Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

요약

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

초록

Zebrafish 돌연변이 고기는 수시로 불완전 하 게 침투 하 고, 일부 돌연변이 명시. 일관성 없이 나타나는 재미 있는 고기 공부 하 고, 어려울 수 있으며 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 증가 하 고 감소에 치명적인 zebrafish 골격 돌연변이 penetrance 간단 번 식 패러다임 이다. 치명적인 돌연변이 수 없습니다 선택적으로 사육 될 직접, 때문에 자손 테스트의 고전적인 선택적 번 식 전략 채택 된다. 이 메서드는 또한 Kompetitive 대립 유전자 특정 PCR (KASP) 유전형 zebrafish 및 얼룩 애벌레 zebrafish 연골과 뼈에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 여기에 설명 된 농업 전략 적용 다운스트림 응용 프로그램에 더 많은 결과 재현할 수 있도록 재미 있는 골격 표현 형의 penetrance를 증가할 수 있다. 또한,이 선택적 번 식 전략을 통해 돌연변이 penetrance 감소 가장 결정적인 돌연변이 유전자의 기능을 해야 하는 개발 프로세스를 밝힐 수 있다. 골격은 구체적으로 간주 하지만 여기, 우리는이 방법론은 모든 zebrafish 돌연변이 라인에 대 한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

서문

Zebrafish는 골격 발달을 이해 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 돌연변이 제 브라 긴장와 생물학 skeletogenesis 동안 유전자 기능을 해독할 수 있습니다. 그러나, zebrafish 골격 돌연변이 고기 가변 penetrance^1,2,,34 개발 및 유전자 분석을 방해할 수 있는 제시할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 3 겹 이다. 첫째, 지속적으로 심각한 고기 생산 zebrafish 돌연변이 라인 생성 시간 경과 기록⁵ 와 이식⁶같은 다운스트림 발달 연구 수 있습니다. 연구의 이러한 종류 고기 일관성 명단만 공부 하 여 무력화 될 수 있습니다. 둘째, zebrafish 긴장 inbreeding 유전 배경 변화, 따라서 실험 일관성과 재현성을 홍보를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 모든 현장에서 수행 교 잡 분석 한 선택적으로 타고 난된 긴장에 수 혼란 가변성을 감소 하며 결론을 강화. 셋째, 심각 하 고 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 특정 돌연변이에서 발생할 수 있는 전체 phenotypic 시리즈를 발표할 예정 이다.

언뜻 보기에 치명적인 돌연변이의 선택적인 breeding 불가능 보인다. 선택에 대 한 득점은 동물 들이 죽은 때 어떻게 penetrance에 대 한 하나의 품종을 수 있습니까? 다행히, 가족 선택, 테스트, 특히 자손에 의해 선택적인 breeding 방법 많은 년^7,8에 대 한 프로그램을 사육 하는 가축에 효과 증명 하고있다. 이 프로그램 주로 암소에 우유 생산 또는 할 꺼야에 계란 생산 한 섹스에만 되는 특성에 대 한 선택적인 breeding에 사용 됩니다. 이 종족의 남성을 직접 득점 수 없습니다 하지만 그들의 자손은 득점 하 고 값은 부모에 게 할당. 이 전략에서 대출, 여기에 제시 된 프로토콜 고정 및 스테인드 돌연변이 자손 zebrafish의 쌍에서 관심사의 돌연변이 유전자에 대 한 heterozygous는 득점을 포함 한다. 어떤 개인은 라인에 다음 세대를 생산할 예정 이다 결정할 때 homozygous 치명적인 돌연변이 자손의 표현 형의 penetrance 부모에 게 할당 됩니다. 우리는이 방법은 penetrance zebrafish 치명적인 골격 돌연변이¹에 이동 하는 효과적인 수단을 찾으십시오.

