JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.

Abstract

פרוטוקול זה מדגים את היכולת של אלקטרון נמוך-שדה פאראמגנטיים תהודה (EPR)-המבוסס על טכניקות בשילוב עם הבדיקות פאראמגנטיים תפקודית כדי לספק מידע כמותי על microenvironment הגידול כימי (טיים), לרבות p O2, pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של פוספט אורגניים interstitial (Pi), ו גלוטתיון תאיים (GSH). בפרט, יישום של בדיקה שפותחו לאחרונה trityl רב תכליתיים מסיסים מספק הזדמנות מתחרות על ויוו מדידות בו-זמניות של pH, pO2 ו- P. אני ב- E xtracellular החלל (תקווה העצמית). המידות של שלושה פרמטרים באמצעות בדיקה אחת מאפשרים את בדיקותיהם המתאם עצמאית של בדיקה הפצה, זמן של המדידות.

Introduction

תפקיד מרכזי של טיים התקדמות סרטן, טיפול הוא מוערך יותר ויותר1. בין פרמטרים פיזיולוגיים חשובים של טיים גידולים מוצקים, רקמות היפוקסיה2, חמצת3,4, גבוהה תוך צמצום קיבולת5, ריכוזים גבוהים של6,תאיים GSH7, פאי interstitial8 מתועדים היטב. הערכות2, pH, Pi, GSH, חמצון-חיזור לא פולשנית ויוו pO מספקים תובנות ייחודיות לתוך התהליכים הביולוגיים טיים, לעזור כלים מראש להקרנה קליניים של תרופות נוגדות סרטן, אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות טיים. גלי רדיו סביר חדירה לעומק ברקמות על ידי תהודה מגנטית (MRI), טכניקות מבוססות EPR שדה נמוך גורם להם את הגישות המתאים ביותר עבור הערכה לא פולשנית של פרמטרים אלה טיים. MRI מסתמכת במידה רבה על הדמיה פרוטונים במים, נעשה שימוש נרחב הגדרות קליניים כדי לספק רזולוציה אנטומי אבל חסר פתרון פונקציונלי. המידות תהודה מגנטית גרעינית זרחן-31 (31P-NMR) של חוץ-תאית Pi ריכוז ו- pH בהתבסס על אות מ פוספט אנדוגני פוטנציאלי אטרקטיבי עבור אפיון טיים, אבל הם בדרך כלל על ידי רעולי פנים מספר פעמים גבוה יותר תאיים Pi ריכוזים9,10. לעומת זאת, מדידות EPR לסמוך על ספקטרוסקופיה, הדמיה של מיוחד המיועד הגששים פאראמגנטיים לספק פתרון פונקציונלי. שים לב כי הגששים EPR אקסוגני יש יתרון על פני אקסוגני NMR רגשים בשל הרגישות גבוהה יותר של מהותי של EPR ואת היעדר רקע אנדוגני EPR אותות. ההתפתחות האחרונה של nitroxyl pH, חמצון-חיזור בתפקוד כפול בדיקה11 ו trityl רב תכליתיים בדיקה12 מספקת הזדמנויות ללא תחרות עבור ויוו מדידות במקביל של מספר פרמטרים טיים שלהם המתאם ניתוחים עצמאיים על בדיקה הפצה והזמן המדידה. הידע שלנו, הם לא שיטות אחרות הזמינות להעריך במקביל ויוו פיזיולוגית כימי טיים פרמטרים חשובים בנושאים החיים, כגון pO2, ה-pHאלקטרוני, Pi, חמצון-חיזור, GSH.

