e cumprimento da Universidade do Colorado e a Universidade de Oregon institucional Animal cuidado e uso de comitês (IACUC).

1. preparando o estoque desmarcado começando

  1. identificar heterozigotos portadores do alelo mutante de interesse pela barbatana clip- 11 e um estoque de animais completo-irmão de genotipagem por um método de escolha, tais como KASP 12 , 13 , 14. Este protocolo foi realizado com a estirpe de mef2ca b1086 de zebrafish.
  2. Genotipagem KASP
    Nota: Primers específicos de alelo para KASP são projetados pela empresa que fornece os reagentes (ver Tabela de materiais). Para obter a concentração adequada 6-carboxila-X-rodamina (ROX) corante para a máquina específica de PCR em tempo real visite o site da empresa.
    1. Lugar o tecido de cauda de peixe-zebra em 50 µ l de tampão de lise (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% tensoativo não-iônico, 0,3% octilfenil-polietileno glicol). Adicione 10 µ l de 10 mg/mL Proteinase K por alvéolo de um prato PCR de 96 poços e resumida em um termociclador a 55 ° C, durante 2-5 h, seguido por uma etapa de inactivação de 94 ° C 20 min. Refrigerar o produto de lise após digestão.
      Nota: produtos de Lise podem ser usados com sucesso por vários meses após o preparo. Quando o tecido era lysed usando 50mm NaOH, as reações de KASP foram infrutíferas. Estes achados sugerem que o método de NaOH de preparação de DNA genômico não é compatível com KASP.
    2. Quantificar o DNA genômico, usando um espectrofotômetro. Diluir o modelo de DNA genômico usando água de grau de biologia molecular, de modo que cada reação contém aproximadamente 20-30 ng.
      Nota: Quantificar 4 ou 5 amostras, piscina-los e, em seguida, preparar diluições para todas as amostras com base na média. Quando usando esse protocolo para tecido adulto cauda, uma diluição de 1: 100, muitas vezes é suficiente. A quantificação precisa da concentração de DNA não é necessária.
    3. Add 0,14 µ l do primer KASP misturar e 5 µ l do mestre KASP misturar por amostra no gelo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e misture bem antes de centrifugação brevemente para coletar conteúdo na parte inferior do tubo.
      Nota: KASP mestre mix é calor e luz sensível, manter estoque no gelo e evitar a luz direta.
    4. Pipeta 5 µ l de primer/mestre misturar a solução para os poços de uma placa de 96 poços óptico PCR apropriado para a máquina PCR em tempo real sendo usada.
    5. Pipeta 5 µ l de diluído (aproximadamente 5-7 ng/μL) amostras de DNA modelo em cada bem e Aspire com uma pipeta para misturar.
    6. Adicionar 5 µ l de água livre de nuclease 3 poços para servir como controles não-modelo (NTC) e adicionar 5 µ l de diluídos confirmado homozigoto tipo selvagem, heterozigoto e homozigoto modelo de DNA mutante para controlos positivos.
    7. Coloque um selo do filme opticamente clara sobre a placa, garantindo que o filme é totalmente fechado sobre cada bem.
    8. Brevemente centrifugar a placa a 600 x g para coletar o conteúdo na parte inferior e remover bolhas de mistura.
      Nota: Manter a placa no gelo e escudo de luz até que esteja pronto para prosseguir.
    9. Usar o programa ciclismo mostrado na tabela 1 para realizar a principal reação KASP.
    10. Ver os o gráfico de dispersão resultante produzido por computador a análise. Uma reação de sucesso mostrará 4 grupos distintos de pontos sobre a trama ( Figura 3): três agrupamentos correspondente ao genótipo e um agrupamento dos NTCs perto da origem da amostra. Os controles positivos devem segregar com o agrupamento de amostras adequadas.
    11. Se o programa de computador não reconhece o enredo agrupamentos como correspondente de genótipos específicos, adicionais de ciclismo de moda podem ser necessário (tabela 2). Repita o programa adicional até que o computador reconhece e agrupamentos apertados pelo genótipo.
    12. Exportar os resultados da genotipagem para um arquivo de planilha para facilitar a utilização e a análise.
  3. Os animais heterozigotos identificados juntos no sistema de água principal da casa.