다른 연구와 마찬가지로,이 선택적인 breeding 프로토콜 클러치 크기, 자손의 생존, 배아, 그리고 섹스 비율⁹의 정상적인 개발 고려 조건에서 걸립니다. 그러나, 이러한 요인은 돌연변이 penetrance 이동의 목적으로 돌연변이 배경의 맥락에서 모두 간주 됩니다. 따라서,이 프로토콜 배경 동질성을 증가 뿐만 아니라 발달 돌연변이 분석을 강화 하는 방법을 제공 하 여 이전 선택적인 breeding 패러다임을 확장 합니다.

이 프로토콜 사전에 안정적이 고 신속한 유전형 프로토콜을 개발 하는 것이 중요 하다 그래서 광범위 한 유전형을 요구 한다. 그러나 많은 유전형 프로토콜 사용할 수 있는^10,11, 우리는 KASP 유전형^12,,1314 찾을 빠릅니다, 더 비용 효율적인, 그리고 방법 보다 더 신뢰할 수 있는 증폭된 시퀀스¹⁰의 제한 효소 절단을 기반으로 합니다. 따라서, 우리는이 작품에서 KASP 프로토콜을 포함. 또한, 우리는이 프로토콜에 골격 돌연변이 고기에 집중 하 고 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 이전 프로토콜¹⁵수정 절차를 포함.

여기 설명 하는 방법을 상향 또는 하향 치명적인 돌연변이 penetrance 변화는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 골격 돌연변이 고기에 초점을 맞추고, 하는 동안 우리는 모든 돌연변이 제 브라 라인의 축산에 대 한 유용한 전략 될 것입니다 믿습니다. 사실,이 번 식 전략 가능성의 유틸리티 zebrafish 넘어 확장 됩니다. 우리가 예측 penetrance 생물의 광범위 한 범위에서 이동이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 치명적인 penetrance 자손 테스트 하 여 이동 하는 것은 어떤 발달 유전학의 진도 앞으로 밀어 것을 도울 수 있다.

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프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 실험 따라 그리고 콜로라도의 대학 및 대학 오 레 곤 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 완성 되었습니다.