רגשים עבור אין ויוו המידות פונקציונלי:

איור 1 מציג את מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים המשמשים לגישה טיים פרמטרים, אשר כוללים חלקיקים ולא מסיסים הגששים. רגישות גבוהה פונקציונלי, יציבות רקמה חיה, רעילות מינימלית הם כמה מהיתרונות שגורמים חלקיקי הגששים מועדפת על פני מסיסים זונדי ויוו EPR oximetry. לדוגמה, הגששים חלקיקי הגבירו שמירה פעמים באתר של רקמה השתל לעומת הגששים מסיסים המאפשרות מדידת האורך של רקמות pO2 במשך מספר שבועות. מצד שני, הגששים מסיסים להכות חלקיקים הגששים על-ידי מתן מידות המרחבי לפתור באמצעות מבוסס-EPR הדמיה טכניקות כמו גם מאפשר ניתוח בו-זמני של פונקציות מרובות (pO2, pH, Pi, חמצון-חיזור, ו GSH).

figure-introduction-2845
איור 1. מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים זה להרכיב טיים הערכת assay. זה כולל את המקדח חלקיקי pO2 , לינק-BuO (R =3CH - O (CH2)3), וזונדים מסיסים: פונקציה כפולה בדיקה pH, חמצון-חיזור, נ; GSH-רגיש הגישוש, RSSR; רב תכליתיים pO2, pH ו- Pi המכשיר microenvironment חוץ-תאית, החללית תקווה. הסינתזה של רגשים אלו תואר 11,הפניות שסופקו12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

כל בעלי החיים העבודה בוצעה לפי פרוטוקול IACUC WVU אושרה.