2. a primeira rodada de progênie marcando

  1. Cruz Pairwise heterozigotos irmão
    1. depois que os animais recuperar-se do clip de barbatana, configurar inter-cruzamentos emparelhados. Usar divisores para garantir que os embriões são síncronos 16.
    2. Recolher os embriões e manter os pares parentais isolados em gaiolas de criação.
    3. Monitorar adultos isolados para que peixes agressivos podem ser separados ou fornecidos com tampa (de peixe desfiado redes de trabalho muito bem). Peixes devem ser alimentados e sua água mudou seguindo orientações IACUC enquanto na água estática.
  2. Embrião criação
    1. palco e elevar os embriões de zebrafish para larvas sob condições padrão 17.
    2. Recolher animais fenotipicamente selvagem-tipo, usando uma pipeta de vidro no dia 5 ou 6 quando a bexiga natatória é inflada em 75% da embreagem. Coloque fenotípicos tipos selvagens no berçário gravação de que os pais rendeu-lhes.
      Nota: Com alelos mutantes que são recessiva letal, o que é verdadeira de muitos mutantes esqueléticos, homozigotos mutantes não conseguem forma natatórias 18 , 19. Portanto, fenotípicos tipos selvagens podem ser discernidos facilmente de seus irmãos mutantes baseados no inflado natatórias.
  3. Alcian Blue/alizarina Red cartilagem e osso coloração
    1. anestesiar as larvas que não inflar seus natatórias usando 0,17 g/L tricaina-S em embriões. Colete animais em tubos de 1,5 mL microcentrifuga com um vidro largo-furo pipeta Pasteur. Adicionar a não mais de 100 larvas por tubo.
    2. Remover água de embrião de cada tubo e corrigir animais em 1 mL de 2% paraformaldeído em PBS 1x por tubo.
      Atenção: PFA aquosa é combustível e irá causar irritação cutânea e ocular grave. Usar equipamento de protecção adequado como luvas e óculos de proteção e lave bem as mãos após o uso.
    3. Rock para 1h; fixação mais prejudica a coloração de osso. Verificar os tubos regularmente durante esta e todas as etapas subsequentes de balanço para não garantir que nenhuma larva tem tornar-se preso ao lado ou aglutinadas no fundo do tubo.
    4. Retire o fixador de tubos utilizando uma pipeta de vidro, adicione 1 mL de etanol a 50% e o rock de 10 min.
    5. Preparar fresco coloração solução adicionando 20 µ l de 0,5% de vermelho de alizarina por 1 mL de Alcian premix (0,04% Alcian Blue/10 mM MgCl 2 / 80% de etanol). Retire 50% de etanol, adicionar 1 mL de solução para cada tubo e pedra de coloração durante a noite. Larvas podem permanecer na mancha por até 5 dias.
    6. Remover a mancha solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol/10 mM MgCl 2 solução de 80% a cada tubo. Agitar os tubos pelo menos 1 h; enxaguar a noite pode produzir uma mancha mais clara de Alcian Blue.
    7. Remover o 80% etanol/10 mM MgCl 2 solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 50%; rock para 5 min.
    8. Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 25% e rock 5 min.
    9. Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL recém-preparada 3% H 2 O 2 /0.5% solução de branqueamento KOH. Deixar as tampas abertas e deixe os tubos fique um rack de microtubo por cerca de 10 min ou até uma coloração marrom fraca pode ser vista na parte superior da solução.
      Nota: Uma camada de forma bolhas no topo da solução. Cuidado de sincronismo é necessário neste passo, tão mais branqueamento resultará em uma mancha de dupla pobre.
    10. Remover a solução de branqueamento e adicionar 1 mL de glycerol/0.1% 25% KOH; rock para 10 min a 1 h.
    11. Remover a solução KOH glycerol/0.1% 25% dos tubos, adicionar 1 mL de solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo, rocha por 10 minutos durante a noite.
    12. Remover a solução KOH glycerol/0.1% de 50% dos tubos e novamente adicionar solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo. Balançando a noite irá ajudar a remover as bolhas de ar que podem se acumular dentro de larvas. Loja manchado esqueléticas preparações a 4 ° C, quando não está sendo usado.
  4. Fenótipo marcando
    1. Pontuação manchado mutante prole para a penetrância do fenótipo selecionado. Em Nichols et al 1 mutantes foram marcados por qualquer ocorrência de osso ectópico.
      Nota: Como os pais de zebrafish estão na água estática e a mancha de vermelho de alizarina pode desaparecer com o tempo, é importante marcar esqueletos dentro de alguns dias de completar a preparação esquelética.
    2. Penetrância é a proporção de um genótipo que tem um fenótipo. Calcular a porcentagem penetrância pela seguinte fórmula:
      % penetrância = (mutantes com fenótipo) / (número total de mutantes) × 100