1. 선택 되지 않은 시작 재고 준비

1. 식별 heterozygous 항공사의 지 느 러 미에 의해 돌연변이 체 대립 유전자의 클립 ¹¹ 및 유전형 전체 형제 동물의 주식 선택의 방법으로와 같은 KASP ^{12 , , 13 14}. 이 프로토콜 zebrafish mef2ca ^b1086 긴장 수행 되었다.
2. KASP 유전형
   참고: KASP 위한 대립 유전자 특정 뇌관 (재료의 표 참조) 시 약을 제공 하는 회사에 의해 설계 되었습니다. 특정 실시간 PCR 기계에 대 한 적절 한 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) 염료 농도 회사 웹사이트를 방문. 세포의 용 해 버퍼 (10 mM tris (pH 8.3), 50 m KCl m, 1.5 m m MgCl ₂, 0.3% 비 이온 계면 활성 제, 0.3 %Octylphenyl-폴 리 에틸렌 글리콜)의
   1. 장소 zebrafish 꼬리 조직 50에서 µ L. 2-5 h 20 분 94 ° C 비활성화 단계 뒤 55 ° C에서 열 cycler에 96-잘 PCR 플레이트 및 다이제스트의 당 성분을 K 10 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 소화. 세포 제품을 냉장
      참고: 세포 제품 준비 후 몇 달 동안 성공적으로 사용 될 수 있습니다. 조직 50 m m NaOH를 사용 하 여 lysed 했다 때 KASP 반응 실패 했다. 이 발견은 건의 한다 genomic DNA 준비의 NaOH 메서드 KASP와 호환 되지 않습니다.
   2. 게놈 DNA를 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 각 반응 포함 약 20-30 ng 되도록 분자 생물학 학년 물을 사용 하 여 게놈 DNA 템플렛을 희석.
      참고: 4 또는 5 샘플 계량, 그들, 수영장 다음 평균에 따라 모든 샘플에 대 한 희석을 준비 합니다. 이 프로토콜을 성인 꼬리 조직에 사용 하는 경우 1: 100 희석은 종종 충분 합니다. DNA 농도의 정확한 정량화는 필요 하지 않습니다.
   3. 추가 0.14 µ L KASP 뇌관의 혼합 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 튜브의 하단에 내용을 수집 centrifuging 짧게 전에 잘 믹스에 얼음에 샘플 당 혼합 KASP 마스터의 5 µ L.
      참고: KASP 마스터 혼합 열 및 민감한 빛 얼음에 대 한 재고 유지 이며, 직접 빛을 하지 마십시오.
   4. 피펫으로 5 µ L 뇌관/마스터의 믹스 솔루션 사용 되 고 실시간 PCR 기계에 대 한 적합 한 96-잘 광학 PCR 격판덮개의 우물으로.
   5. 피펫으로 5 µ L의 희석 (약 5-7 ng / µ L) 각 DNA 템플릿 샘플 고를 섞어 피 펫과 발음.
   6. Nuclease 무료 물 3 웰 스 노-템플릿 컨트롤 (NTC)으로 희석된 확인된 homozygous 야생 타입, 긍정적인 컨트롤 heterozygous 및 homozygous 돌연변이 DNA 템플렛의 5 µ L을 추가 하는 추가 5 µ L.
   7. 영화에 각 잘 완전히 밀봉 판 보장 광학 투명 필름 밀폐 장소.
   8. 짧게 원심 600 x g 하단에 내용을 수집 하 고 믹스에서 거품을 제거 하 고 접시.
      참고: 진행 준비까지 빛에서 얼음 및 방패에 접시를 유지.
   9. 표 1에 표시 된 순환 프로그램을 사용 하 여 주요 KASP 반응을 수행 하.
   10. 볼 결과 점도 분석 컴퓨터에 의해 제작. 성공적인 반응 플롯 ( 그림 3)에 포인트의 4 가지 그룹을 표시 됩니다: 3 샘플 유전자, 및 원점 근처 NTCs의 한 그룹에 해당 하는 그룹. 긍정적인 컨트롤 적절 한 샘플 그룹화와 분리 해야 합니다.
   11. 컴퓨터 프로그램에 해당 특정 genotypes, 추가 세트 자전거 하로 그룹화 될 수 있습니다 음모를 인식 하지 못하는 경우 (표 2) 필요 합니다. 반복 하 여 추가 프로그램 유전자 형에 의해 꽉 그룹을 인식 하는 컴퓨터.
   12. 유전형 결과 쉽게 사용 및 분석에 대 한 스프레드시트 파일에 내보냅니다.
3. 함께 주 물 시스템에 식별된 heterozygous 동물 집.