1. בדיקה סינתזה וכיול

  1. חלקיקי pO2-רגיש בדיקה לינק-BuO
    הערה: לינק-BuO microcrystals הם מסונתז והוא המוכן כפי שמתואר הפניה13. הם יציבים מאוד, יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך שנים. Linewidth EPR של המכשיר חלקיקי לינק-BuO הוא pO2-פרמטר רגיש. לינק-BuO microcrystals להפגין אידיאלי תלות לינארית של linewidth על ריכוז חמצן בטווח מתנאי אנאוקסיים עד 760 מ מ כספית של pO2 לחץ חלקי13, עם הערכים של linewidth מהותי בהיעדר של חמצן, השיפוע של חמצן התלות (נמדד במ ג/מ מ כספית) מעט שונות עבור קבוצות שונות של הכנת microcrystal. לכן, כיול נדרש עבור כל אצווה מסוימת.
    1. שוקל 60 מ ג של לינק-BuO microcrystals.
    2. לצורך כיול רגישות חמצן, להשעות את microcrystals ב 3 מ"ל של מדיום התקשורת נשר שונה (DMEM) של Dulbecco (בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל), sonicate למשך 5 דקות על הקרח עם sonicator בדיקה ב-20 קילו-הרץ באמצעות כוח W 7 בשפופרת זכוכית 5-mL סיבוב המדרגה.
    3. מקום 1 מיליליטר microcrystals sonicated בכוס צינור ב מהוד סליל משטח של ספקטרומטר EPR L-band (1.2 GHz) ולרכוש רציפה גלים (CW) ספקטרה EPR בטמפרטורה פיזיולוגיים של 37 ° C וחמצן ריכוזים של 0, 1, 2, 4, 8 , ו- 20.9%. לשמור על ריכוז חמצן על ידי מבעבע הפתרון עם תערובת הדלק שהועברו בקר גז ולשמור על הטמפרטורה באמצעות באמבט מים המצורפת תרמוסטט. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה ספקטרומטר EPR: אפנון משרעת, 100 מ ג; אפנון תדר, 100 קילו-הרץ; לטאטא רוחב, 5 G; טאטא זמן, 60 s.
    4. כדי להשיג יחס אות לרעש טוב יותר (SNR), השתמש ערך משרעת אפנון של 60% linewidth (למשל, להשתמש אפנון משרעת 0.6 גרם עבור linewidth של 1g).
    5. אלטרנטיבה פשוטה הליך הכיול: להקליט ספקטרום EPR מבעבע-אוויר ופתרונות אנאוקסיים14. במקרה האחרון, לשמר אנוקסיה הדגימות על-ידי התוספת של גלוקוז 10 מ מ ו- U/mL 100 גלוקוז אוקסידאז לפתרונות בדיקה 1 מ"ל על פי הפניה14.
    6. התאם את ספקטרום EPR עם הפונקציה Lorentzian למצוא את רוחב הקו, LW. להעריך את רמת הרגישות של microcrystals pO2 כמו מדרון של התלות של LW pO2, כלומר בתור הערך (LWאוויר−LWאנוקסיה) /pO2air, איפה LWאוויר LWאנוקסיה הם ספקטרה linewidth בתנאים והאוויר אנוקסיה, בהתאמה; p O2air = 152 מ מ כספית.
  2. פונקציה כפולה בדיקה pH, חמצון-חיזור, ע נ
    הערה: החללית NR הוא מסונתז כפי שמתואר הפניה11. זה יציב בטמפרטורת החדר כמו מוצק והן בפתרונות מימית. החללית NR מסונתז נשמרת ב 4 º C. פיצול hyperfine חנקן, שלNקצב הדעיכה משרעת האות הן הפרמטרים ספקטרלי של המכשיר NR רגישים pH (בדיקה pK = 6.6 ב- 37 מעלות צלזיוס, טווח רגישות pH מ 5.6 7.6) וכדי הקיבולת תוך צמצום של החללית microenvironment, בהתאמה.
    1. הסר את NR מהמקפיא ולאפשר המכולה לחמם לטמפרטורת החדר (10-15 דקות). שוקל לצאת 6.34 מ ג ע נ לפזר זאת בתוך 1 מ"ל של תמיסת מלח, להתאים את רמת ה-pH ל 7.2 עם aliquots קטן של HCl או NaOH באמצעות מד pH. השתמש הפתרון NR מוכן (10 מ מ) כפתרון מניות.
    2. לבצע את הכיול pH של המכשיר ע נ כדלקמן (ראה התייחסות11). ראשית, להוסיף 0.1 מ"ל של הפתרון ע נ מניות 0.9 מ ל 2 מ מ נה-פוספט מאגר, 150 מ מ NaCl. Titrate הפתרון שהושג 1 מ"מ NR עם aliquots של HCl או NaOH עד ה-pH הנדרש באמצעות מד pH. בקרת הטמפרטורה שימוש באמבט מים המצורפת תרמוסטט.
    3. להקליט את ספקטרום EPR של הדגימות צינורות microcentrifuge 1.5-mL באמצעות ספקטרומטר EPR L-band. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה ספקטרומטר EPR: אפנון משרעת, 2.5 G; אפנון תדר, 100 קילו-הרץ; לטאטא רוחב, 60 גרם; טאטא זמן, 20 s.
