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要約

このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。

要約

ゼブラフィッシュ変異体の表現型は、不完全な浸透、のみいくつかの変異で発症しました。一貫性のない表示興味深い表現型は難しいことができ、結果を交絡につながることができます。ここで説明されているプロトコルは、致命的なゼブラフィッシュ骨格変異の浸透度を上げたり下げたりする簡単な繁殖パラダイムです。致命的な突然変異体は、選択的に直接飼育できません、ために、間接検定の古典的な選択的な繁殖戦略を採用します。このメソッドには、Kompetitive の対立遺伝子特定の PCR (KASP) ジェノタイピング ゼブラフィッシュと染色のゼブラフィッシュ稚魚軟骨と骨のプロトコルも含まれています。ここで説明されている飼育方法を適用することは、下流のアプリケーションでより再現性のある結果を有効にする興味深い骨格表現型の浸透度を増やすことができます。さらに、この選択的な繁殖戦略によって突然変異の浸透度を減少させる最も重要な変異遺伝子の機能を必要とする発達のプロセスを表示できます。骨格、特にここと見なされます、この方法論はすべてゼブラフィッシュ突然変異系統の有用であることを提案します。

概要

ゼブラフィッシュは、骨格開発を理解するための強力なモデル システムです。ゼブラフィッシュ変異株の生物学者は骨格中に遺伝子の機能を解読できます。ただし、ゼブラフィッシュ骨格変異表現型を発達・遺伝的解析を妨げることができる変数の浸透度1,2,3、4を提示できます。このメソッドの目的は三重です。コマ撮り録画5と移植6のような下流の発達研究が初めに、一貫して重度の表現型を作り出すゼブラフィッシュ突然変異系統を生成できます。研究のこれらの種類は、一貫性のないマニフェストのみ表現型を研究しようとして不自由することができます。第二に、ゼブラフィッシュ系統を近親交配は遺伝的背景変化、実験的一貫性と再現性を促進を減らすことができます。1 つ選択的に交のハイブリダイゼーション解析できますたとえば、すべてその場で実行する交絡のばらつきを抑えることし、結論を強化します。第三に、重度と軽度の株を生成すると、特定の突然変異に起因することができます全体の表現型シリーズが明らかになります。

最初一見で、致命的な突然変異体の選択的な育成は不可能だと思います。選択範囲を獲得している動物が死んでいるとき、浸透のための 1 つの品種をいかにできるか。幸いなことに、家族の選択、テスト、特に子孫によって選択的な育成法は、畜産87,年多くのためのプログラムの有効性を実証しています。これらのプログラムは、のみ牛の牛乳生産や鶏の卵の生産のような 1 つのセックスに存在する形質の選択的な繁殖のため主に使われます。これらの種の男性は直接得点できないが、彼らの子孫を獲得しているし、両親に値が割り当てられます。この戦略から借りて、ここで提示されたプロトコルには、固定と染色変異子孫ゼブラフィッシュのペアからの興味の突然変異遺伝子のヘテロ接合体の得点が含まれます。個人の行に次の世代が生成されますを決定する際、両親にホモ接合体致死突然変異体の子孫の表現型の浸透度が割り当てられます。私たちはゼブラフィッシュ致死の骨格変異体1での浸透度をシフトの効果的な手段をこの方法には見つけます。

他の研究と同様に、この選択的な繁殖のプロトコルは、クラッチ ・ サイズ、子孫の生存、胚および性比9の正常な開発のような検討規準の下でかかります。ただし、これらの要因は、すべての突然変異の浸透度をシフトの目的と変異の背景のコンテキストで考慮されます。したがって、このプロトコルは、背景の均質性を増加し同様、突然変異体の発達の分析を強化する方法を提供することによって前の選択的な繁殖のパラダイムを拡張します。

このプロトコルは、事前に信頼性の高い、迅速なジェノタイピング プロトコルを開発する上で重要な広範な遺伝子型を必要です。多くジェノタイピング プロトコル10、11、しかし我々 は見つける KASP ジェノタイピング報12,13,14はより速くよりコスト効率的、かつより信頼性の高いメソッド増幅されたシーケンス10の制限の酵素の胸の谷間に基づいています。したがって、この作業で KASP プロトコルを含めます。さらに、このプロトコルで骨格変異体の表現型に着目し、, アルシアン ブルー/アリザリン赤染色前のプロトコル15から変更のプロシージャが含まれます。