2.는 첫 번째 라운드의 자손 득점

1. 동물 핀 클립에서 복구 후 쌍 형제 heterozygotes 크로스
2. 인덱스도 intercrosses을 설정. 디바이 더를 사용 하 여 되도록 배아 동기 ¹⁶.
3. 배아를 수집 하 고 계속 감 금 소를 사육에서 고립 된 부모의 쌍.
4. 호전적인 물고기 분리 하거나 커버와 함께 제공 될 수 있도록 격리 된 성인 모니터링 (났습니다 물고기 멋지게 작업 그물). 물고기를 먹여야 한다 고 그들의 물 고정 물에 IACUC 지침 변경.
1. 태아 양육
   1. 무대 고 표준 조건 ¹⁷에서 애벌레를 zebrafish 태아.
   2. Phenotypically 야생-타입 동물 수영 방광 클러치의 75%에 증가 될 때 5 또는 6에 유리 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 어떤 부모 그들을 굴복 녹음 보육원에서 phenotypic 야생 종류 배치.
      참고: 있는 치명적인, 사실 많은 골격 돌연변이 열성 돌연변이 체 대립 유전자와 homozygous 돌연변이 형태로 수영 방광 ^{18 , 19} 실패. 그러므로, phenotypic 야생 종류 수 있습니다 쉽게 분별 수 비정상적된 수영 방광에 따라 그들의 돌연변이 체 형제 자매에서.
2. Alcian 블루/알리자린 레드 연골과 뼈 얼룩
   1. 0.17 g/L Tricaine를 사용 하 여 그들의 수영 방광 팽창 하지 않는 애벌레 Anesthetize-배아 미디어에 S. 넓은 구멍 유리 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 동물을 수집 합니다. 튜브 당 이상의 100 애벌레 추가.
   2. 각 관에서 배아 물을 제거 하 고 관 당 1 x PBS에 2 %paraformaldehyde 1 mL에 동물 수정.
      주의: 수성 PFA 가연성 이며 심각한 피부와 눈 자극을 일으킬 것 이다. 장갑과 눈 보호와 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 사용 후 손을 씻으십시오.
   3. 1 h 바위; 더 긴 고정 손상 뼈 얼룩. 이 기간 동안 정기적으로 튜브를 확인 하 고 없는 애벌레를 보장 하기 위해 모든 이후 락 단계 측면에 붙어 되거나 튜브의 하단에 clumped.
   4. 유리 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 정착 액 제거, 50% 에탄올과 락 10 분의 1 mL을 추가
   5. 준비 20 µ L의 0.5%를 추가 하 여 솔루션 얼룩 신선한 공기로 Alcian의 1 mL 당 알리자린 레드 (0.04 %Alcian 블루/10 m m MgCl ₂ / 80% 에탄올). 50% 에탄올을 제거, 각 관, 그리고 바위에 솔루션을 하룻밤 얼룩의 1 mL를 추가 합니다. 애벌레는 최대 5 일 동안 얼룩에 남아 있을 수 있습니다.
   6. 튜브에서 얼룩이 솔루션을 제거 하 고 각 관을 80% 에탄올/10 m m MgCl ₂ 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 적어도 1 시간;에 대 한 튜브를 록 명확 하 게 Alcian 블루 얼룩을 생산할 수 있는 하룻밤을 rinsing.
   7. 80% 에탄올/10 m m MgCl ₂ 솔루션 튜브에서 제거 및 추가 50% 에탄올의 1 mL; 5 분에 대 한 바위
   8. 튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 25% 에탄올과 락 5 분의 1 mL을 추가
   9. 튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 추가 1 mL 신선한 3% H ₂ O ₂ /0.5% 코 표백 솔루션입니다. 뚜껑 열기와 튜브 마이크로 튜브 랙 또는 희미 한 갈색 채색 솔루션의 위쪽 부분에서 볼 수 있습니다 때까지 약 10 분에 서 보자.
      참고: 솔루션 위에 거품 형태의 레이어. 주의 타이밍은이 단계에서 필요 이상으로 표백 귀 착될 것 이다 가난한 더블 얼룩.
   10. 표백 솔루션 제거 및 추가 25 %glycerol/0.1% 코의 1 mL; 1 h. 10 분 바위
   11. 튜브에서 25 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거, 각 관, 하룻밤에 10 분 동안 바위에 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션의 1 mL을 추가.
   12. 튜브에서 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거 하 고 다시 각 튜브를 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 추가 합니다. 락 하룻밤 도움이 됩니다 애벌레 내부 누적 될 수 있는 공기 방울을 제거. 사용 하지 않는 저장소 4 ° C에서 골격 준비 스테인드.
3. 형 점수
   1. 점수 스테인드 penetrance 선택한 표현 형의 대 한 돌연변이 자식. 니콜스 외에 ¹ 돌연변이 소성 뼈의 모든 발생에 대 한 득점 했다.
      참고: zebrafish 부모는 고정 물에 알리자린 레드 얼룩 시간 함께 사라질 수 있기 때문에, 그것은 중요 한 골격 준비 완료의 몇 일 이내에 해골 점수.
   2. Penetrance는 표현 형을 가진 유전자 형의 비율 이다. 다음 수식에 의해 계산 하는 백분율 penetrance:
      %penetrance (표현 형을 가진 돌연변이) = / (돌연변이의 총 수) × 100