    4. למדוד את hyperfine פיצול מתמיד (שלN) נחשב לחצי המרחק בין רכיבי נמוך-גבוה-ושדה הספקטרום EPR, לתכנן את זה לעומת ה-pH, כדי לספק את עקומת כיול עבור L-band EPR מדידות pH.
  3. GSH-רגיש RSSR בדיקה
    הערה: החללית RSSR הוא מסונתז כפי שמתואר הפניה15. לאחסן החללית NR מסונתז ב 4 º C. Lipophilic RSSR דיסולפידי biradical מתחם מפזרת בקלות על פני קרום התא להגיב עם GSH תאיים ולספק גישה אמין לקביעת GSH ויוו באמצעות EPR16,17. שיטה זו מבוססת על שיעור תגובה גבוה של הבריכה תאיים הדומיננטית של GSH תיולים עם החללית RSSR. התגובה של biradical RSSR עם פיצולים GSH שלה דיסולפידי בונד (ראה ערכת 1) וכתוצאה מכך ביטול ספין החליפין בין שני קטעים רדיקלית, מתבטא בירידה של הרכיבים ספקטרלי biradical המתאים עלייה של הרכיבים monoradical. עבור המכשיר RSSR biradical, קצב הגידול של משרעת של הרכיב monoradical פרופורציונלי לריכוז GSH והוא נוח GSH-רגיש EPR ספקטרלי פרמטר. כדי להעריך את ריכוז GSH מן המדידות EPR ויוו , הכיול הקודמת של קצב התגובה RSSR עם GSH-טמפרטורה, pH המתאים יש לבצע כדלקמן.
    1. להסיר את RSSR מהמקפיא ולאפשר את המיכל לחמם לטמפרטורת החדר (10-15 דקות). שוקל החוצה 4.05 מ ג נאט ו, לפזר זאת בתוך 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד פתרון. השתמש הפתרון RSSR מוכן (10 מ מ) כפתרון מניות.
    2. לקבוע את הערך של קצב קבוע, kobs, התגובה של RSSR עם GSH-רצוי טמפרטורה, pH כדלקמן.
    3. ראשית, להוסיף 20 µL של הפתרון מניות RSSR (10 מ מ) 0.98 מ של 1 מ מ נה-פוספט מאגר, pH 7.2, 150 מ מ NaCl, כדי להשיג של 0.2 מ מ RSSR בדיקה פתרון.
    4. להכין פתרונות של 1, 2 ו- 5 מ מ ריכוזים של GSH במאגר Na-פוספט 0.1 M ב- pH 7.2. להעריך במדויק ריכוז GSH בתאים של האיבר יישוב מן המדידות ויוו , הכיול במבחנה חייב להתבצע ב- pH קרוב הערך של החומציות תאיים.
    5. מערבבים נפחים שווים של 0.2 מ מ RSSR פתרון אחד הפתרונות GSH מוכן בשלב 1.3.4. עבור סופי ריכוז של החללית 0.1 מ"מ ושל GSH-0.5, 1 או 2.5 מ מ.
    6. מיד לאחר RSSR ו GSH פתרון ערבוב, למקם את הדגימה מהוד EPR והקלטה של ספקטרום EPR מדי 12 שניות ל-10 דקות. ואז לחשב את קינטיקה של העלייה של משרעת ספקטרלי monoradical. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה ספקטרומטר EPR: אפנון משרעת, 1 G; אפנון תדר, 100 קילו-הרץ; לטאטא רוחב, 60 גרם; טאטא זמן, 10-60 s.
    7. להתאים את קינטיקה EPR נמדד כדי monoexponents ולחשב את קבוע הזמן של קינטיקה מעריכית, τ. רגרסיה ליניארית (1/τ = kobs × [GSH]) מספק ערך קבוע שנצפה קצב התגובה בין GSH RSSR (למשל, ב 34 מעלות צלזיוס ו- pH 7.2, kobs = 2.8 ± 0.2 מ' s-1-1)11.
  4. בדיקה רב תכליתיים תקווה pO2, ה-pH של הערכת Pi
    הערה: Trityl monophosphonated תקווה בדיקה הוא מסונתז כפי שמתואר הפניה12 ולא נשמרת ב 4 º C. ספקטרום CW EPR של תקווה ב pH << pK (- חומצה טופס) ו- pH >> pK (B - טופס בסיסי) מיוצגים על ידי doublets עקב פיצול,Phyperfine זרחן. ההגדרות כלי טיפוסי הם כדלקמן: אפנון משרעת, 37.5 מ"ג; אפנון תדר, 100 קילו-הרץ; לטאטא רוחב, 0.9 G; טאטא זמן, s 20-60. ב- pH ביניים (5 < pH < 8) הספקטרום EPR של תקווה בדיקה מאופיין על ידי הרביעייה כאשר הן A ו- B הברית נוכחים. Linewidth EPR בודדים של התקווה הוא סמן2 pO (דיוק, ≈ 1 מ מ כספית; p O2 טווח, 1 ל- 100 מ מ כספית). השבר של protonated תקווה (טופס) הוא סמן pH בטווח של בין 6 ל- 8.0 (דיוק, ± 0.05). הערך של פרוטון שער החליפין (מבוטא במ ג) עם Pi שחולצו על ידי סימולציה ספקטרה הוא סמן Pi (דיוק, ± 0.1 מ מ, טווח, 0.1-20 מ מ). כיול הפרוצדורות מתבצעות על טמפרטורה פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס), פתרון כוח יונית (NaCl, 150 מ מ), וריכוז תקווה בדיקה של 0.2 מ מ, כפי שתואר קודם לכן הפניות12,18, שיפורטו להלן.