ここで説明する方法は、上向きまたは下向きに致死突然変異の浸透度をシフトのため簡単な戦略です。このプロトコルは、骨格の変異体の表現型に焦点を当て、すべてのゼブラフィッシュ変異体ラインの飼育のための有用な戦略であろうと信じています。実際には、可能性がありますこの繁殖戦略の有用性は、ゼブラフィッシュを超えて拡張します。我々 は、有機体の広い範囲に浸透度をシフトするこのプロトコルを変更できることを予測します。子孫テストによって致命的な浸透度をシフト任意の発達の遺伝学の進歩を進めることができます。

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プロトコル

やコロラド大学とオレゴン州機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学の遵守にこのプロトコルで記述されているすべての実験が完成します

。

1 です選択されていない開始在庫を準備する

  1. 識別フィンが興味の突然変異体の対立遺伝子のヘテロ接合体キャリア クリップ 11 および遺伝子型解析における兄弟動物の在庫による選択、のよう。KASP 12 , 13 , 14。このプロトコルはゼブラフィッシュ mef2ca b1086 ひずみで実行されていました
    2. 。
  2. KASP ジェノタイピング
    注: KASP の対立遺伝子特定のプライマー (材料表 参照) 試薬を提供する会社によって設計されています。取得するには、特定のリアルタイム PCR マシンの適切な 6-カルボキシル基-X-ローダミン (ロックス) 色素の濃度は、会社のウェブサイトをご覧ください。
    1. 場所ゼブラフィッシュ尾組織 50 μ L (10 mM トリス (pH 8.3) 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.3% 非イオン性界面活性剤、0.3% = ポリエチレン ・ グリコール) 換散バッファーの。サーマルサイクラー 20 分 94 ° C 不活化ステップ 2 5 h の 55 ° c に 10 μ L/ウェルの 96 ウェル PCR プレートとダイジェスト プロテイナーゼ K を 10 mg/mL を追加します。消化後溶解製品を冷蔵
      注: 換散製品を準備の後数ヶ月間正常に使用できます。組織はだった 50 mM NaOH を使用して溶解し, とき KASP 反応は成功しなかった。ゲノム DNA の準備の NaOH メソッドが KASP で互換性がないことが示唆します
      2. 。
    2. は、分光光度計を使用してゲノム DNA を定量化します。各反応が約 20-30 ng を含むように分子生物学グレードの水を使用してゲノムの DNA のテンプレートを希釈します
      。 注: 4 または 5 のサンプルを定量化に、プール、平均値に基づいて、すべてのサンプルの希釈液を準備します。大人の尾組織にこのプロトコルを使用する場合、1: 100 希釈通常十分です。DNA 濃度の正確な定量が必要ではありません
      3. 。 ミックス KASP プライマーの
    3. 追加 0.14 μ L と 1.5 mL 容マイクロ チューブとチューブの下部に内容を収集するために簡単に遠心分離前によくミックスに氷のサンプルあたりミックス KASP マスターの 5 μ L.
      メモ: KASP のマスターの組合せは熱と光に敏感、氷の在庫を保持して、直接光を避ける
      4. 。
    4. プライマー/マスターのピペット 5 μ L は、使用されているリアルタイム PCR マシンに適した光 96 ウェル PCR プレートのウェルにソリューションをミックスします
      5. 。
    5. ピペット 5 μ L の希釈 (約 5-7 ng/μ L) 各 DNA テンプレートのサンプルも、ミックスにピペットで吸い出しなさい
      6. 。
    6. 3 井戸なしテンプレート コントロール (NTC) として機能し、肯定的なコントロールのヘテロ接合体、ホモ接合体の変異 DNA テンプレート希薄確認ホモ野生型の 5 μ L を追加するヌクレアーゼ フリー水の追加 5 μ L.
    7. フィルムは、各ウェルに密閉を確保するプレートを光学的に透明フィルム シールを配置します
      8. 。
    8. 簡単に 600 x g 下部にコンテンツを収集し、ミックスから泡を削除にプレートを遠心します
      。 : 注意氷のシールド板の光から続行する準備が整うまで
      9. 。
    9. メイン KASP 反応を実行する 表 1 に示されているサイクリング プログラムを使用します
      10. 。
    10. は、解析コンピューターによって生成される結果の散布を表示します。( 図 3) のプロット ポイント 4 のグループが表示されます成功した反応: 遺伝子型、および原点の近く NTCs の 1 つのグループに対応するグループ化のサンプル 3 つ。ポジティブ コントロールを適切なサンプル グループを分離する必要があります
      11. 。
    11. コンピューター プログラムが特定遺伝子型、追加セットをサイクリングに該当するグループは、プロットを認識しない場合は、(表 2) を必要です。コンピューターが遺伝子型によってタイトなグループを認識するまで追加のプログラムを繰り返します
      12. 。
    12. ジェノタイピングの結果をスプレッドシート ファイルより簡単に使用および分析のためにエクスポートします
      13. 。
  3. メインの水システムに識別されたヘテロ接合体動物の家します
。