3. Seleção família

  1. escolher dois alta penetrância e duas famílias de baixa penetrância para a próxima geração. Além de penetrância, é importante considerar a fecundidade e vigor ao escolher quais famílias para propagar; consulte a discussão para mais detalhes sobre isso.
  2. Dá um identificador de estoque subcada par parental: família.01,.02, etc
  3. Casa parentais pares no sistema principal com vários sexo misto ' companheiro ' peixes. Peixe do companheiro pode ser qualquer linha de zebrafish com características distintivas permanentes, óbvias, tais como a estrutura alterada de pigmentação ou fin.
    Nota: Enquanto muitos pesquisadores com sucesso mantém apenas casais em um tanque, resultados favoráveis são vistos pela carcaça de pares com vários peixes de companheiro. Nesta etapa opcional permite que casais de animais a ser mantido nas escolas maiores e facilmente recuperada e podem ser repetidamente atravessaram conforme necessário. Pares dos pais podem ser atravessados repetidamente para gerar grandes famílias cheio-irmão; Espere pelo menos uma semana antes de repetir cruzando o mesmo par parental.
  4. Abater as famílias larvas da etapa 2.2.2. que não foram selecionados para a próxima geração.
  5. Rotular os tanques contendo as larvas do selvagem-tipo irmão de famílias selecionadas com a penetrância de seus irmãos mutantes e elevar-se até à idade adulta como normal.
  6. a próxima geração terá pelo menos quatro famílias cheio-irmãos, dois para a linha ascendente e dois para a linha descendente.
  7. Quando as larvas atingem a maturidade sexual, repetir o protocolo iniciando no primeiro passo com a nova geração.

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Resultados

Este protocolo é uma técnica de maneio a longo prazo útil para a compreensão do zebrafish esquelético os mutantes (Figura 1). Reprodução seletiva através do teste de progênie deve produzir uma mudança em geral penetrância descendente e ascendente em poucas gerações (Figura 2). Em nosso trabalho anterior, duas rodadas de reprodução seletiva dirigimos a penetrância média para baixo de 17% para 3%1...

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Discussão

Reprodução seletiva revela sutilezas da função dos genes

Deslocando os fenótipos mutantes para ser mais ou menos grave por reprodução seletiva é uma maneira simples de ganhar novos insights sobre a função do gene. Quando comparado com os métodos padrão de reprodutores selecionados, o protocolo apresentado aqui pode render uma compreensão muito mais completa dos fenótipos mutantes. Especificamente, gerando tensões que são graves, a amplitude total dos fenótipos...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Chuck Kimmel para orientação, John Dowd para ajudar a desenvolver esta estratégia de reprodução, Macie Walker por seu trabalho em aperfeiçoar a mancha esquelética e Charline Walker e Bonnie Ullmann para conselhos úteis zebrafish. Este trabalho foi financiado pelo DE024190 K99/R00 para JTN.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde, pelleted, solidTed Pella Co.18501Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solidAcros Organics223210010
10x PBS, AqueousFisherBP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solidAnatech Ltd.867Must be from Anatech
Alizarin Red, solidSigmaA5533-25G
Glycerol, liquidFisherBP229 1
Hydrogen peroxide, liquidFisherBP263500
Potassium hydroxide,  solidFisherP250 500
StepOnePlus Real-time PCR MachineApplied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems4346906
Microseal 'B' sealBioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer MixLGCKBS-2100-100
Tris HCl, solidFisherBP153 500
potassium chloride, solidFisherBP366 500
Tween-20, liquidFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Tricaine-SWestern Chemicals
Proteinase KFisherBP1700 100
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Controlled Drop Pasteur PipetsFisher13-678-30
NanodropThermoFisherfor DNA quantitation

Referências

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
  2. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
  3. Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).
  4. DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
  5. McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  6. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  7. Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
  8. Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
  9. Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
  10. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
  11. Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).
  12. He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
  13. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
  14. Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
  15. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  16. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  18. Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
  19. McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
  20. Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
  21. Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
  22. McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39(2015).
  25. Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).
  26. Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
  27. Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522(2013).

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