    1. להסיר את המכשיר תקווה מהמקפיא ולאפשר את המיכל לחמם לטמפרטורת החדר (10-15 דקות).
    2. שוקל לצאת 10.7 מ ג של המכשיר תקווה להמיס ב 1 מ"ל של תמיסת מלח, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4. הוסף 20 µL של הפתרון מניות מוכן של התקווה (10 מ מ) 0.98 מ של תמיסת מלח כדי להשיג של 0.2 מ מ תקווה בדיקה פתרון.
    3. עבור בדיקה וכיול של ה-pH, titrate 0.2 מ מ של הפתרון בדיקה תקווה על ידי התוספת של נפח קטן של NaOH או HCl, עם דילול הסופי של המדגם פחות מ 1%. למדוד את רמת החומציות עם אלקטרודות pH מכויל ב 37 ° C באמצעות ערכי pH עבור הפתרון הפניה מומלץ על ידי נבחרת הלשכה של סטנדרטים (ארה ב). השתמש גביע במקטורן התגובה המצורפת של סירקולטור לשמור בקפידה על טמפרטורה של הפניה ופתרונות טיטרציה במהלך מדידות pH. לשמור על תנאים אנאוקסיים על ידי התוספת של גלוקוז 10 מ מ ו- U/mL 100 גלוקוז אוקסידאז פתרונות בדיקה.
    4. רוכשים את ספקטרום EPR של הצורות A ו- B ב- pH ≤ 5 ו- pH ≥ 8, בהתאמה, בתנאים אנאוקסיים בהיעדרו של פוספט.
    5. השתמש ספקטרום המתאימים להשגת פרמטרים ספקטרלי מהותי. כלומר, לדמות את הרחבות ספקטרליות כ קונבולוציה של הפונקציה Lorentzian עם הפונקציה גאוסיאנית המעריכה את מבנה hyperfine סופר לא פתורות של המכשיר תקווה. ההתאמה של ספקטרום EPR מחושב כדי ספקטרום ניסיוני התשואות הערכים שלP ו- Lorentzian linewidth (ΔLעמ'), יקבע את שיעור הרפיה רוחבי, 1/T2 (איפה 1/T2 = pp (√3/2) L עבור הנגזרת מדודה של הקו הקליטה RF ב CW EPR), ולא את linewidth Gaussian הפצה, ג'י
      הערה: להלן הפרמטרים המתקבל ספקטרום נמדד לתנאים שצוינו בשלב 1.4.2:P(A) = 3.63 ש G,P(B) = 3.37 G; 1/T2(א) = 23.6 mG; 1/T2(B) = 9 מ ג; G(A) = 40 מ"ג; G(B) = 45 מ ג (ראה התייחסות8).
    6. לרכוש את ספקטרום EPR של התקווה ב- pH ביניים (5 < pH < 8). לדמות הרכיב הגיש גבוהים הספקטרום EPR הנרכש באמצעות תורת החליפין בין מספר אתרים במערכות שאינן מצמידים או רופף בשילוב הותאם הפניה19 שתואר לעיל18. שימוש הפרמטרים מהותי השיג עבור A ו B הברית (ראה שלב 1.4.5) כדי להקטין את מספר משתנים. מתאים ספקטרום מחושב לאלה ניסיוני כדי לחפש את הערכים של השבר (pA), להתוות את התלות של הערךA p pH. להשתמש את התלות של pA pH במחקרים נוספים כמו עקומת כיול pH.
      הערה: התאמת התלות ה-pH של pA עם עיקול רגיל טיטור מספק את הערך של דיסוציאציה קבועה, pK (תקווה) = 6.98. אין ויוו מחקרים, רכישת ספקטרום EPR מלאה של המכשיר תקווה אינה מעשית בגלל הזמן הנוסף כדי להשיג את הפער בין מרכיבי hyperfine זרחן פיצול בספקטרום EPR נמוך-גבוה-ושדה. לכן, עוד ביטוי במחקרים רק הגיש גבוהה הרכיב של הספקטרום EPR יש כבר ומודדים ומנתחים.
    7. עבור בדיקה וכיול של pO2, רוכשים EPR ספקטרום של החללית תקווה בריכוזים שונים של חמצן.
    8. ערכי בקרה pO2 הפתרונות על ידי מבעבעים עם תערובת הדלק שהועברו בקר גז. בקרת הטמפרטורה הפתרון (37 ° C) תוך שימוש באמבט מים המצורפת תרמוסטט.
    9. הדמיית ספקטרום EPR ובכושר אותם לאלה ניסיוני כפי שמתואר בשלב 1.4.6 כדי לקבוע את הערכים של חמצן-induced הרפיה המחירים.
      הערה: הערכים של חמצן-induced הרפיה המחירים היו 0.49 מ ג/מ מ כספית הן עבור A ו B צורות של התקווה בדיקה כפי שנמדד ב- 37 מעלות צלזיוס8.
    10. עבור בדיקה וכיול של [Pi], רוכשים EPR ספקטרום של החללית תקווה בריכוזים שונים של פוספט. השתמש הפתרון הרדיקלי תקווה עם ערך pH ליד pK (pK = 6.9 ב 37 מעלות צלזיוס)18 , titrate זה עם ריכוזים שונים של פוספט. לשמור על ההרכב טמפרטורה וגז כמתואר לעיל צעדים.
    11. הדמיית ספקטרום EPR ובכושר אותם לאלה ניסיוני כפי שמתואר בשלב 1.4.6 כדי לקבוע את הערכים של Pi-induced שער החליפין.
      הערה: התלות של שער החליפין Pi-induced [פי] משמש כיול במחקרים נוספים.