3. 가족 선택

1. 선택 2 높은 penetrance, 다음 세대에 대 한 두 개의 낮은 penetrance 가족. Penetrance, 뿐만 아니라 통치와 활기; 전파 하는 가족을 선택할 때 고려 하는 것이 중요 하다 이 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
2. 줄 각 부모의 쌍 하위 재고 식별자: 가족.01,.02, 등
3. 집 여러 혼합된 섹스와 메인 시스템에 부모의 쌍 ' 동반자 ' 물고기. 동반자 물고기 수 영구, 명백한 구별 기능, 변경 된 착 색 또는 탄 미 익 구조 등 어떤 제 브라 라인.
   참고: 많은 연구원은 성공적으로 탱크에 쌍만 사육 유지할, 호의 베푸는 결과 볼 수 있습니다 여러 동반자 물고기와 쌍을 주택으로. 이 선택적 단계 더 큰 학교에 보관 하는 동물의 사육을 허용 하 고 그래서 그들은 수 있는 반복적으로 교차 필요에 따라 쉽게 검색. 부모의 쌍 대 전체 형제 가족; 생성 하 반복적으로 교차 수 있습니다. 같은 부모의 쌍 교차 반복 하기 전에 적어도 일주일 기다려.
4. 추려 단계 2.2.2에서에서 애벌레 가족. 그 다음 세대에 대 한 선택 하지 했다.
5. 탱크 그들의 돌연변이 체 형제에서 penetrance로 선택한 가족에서 야생-타입 형제 애벌레를 포함 하 고 정상적으로 성인 기에 발생.
6. 차세대 적어도 4 개의 풀-형제 가족, 위쪽 라인에 대 한 두과 아래쪽 라인에 대 한 2를 해야 합니다.
7. 애벌레 도달 성적인 성숙, 반복 새로운 세대와 함께 1 단계부터 시작 하는 프로토콜.

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결과

이 프로토콜은 장기 축산 기술 이해 zebrafish 골격 돌연변이 (그림 1)에 대 한 유용. 선택적인 breeding 자손을 테스트 하 여 전반적인 penetrance 하향 및 상향 몇 세대 (그림 2)에 있는 변화를 항복 한다. 우리의 이전 작품에서는, 선택적인 breeding의 2 라운드 3¹17%에서 평균 penetrance 아래로 몰고. 마찬가지로, 우리의 위쪽...

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토론

선택적인 Breeding 유전자 기능의 예민을 발표

더 또는 덜 심각한 선택적인 breeding에 의해 돌연변이 고기 이동 유전자 기능에 새로운 통찰력을 얻을 하는 간단한 방법입니다. 선택 되지 않은 번 식의 표준 방법으로 비교, 여기에 제시 된 프로토콜 돌연변이 고기의 훨씬 더 완전 한 이해를 얻을 수 있습니다. 특히, 심한 긴장을 생성 하 여 돌연변이 고기의 전체 폭 수 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde, pelleted, solid	Ted Pella Co.	18501	Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid	Acros Organics	223210010
10x PBS, Aqueous	Fisher	BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid	Anatech Ltd.	867	Must be from Anatech
Alizarin Red, solid	Sigma	A5533-25G
Glycerol, liquid	Fisher	BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid	Fisher	BP263500
Potassium hydroxide,  solid	Fisher	P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine	Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	4346906
Microseal 'B' seal	BioRad	MSB1001
KASP Master Mix, High ROX	LGC	KBS-1016-022	https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix	LGC	KBS-2100-100
Tris HCl, solid	Fisher	BP153 500
potassium chloride, solid	Fisher	BP366 500
Tween-20, liquid	Fisher	BP337 100
Nonidet P40	ThermoFisher	28324
Tricaine-S	Western Chemicals
Proteinase K	Fisher	BP1700 100
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets	Fisher	13-678-30
Nanodrop	ThermoFisher		for DNA quantitation