2. の最初円形の子孫得点

ペア intercrosses
    1. 動物が鰭クリップから回復後を ペアワイズ交差兄弟のヘテロ接合体 の設定。胚が同期 16 ように仕切りを使用します
      2. 。
    2. 胚を収集し、繁殖ケージで分離された親のペアを保持します
      3. 。
    3. 孤立した大人を監視は、ので、積極的な魚を分離またはカバーを提供できます (細切り魚は、仕事をうまくネット)。魚を供給する必要があり、水の交換が静的な水の中 IACUC ガイドラインに従う
      4. 。
  2. 胚の飼育
    1. ステージ、標準条件 17 の下で幼虫にゼブラフィッシュ胚を上げる
      2. 。
    2. は、クラッチの 75% に膨らんだ膀胱を泳ぐとき、5 または 6 の日にガラス ピペットを使用して野生型表現型動物を収集します。保育園で親のそれらが得られた記録表現型の野生タイプを配置します
      。 注: は劣性致死的な多くの骨格変異の本当である突然変異体の対立遺伝子のホモ接合体変異体フォームうきぶくろ 18 , 19 に失敗します。したがって、表現型の野生型が簡単に水増しうきぶくろに基づく変異兄弟から識別できます
      3. 。
  3. アルシアン ブルー/アリザリン赤軟骨と骨染色
    1. 0.17 g/L Tricaine を使用した浮袋を膨らませるいない幼虫の麻酔-胚メディアで S。ワイドボア ガラス パスツール ピペットで 1.5 mL 遠心チューブに動物を収集します。チューブあたり 100 以上の幼虫を追加します
      2. 。
    2. は各チューブから胚水分を取り除き 1 ml あたりチューブ 1 × PBS で 2% パラホルムアルデヒドの動物を修正します
      。 注意:水性 PFA は可燃性と深刻な皮膚や眼の炎症を引き起こします。手袋、眼の保護など適切な保護具を着用し、使用後はよく手を洗うです
      3. 。
    3. ロック 1 時間; 長い固定骨染色を損ないます。この中に定期的にチューブをチェックと幼虫がないようにすべての後続の揺動手順を側面に貼り付けになるかチューブの底に群生します
      4. 。
    4. ガラス ピペットを使用してチューブから定着剤を削除したり、50% エタノールと 10 分のための石の 1 つの mL を追加
    5. 染色液 0.5% の 20 μ L を追加することによって新鮮な準備アルシアンの 1 mL あたりアリザリン赤プレミックス (0.04% アルシアン ブルー/10 mM MgCl 2/80% エタノール)。50% エタノールを削除したり、各チューブ、およびロックにソリューションを一晩染色の 1 mL を追加します。幼虫は、5 日前まで汚れに残ることが
      6. 。
    6. は、チューブから汚れのソリューションを削除し、各チューブに 80% エタノール/10 mM MgCl 2 ソリューションの 1 つの mL を追加します。少なくとも 1 h; のチューブをロックします。明確アルシアン ブルー染色を作り出すことができる一晩をすすぎします
      7. 。
    7. 80% エタノール/10 mM チューブからの MgCl 2 ソリューションを削除し、50% エタノール 1 mL を加える; 5 分の岩
    8. チューブから 50% エタノール溶液を削除し 25% エタノールや 5 分岩の 1 つの mL を追加
    9. チューブから 50% エタノール溶液を削除し、作りたての 1 mL 3% H 2 O を追加 2 /0.5% KOH 漂白溶液。チューブ マイクロ チューブ ラック約 10 分、またはソリューション部の上部でかすかな茶色の着色を見ることができるまでに立つせキャップ オープンのままにします
      。 注: ソリューションの上に泡を形成層です。貧しい二重染色で結果が漂白タイミングはこの段階で必要以上に注意してください
      10. 。
    10. 漂白ソリューションを削除し、25 %glycerol/0.1% 島の 1 つの mL を追加; 1 h に 10 分間ロック
    11. チューブから 25% glycerol/0.1% KOH 溶液を削除したり、各チューブは、一晩に 10 分間、ロックする 50% glycerol/0.1% KOH 溶液の 1 mL を追加します
      12. 。
    12. は 50% glycerol/0.1% KOH 溶液をチューブから削除し、再び各管に 50% glycerol/0.1% KOH 溶液を追加します。ロッキング一晩役立つ幼虫内に蓄積することができます空気の泡を削除します。使用されていないときにストアが 4 ° C で骨格の準備をステンド グラスします
      13. 。
  4. 表現型得点
    1. スコア ステンド選択された表現型の浸透度の突然変異体の子孫。・ ニコルズ ら の 1 突然変異体の異所性骨発生に対してスコア化した
      。 注: ゼブラフィッシュの両親は、静的な水、アリザリン赤染色時間と衰退することができますので、それは骨格の準備を完了する数日以内のスケルトンをスコアすることが重要です
      2. 。
    2. 浸透度は、表現型は、遺伝子型の割合です。次の式によってパーセントの浸透度を計算:
      % 浸透 = (表現型の突然変異体)/(突然変異体の合計数) × 100