2. העכבר מודלים של סרטן השד

  1. מודל הגידול ספונטנית MMTV-תשלום
    1. להשתמש בשבוע 4-8-בן נקבה חבר וירוס מסוג B רגישות/NIH (FVB/N) העכבר הגידול החלב וירוס יזם (MMTV) polyoma התיכון-T אנטיגן (תשלום +) עכברים עם גידולים החלב נוצר באופן ספונטני ללימודי EPR ' ויוו .
    2. לשם השוואה של רקמת microenvironments של בלוטות מוגדלות נורמלי גידולים, להשתמש littermate תואם גיל נקבות בנכונותם אונקוגן (PyMT−, "wild סוג") תשלום20.
    3. נושא העכברים L-band EPR ספקטרוסקופיה פעם בשבוע במשך ארבעה שבועות במהלך הרדמה איזופלוריין (ראה בדיקה משלוח להלן).
    4. עזים ומתנגד העכבר באמצעות תערובת אוויר-איזופלוריין (3% איזופלוריין), ומניחים את העכבר על טבלת מתכווננת בתנוחה הנכונה, לרוחב עם הגידול (בלוטות מוגדלות) קרוב מהוד סליל משטח.
    5. לאחר מיקום העכבר, לנהל את המכשיר על-ידי הזרקת intratissual (טכנולוגיית מידע), לכוון את ספקטרומטר EPR, לרכוש את ספקטרום EPR למשך 5-10 דקות.
    6. למדוד את 2-3 גידולים החלב (מ- MMTV-תשלום + עכברים) או שאינו הגידול הנושאת עטין (מתוך PyMT− עכברים) במהלך אותו סשן EPR.
  2. מודל הגידול Orthotopic MET-1
    1. לגדל תאים סרטניים בשד מאתר רקע Met-1 FVB/N ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות יחסית ב DMEM המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), אינסולין µg/mL 10, rhEGF ננוגרם למ"ל 5 ו 1% PSA (פניצילין G נתרן גופרתי סטרפטומיצין, המפוטריצין) כדי ~ 80% הנהרות בבקבוקון T175.
    2. האחות התקשורת ולשטוף את תאים חסיד עם 10 מ"ל PBS (מ מ 1.54 ח'2PO4, 155 מ מ NaCl ו מ מ 2.71 נה2HPO4-7 H2O ללא סידן כלורי או מגנזיום כלוריד, pH = 7.4).
    3. ניתוק התאים על ידי הוספת 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון, נדנדה את הבקבוקון. כאשר התאים מנותקים, להוסיף 10 מ"ל DMEM המכיל 10% FBS הבקבוקון ולאסוף את התאים.
    4. Centrifuge התליה תא ב x 132 g 10 דקות ב 4 º C. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ו resuspend עונה 1 פרק 106 תאים לכל 100 µL DMEM מינימלי.
    5. באמצעות על מזרק אינסולין (המחט 29G 1/2), לאט לאט להזריק 100 µL של השעיה תא הגידול לתוך הידיות החלב מספר 4 השמן של עכברים פראי סוג של FVB/N נקבה בת שבוע 8.
    6. לפקח על הגידול חניכה על ידי מישוש (מופיע לאחר כ- 2-3 שבועות), צמיחה (חזותי), והית העכבר (visual) בכל יום.
    7. למדוד את ממדי הגידול פעם בשבוע באמצעות מחוגה ולקבוע הגידול אמצעי אחסון באמצעות המשוואה:
      figure-protocol-13564

3. לחקור את משלוח In Vivo פונקציונלי מעבדתיים

  1. השימוש חלקיקים לינק-BuO בדיקה (פרוטוקול אני) למדידות2 pO orthotopic דגמים הגידול על ידי השתלת תאים סרטניים עם לינק למביטה-BuO microcrystals כאמור תיאר14,21 , שיפורטו להלן.
    1. במקרה של המודל הגידול MET-1, הפנמה של לינק-BuO microcrystals לתוך תאים MET-1, להשעות את לינק-BuO microcrystals ב DMEM-ריכוז של 20 מ"ג/מ"ל, sonicate עם sonicator המכשיר ב-20 קילו-הרץ באמצעות כוח W 7 צינור עגול-התחתון 5-מ"עמ עבור 5 דקות על קרח.
    2. להוסיף 100 µL (2 מ"ג של BuO-לינק) של ההשעיה בקבוקון T75 עם 10 מ"ל תרבות המדיה המכילה תאים MET-1 (כ 30% confluent). כל ההליכים יתקיים ב- cabinet אבטחה ומכיל המדיה פניצילין, סטרפטומיצין כדי לצמצם זיהום פוטנציאליים.
    3. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 72 h או עד שהם מגיעים ~ 80% confluency.
    4. האחות התקשורת. לשטוף את התאים חמש פעמים עם 10 מ"ל PBS. ניתוק התאים עם 5 מ"ל טריפסין-EDTA. לאסוף את התאים. צנטריפוגה כפי שמתואר בשלב 2.2.4 לעיל. כתם דגימה של תאים עם אי-הכללה של צבע כדי לקבוע תא הכדאיות וכמות.
    5. להשעות את התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 106 לכל 100 µL DMEM מינימלי.
    6. באמצעות על מזרק אינסולין, לאט לאט להחדיר µL 100 של השעיה התא המכיל את microcrystals לינק-BuO למביטה לתוך הידיות החלב מספר 4 השמן של בן שבוע 8 FVB/N הנשי פראי סוג עכברים כפי שמתואר בשלב 2.2.5.
    7. לפקח על הגידול חניכה וצמיחה כפי שתואר בשלבים 2.2.6 ו 2.2.7.
  2. השימוש חלקיקים לינק-BuO בדיקה (פרוטוקול II) או ספונטני או מודלים orthotopic. להזריק לינק-OBu microcrystals באתר של עניין, למשל, לתוך בלוטות מוגדלות נורמלי או גידולים החלב, באמצעות על מזרק אינסולין.
  3. הגששים מסיסים
    1. עזים ומתנגד העכברים על ידי שאיפה של תערובת אוויר-איזופלוריין (משלוח 1.0 L/min ו- 2-3% איזופלוריין) באמצעות הרדמה של מכונת ולמקם אותם לתוך הפער של ספקטרומטר EPR.
    2. לכוון את המכשיר ולאחר מכן מזריקים את ע נ (10-30 µL, 10 מ מ), תקווה בדיקה (10−30 µL, 0.5-2 מ מ) תמיסת מלח, pH 7.2 או בדיקה RSSR בפתרונות דימתיל סולפוקסיד (10 µL, 10 מ מ) (טכנולוגיית מידע).