3。家族の選択

  1. 選択 2 高浸透と次世代のための 2 つの低浸透度家族。浸透度、に加えて伝達; への家族を選ぶときに、多産と活力を考慮することが重要です。これの詳細についての 議論 を参照してください
    2. 。
  2. 各親ペア サブ在庫識別子を与える: 家族、.01.02、等
  3. 家のいくつかの混合セックスとメイン システムの親ペア ' の仲間 ' 魚。仲間の魚は、色素沈着やフィン構造の変化など、永続的な明らかにの特徴的な機能で任意のゼブラフィッシュの行をすることができます
    。 注: 多くの研究者は正常にのみ繁殖の水槽にペアを維持、いくつかの仲間の魚でペアを集合住宅で良好な結果がみられます。このオプションの手順によりより大きい学校に保管する動物のつがいと必要に応じて彼ら何度も交差することができます簡単に取得します。大規模なフル兄弟家族を生成する親のペアを繰り返し交差ことができます。繰り返し同じ親ペアを横断する前に、少なくとも 1 週間待つ
    4. 。
  4. ステップ 2.2.2 から幼虫の家族をカリングしますを次世代用に選択されなかった。
    5. 。
  5. 変異兄弟から浸透度を持った選択された家族から野生型兄弟幼虫を含むタンクのラベルし、として通常成人に発生します
    6. 。
  6. 次世代は、少なくとも 4 つのフル兄弟家族、2 つのラインが上昇と下降線の 2 つを持っている
    7. 。
  7. 幼虫が成熟に達したら、新しい世代のステップ 1 から開始プロトコルを繰り返します
    8. 。

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結果

このプロトコルは、長期飼育技術理解できないゼブラフィッシュ骨格変異体 (図 1) に便利です。子孫がテストすることによって選択的な繁殖は、全体的な浸透度下向きと上向き数世代 (図 2) でシフトを得られるはず。筆者らは, 選択的な育成の 2 つのラウンドは 17% から 31平均浸透度下方を行なった。同様...

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ディスカッション

選択的な育成は遺伝子機能の機微を発表します。

シフトを詳細または選択的な育成によって重症度の低い突然変異の表現型は、遺伝子の働きに新しい洞察力を得るために簡単な方法です。選択されていない繁殖の標準的な方法と比較すると、ここで提示されたプロトコルは突然変異体の表現型のより完全な理解を得ることができます。具体的には、重度の菌...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

指導のためチャック キンメル、この繁殖戦略の開発に役立つのジョン ・ ダウド、骨格の汚れを完璧に彼女の仕事の Macie ウォーカーとシャーリーン ウォーカーとボニー ウルマン役に立つゼブラフィッシュのアドバイスを感謝したいと思います。この作品は、JTN に K99/R00 DE024190 によって支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde, pelleted, solidTed Pella Co.18501Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solidAcros Organics223210010
10x PBS, AqueousFisherBP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solidAnatech Ltd.867Must be from Anatech
Alizarin Red, solidSigmaA5533-25G
Glycerol, liquidFisherBP229 1
Hydrogen peroxide, liquidFisherBP263500
Potassium hydroxide,  solidFisherP250 500
StepOnePlus Real-time PCR MachineApplied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems4346906
Microseal 'B' sealBioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer MixLGCKBS-2100-100
Tris HCl, solidFisherBP153 500
potassium chloride, solidFisherBP366 500
Tween-20, liquidFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Tricaine-SWestern Chemicals
Proteinase KFisherBP1700 100
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Controlled Drop Pasteur PipetsFisher13-678-30
NanodropThermoFisherfor DNA quantitation

参考文献

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
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