4. in Vivo מדידות פונקציונלי

  1. למדידות ספקטרוסקופיות EPR, עזים ומתנגד העכברים באמצעות אינהלציה של תערובת אוויר-איזופלוריין באמצעות מכונת הרדמה כפי שמתואר בשלב 3.3.1.
  2. לבצע מדידות פונקציונלי באמצעות ספקטרומטר EPR L-band (1.2 GHz) כדלקמן.
    1. מקום מהוד סליל משטח של בלוטת חלב רגיל או גידול החלב, לכוון את ספקטרומטר.
    2. רוכשים ספקטרום EPR מן החללית חלקיקי מושתל 5−10 דקות במשך מספר שבועות לאחר ההשתלה. במקרה של הגששים מסיסים, רוכשים ספקטרום EPR מיד לאחר בדיקה ההזרקה למשך 5-10 דקות.
    3. נתח ספקטרום EPR של המכשיר NR כדי למצוא את hyperfine, פיצול,N, ו משרעת האות, I(t). להמיר את הערך שלN של ערך ה-pH באמצעות עקומת כיול שהושג בשלב 1.2.4. לנתח את קצב הריקבון של משרעת האות I(t) כמו השינוי היחסי של משרעת הראשונית, I(t = 0), מחושב ביחידות שרירותי לשניה (s-1).
    4. להתאים את הגידול של רכיב ה-monoradical של הספקטרום EPR של GSH-רגיש RSSR האשים monoexponents כדי להשיג את קבוע הזמן של קינטיקה מעריכי כדי לחשב ריכוז GSH.
    5. התאם את ספקטרום EPR של רכיב גבוה-שדה של המכשיר תקווה רב תכליתיים לאלה ניסיוני כפי שמתואר (שלב 1.4.5) להניב את הערכים של ה-pH, pO2 ל- Pi.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. לבצע עיבוד נתונים וניתוחים סטטיסטיים. לשימוש ניתוחים מתאם פירסון r מבחן המתאם (עבור כלל מופץ datasets), ספירמן נמצא דרגה סדר מיתאם (עבור datasets עם שנדחו נורמליות של התפלגות נתונים).

תוצאות

רקמה p O 2 רגשים הערכה באמצעות לינק-BuO:

באמצעות ההליך המתואר תחת שלב 1.1, ביצענו הכיול של הבולם microcrystals לינק-BuO המוכנים באופן טרי. איור 2 מציג את התלות חמצן טיפוסי של linewidth...

Discussion

השיטות שהוצגו לאפשר לא פולשנית ויוו הערכת פרמטרים קריטיים של טיים כימי, כלומר pO2pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של interstitial Pi ו GSH תאיים. טכניקות תהודה מגנטית, כגון MRI ו- EPR נמוך-השדה, הן שיטות הבחירה לא פולשנית ויוו בניית פרופיל של פרמטרים אלה טיים. MRI מדמיין מבנים אנטומיים אבל ח?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומן בחלקו על ידי NIH מעניקה CA194013, CA192064 ו- U54GM104942. WVCTSI הוא הודה על סטארט-אפ ועד VVK, AB, ו- TDE. המחברים תודה ד ר מ' Gencheva ק' שטיינברגר על הסיוע עם הניסויים המחשה. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-band EPR spectrometerMagnettech, GermanyL-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller Noxygen, GermanyTemperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
SonicatorFisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced)Sigma-AldrichG4251
MMTV-PyMT  miceIn house
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Met-1 murine breast cancer cellsIn house
C57Bl/6 wild type mice Jackson Laboratory
TrypsinThermo Fisher Scientific25200056
Trypan Blue Exclusion Dye Thermo Fisher ScientificT10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo)Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS9763
Sodium phosphate monobasicsigma-AldrichS07051
Sodium Chloridesigma-AldrichS7653
Hydrochloric acidsigma-Aldrich320331
Sodium Hydroxidesigma-AldrichS8045
Glucosesigma-Aldrich
Glucose oxydasesigma-Aldrich
Lauda Circulator E100Lauda-Brikmann
pH meter OrionThermo Scientific 
LiNc-BuO probeIn houseThe Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probeIn houseThe Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probeIn houseThe di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probeIn houseThe monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

References

  1. Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133nitroxidetritylpHmicroenvironment

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved