טיפול ונקומיצין טעון סולפט סידן ועצמות Autogenous במודל משופר הארנב של זיהום עצם

Summary

מחקר זה מציג את הארנב משופרת של מודל נגוע Staphylococcus aureus על ידי חסימת את אותה כמות של חיידקים במח העצם. סולפט סידן ואנקומיצין טעון ועצמות autogenous משמשות לטיפול ותיקון אנטיביוטיקה ועצמות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל עבור הלומדים העצם זיהום והתחדשות.

Abstract

עצם התוצאות זיהום מפני פלישה חיידקים, אשר קשה מאוד לטפל בחדר ניתוח הקליני, אורטופדי, טראומטי. הזיהום העצם עלולה לגרום לדלקת ממושכת, דלקת עצם מוגלתית, והמעלית העצם בסופו של דבר. הקמת מודל בעלי חיים ריאלי לשחזור חשובה עצם זיהום מחקר וטיפול אנטיביוטי. כמודל ויוו, דגם ארנב נעשה שימוש נרחב במחקר זיהום של העצם. עם זאת, מחקרים קודמים על הארנב עצם מודלים זיהום כי מצב זיהום הוא לא עקבי, כמו גם כמות החיידקים משתנה. מחקר זה מציג שיטה כירורגית משופרת עבור גרימת זיהום עצם על ארנב, על ידי חסימת החיידק במח העצם. לאחר מכן, הערכות רשתי יכול להתבצע כדי לאמת את שיטת הדוגמנות.

באופן כללי, להסיר רקמות מתות רקמת נמק, השרשה של סידן טעון ואנקומיצין סולפט (VCS) הם השולט טיפול אנטיביוטי. למרות סולפט סידן ב VCS הטבות osteocyte זוחלים, צמיחת עצם חדשה, עצם מסיבית פגמים להתרחש לאחר להסיר רקמות מתות. עצם autogenous (אלב) היא אסטרטגיית מושך כדי להתגבר על עצם פגמים לטיפול של פגמים עצם מסיבית לאחר להסיר רקמות מתות נמק עצם.

במחקר זה, השתמשנו בעצם הזנב כמו עצם autogenous הושתלו בתוך עצם הפגם. עצם תיקון נמדדה באמצעות מיקרו-מחושב-טומוגרפיה (מיקרו-CT) וניתוח היסטולוגית לאחר להקריב חיה. כתוצאה מכך, בקבוצה VCS, עצם והמעלית בעקביות הושג. לעומת זאת, האזורים פגם עצם בקבוצה VCS-AB ירדו באופן משמעותי. שיטת מידול נוכח תיאר שיטה לשחזור, ריאלי, יציב כדי להכין מודל זיהום של העצם. הטיפול VCS-AB הביא נמוכים, והמעלית עצם לאחר טיפול אנטיביוטי. המודל זיהום עצם משופרת והטיפול שילוב של VCS ועצמות autogenous יכולים להיות לעזר בלימוד מנגנוני כבסיס זיהום ועצם התחדשות העצם הרלוונטי ליישומים אורתופדיים טראומה.

Introduction

דלקת העצם נובע בדרך כלל חיידקים או אחרים הפלישה מיקרואורגניזם לאחר טראומה, שבר או מחלות אחרות עצם¹. עצם זיהום עלול לגרום רמה גבוהה של דלקת והרס רקמות העצם. במרפאה, Staphylococcus aureus (S. aureus) הוא סוכן סיבתי הדומיננטית של העצם זיהום^2,3. הזיהום עצם מכאיב, מתישה, ולוקח בדרך כלל קורס כרונית קשה מאוד לטפל⁴. בזמן הנוכחי, הטריה של רקמת נמק, השתלת של סידן טעון ונקומיצין (VCS) חרוזים אושרו כמו אסטרטגיית יעיל לשליטה זיהום מקומי^5,6. עם זאת, 10% עד 15% מהמטופלים חוו של תהליך התיקון עצם ממושך, מתעכב איחוד או והמעלית לאחר טיפול נגד זיהום⁷. קטע גדול של פגם עצם הבעיה הקשה ביותר מנתחים אורטופדיים. שתל עצם אוטולוגי נחשב התחליף האופטימלי עצם עצם הטיפול, והמעלית^8,9.

נכון להיום, רוב המחקרים על עצם זיהום, עצם אוטולוגי השרשה נערכו בסוגים שונים של מודלים בעלי חיים, כגון חולדות, ארנבים, כלבים, חזירים, כבשים^10,11. ארנב מודלים הנפוץ ביותר ללימודים דלקת העצם, כמו הראשונה שבוצעה על-ידי נורדן, קנדי בשנת 1970^12,13. במחקר הקודם שלנו, השתמשנו מודלים ארנב בעקבות השיטה של נורדן, מצאנו כי הכמות של S. aureus מוזרק מח העצם יכול לא ניתן לכמת במדויק, כפי דולף הדם. מח עצם הוביל חיידקים פתרון גלישה.

מאמר זה מציג שיטה כירורגית משופרת עבור גרימת זיהום עצם על ארנבים. בסופו של ההליך, בדיקת דם לביוכימיה, בדיקה בקטריולוגית של היסטופתולוגיות בוצעו כדי לאמת את המודל זיהום של העצם. לאחר מכן, VCS הושתל לעכב זיהום, עצם autogenous הושתל לקדם התחדשות העצם.

Protocol

ארנבים השתמשו במחקר הנוכחי טופלו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל ההליכים ניסיוני הובילו את החוקים של ביואתיקה הוועדה של ג'ה-ג'יאנג האקדמיה של הרפואה הסינית המסורתית.

1. הכנת ההשעיה חיידקי

1. להמיס 0.5 מ ג של S. aureus ליופיליזציה אבקת (בקרת האוויר 6538) עם mL 0.3 לוריא-Bertani תרבות בינוני. מערבבים התלוי לחלוטין.
2. צובעות את המתלים חיידקים על פלטות אגר סויה tryptic, דגירה מושבות חיידקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
3. בחר מושבת חיידקים יחיד ויוצרים יחידה (CFU) ותרבות סויה tryptic צינורות מרק עבור ה 24 בצע גלובלי עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ולקבל אמצע-לוגריתמי הצמיחה חיידקים שלב לאחר 16 עד 18 h, כאשר ערך צפיפות אופטית (OD) הוא 0.6-600 nm ¹⁴.
4. העברת 1 מ"ל של השעיה חיידקים לתוך שפופרת צנטרפוגה. צנטריפוגה למשך 5 דקות-825- g ו- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend. ולשטוף את החיידקים עם µL 100 תמיסת פוספט buffered (PBS); חזור על שלב זה 3 פעמים. לבסוף, resuspend חיידקים עם 3 מ"ל של PBS.
5. מעריכים את ריכוז החיידקים באמצעות של מקפרלנד turbidimetry¹⁵.
   1. העברת 100 עד 500 µL של חיידקים השעיה צינור ערכי צבע מוחלטים עד עכירות שווה מקפרלנד 0.5 סטנדרטי.
   2. להעריך עכירות על ידי השוואה חזותית מקפרלנד 0.5, התוכן של חיידקים מגיע כ-10⁸ CFU/mL.
      הערה: ודא כי אמצעי האחסון של חיידקים השעיה מספיקה עבור הפרוטוקולים הבאים. עבור כל ארנב, הנפח של חיידקים ההשעיה היא פחות מ 1 מ"ל.
6. להעביר 0.2 מ"ל של השעיה חיידקי צלחת אגר ולהחיל אותו באופן שווה. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 ח ספירת מושבות חיידקים כדי לאמת את CFU של חיידקים השעיה.

2. הכנת מודלים זיהום עצם

1. לשמור זכר בניו זילנד וארנבים לבנים, בגיל 3 חודשים, בכלובים בודדים, תחת תנאים אוויר מבוקר (20 ± 1 ° C) ו- h 12 h 12 מחזורים תאורה בהירה-כהה. מציעים דיאטה שגרתית, ברז מים מדי יום.
2. להבטיח כי בזמנו של הניתוח כי הארנב שוקל יותר מ- 3 ק ג.
3. להרדים ארנבים באמצעות בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל (3 מ ג לכל 100 גרם של משקל הגוף). ודא ארנבים הם מורדם לחלוטין על ידי כשל להגיב הפינצ כפת. לתקן את הארנבים על שולחן הניתוחים במהלך מבצע הליך.
   הערה: ודא לדוגמנות משך ההליך הוא פחות מ 1 h.
4. גילוח באזור השוקה צינתור באמצעות מכונת גילוח חשמלית נגד כיוון צמיחת השיער. לחטא את העור על-ידי החלת פתרון povidone יוד.
5. סמן את החלק העליון של עצם השוקה ואת המיקום חור הקידוח להזרקה עם S. aureus (המרחק לקצה העליון של עצם השוקה הוא 1.5 ס מ) עם עט, השליט. ודא מיקומי החורים קידוח נמצאים בליבה השוקה אופקית (איור 1א').
6. שוקה העור באמצעות איזמל מס 11 גזורה עושים חתך 1 ס מ ב קרום העצם (איור 1ב, ג). פונץ ' חור בקוטר 2 מ מ עצם השוקה באמצעות יחידת מקדחה חשמלית עצם (איור 1D).
7. הקש את החורים בקוטר 2 מ מ השוקה עם גליל של שעווה לאיטום של 2 מ מ קוטר וגובה 2 מ מ (איור 1E). הסר את השעווה חילוף עצם לאורך מישור אופקי השוקה (איור 1F). בדוק החור 2 מ מ מלא שעווה לאיטום (איור 1G).
   הערה: להבטיח כי החורים מלאים של שעווה לאיטום בבדיקת החור עם או בלי דם גלישה.
8. לתפור קרום העצם, עור בעל תפירה שנספג בתפר המזרן אנכי כדי למנוע את החיה לועס את התפרים (איור 1H).
9. להזריק עונה 1 פרק 10-⁸ CFU/mL של S. aureus פתרונות (30 µL לכל 100 גרם של משקל הגוף) עם מזרק asepsis 1 מ"ל (איור 1אני). ודא המחטים לחדור את השעווה עצם להזריק את הפתרון S. aureus לתוך מח עצם לאט.
10. שמור את החיה בתנאים חמים ונקיים כדי למנוע איבוד חום לאחר דוגמנות. לפקח על קצב הנשימה וקצב הלב. לאחר, מתעוררת בית הארנבים בכלובים בודדים עם גישה חופשית מזון ומים.

3. הערכה של מודל זיהום עצם

1. ימים 7, 14, 21, 28 לאחר ההדבקה, למקם ארנבים המתקנת ארנב עם ראשו ועל אוזנו מחוץ המתקנת.
2. לצייר 2 מ"ל של דם מן הורידים אזני אל גורם מכיל של dipotassium ethylenediaminetetraacetic קרישה דם (EDTA-K2) חומצה. צייר 1 מ"ל של דם מן כלי דם לתוך מיכל דם. Centrifuge את הנסיוב 10 דקות עם מהירות של x 651 g בטמפרטורת החדר.
   1. לקבוע בספירת תאי הדם הלבנים (WBC) בדם שלם באמצעות מנתח הביוכימי דם, חלבון מגיב C (חלבון) מאת מקושרים-אנזים immunosorbent assay שיטה (אליסה)¹⁶.
3. ימים 7, 14, 21, 28 לאחר ההדבקה להרדים אחד דגם ארנב עם סודיום פנטוברביטל במינון של 3 מ"ג לכל 100 גרם במשקל הגוף. שוקה העור באמצעות איזמל מס 11 גזורה עושים חתך 2 ס מ ב קרום העצם (איור 2א).
4. שעווה לאיטום נקי. הרקמה המתה נמק עצם באמצעות חבטות שני חורים בקוטר של מ מ 4.8 סמוכים, באמצעות יחידת מקדחה חשמלית עצם (איור 2B). הרקמה המתה נמק במח העצם ואת רקמות פרור באמצעות כפית עצם (איור 2C).
   הערה: רקמת העצם נקייה במהלך הטריה להימנע רקמת העצם שנותרה במח העצם.
5. לגרד ולנקות את רקמת העצם בין שני החורים (איור 2D).
6. מורחים 1 מ"ל של מח העצם על פלטות אגר דם כבשים. דגירה צלחות בן לילה ב 37 º C. בחר צלחות של המושבות 30-300, לחשב את מספר מושבות.
7. בקצה של 28 יום לאחר ההדבקה, לחלץ שוקה דגימות בשולי המפרקים בברך ובקרסול. לתקן את דגימות שוקה ב 4% paraformaldehyde עבור ה 24 Decalcify דגימות שוקה EDTA 10% למשך 8 שבועות.
8. מייבשים את דגימות שוקה בסדרה מדורגת של אתנול דילולים ולאחר מכן הטבע בפרפין. חותכים 4 ברציפות 5 מיקרומטר סעיפים מן המטוסים הילתית. כתם מקטעים עם hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת ערכת.
9. השתמש במיקרוסקופ כדי להציג את סעיפים מוכתמים ולהקליט המשודרת אור תמונות עם תוכנה סטנדרטית.

4. הכנת חרוזים VCS

1. להוסיף 1 גר' אבקה הידרוכלוריד ואנקומיצין 9.5 גר' סולפט סידן יש לזה סיווג רפואי, ולאחר מכן להוסיף 3 מ"ל של תמיסת מלח אל הכוח מעורבת. לערבב אותם ביסודיות עם מרית במשך 30 עד 45 s.
2. מקם את המוצר מעורב לתוך תבנית גמישה סיליקה ג'ל (גליל של 4.8 מ"מ קוטר וגובה 4.8 מ"מ) ולאחר יבש בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות להסיר את החרוזים VCS על ידי כיפוף העובש.

5. השרשה של עצם Autogenous וטיפול אנטיביוטי

1. להרדים דגם ארנבים עם סודיום פנטוברביטל במינון של 3 מ"ג לכל 100 גרם משקל ביום^ה 28 לאחר ההדבקה. גילוח באזור השוקה צינתור באמצעות מכונת גילוח חשמלית. לחטא את העור על-ידי החלת הפתרון povidone יוד.
   הערה: ודא כי הנוהל הדוגמנות אינו פחות מ 1 h.
2. גילוח באזור הזנב באמצעות מכונת גילוח חשמלית ולחטא את הזנב על-ידי החלת הפתרון povidone יוד.
3. לחתוך את הזנב באמצעות מספריים כירורגיים. לחתוך את הזנב העור באמצעות איזמל מס 11 ולחשוף את עצם הזנב. . אתפור את העור-באזור הזנב בתפרים נספגים כירורגי בתפר המזרן אנכי כדי למנוע את החיה לועס את התפרים.
4. הסר כל שריר, רקמות רכות, קרום העצם. לנתק את עצם הזנב כל מפרק ולהעביר שהרסיס צלחת פלסטיק 100 מ מ המכילה מלח סטרילית.
5. שתל 4 חתיכות של VCS חרוזים (גליל של 4.8 מ"מ קוטר וגובה 4.8 מ"מ, 1.25 מ ג ונקומיצין לכל פיסת חרוז) לתוך חלל מוח באמצעות פינצטה מעוקל (איור 2E).
6. למלא את הפגם עצם עם 8 חתיכות של עצמות autogenous (גליל בקוטר 2 מ מ, גובה 4 מ מ לכל כל חתיכה) באמצעות מעוקל פינצטה (איור 2E).
7. לתפור קרום העצם, עור בעל כירורגי נספגים בצורה תפר המזרן (איור 2F).
   הערה: לשמור על הטמפרטורה 25 ° C במהלך הניתוח.
8. שמור את החיה בתנאים חמים ונקיים כדי למנוע איבוד חום לאחר ניתוח. לפקח על קצב הנשימה וקצב הלב. לאחר, מתעוררת בית הארנבים בכלובים בודדים עם גישה חופשית מזון ומים.

6. הערכות של פעילות לאנטיביוטיקה

1. מכניסים ארנבונים מתקן ארנב, ולמקם את ראשו ועל אוזנו מחוץ המתקנת 2, 4, 6 ו- 8 שבועות לאחר הטיפול.
2. דם מן הוורידים אוריקולארית עם EDTA-K2 כלי דם קרישה. צייר 1 מ"ל של דם מן כלי דם לתוך מיכל דם. Centrifuge את הנסיוב 10 דקות עם מהירות של x 651 g בטמפרטורת החדר.
3. לקבוע את ספירת תאי הדם הלבנים (WBC) בדם שלם באמצעות מנתח הביוכימי דם, חלבון מגיב C (חלבון) על-ידי מטוס בשיטת ELISA¹⁶.

7. הערכות של התחדשות העצם

1. המתת חסד ארנבים באמצעות הזרקת עם מעל במינונים של סודיום פנטוברביטל, בקצה של 8 או 12 שבועות לאחר הטיפול.
2. תמצית דגימות השוקה, בשולי המפרקים בברך ובקרסול. הרקמה המתה השרירים ושכבות fascial.
3. ניתוח המבנה של שוקה באמצעות טומוגרפיה שחושב מיקרו (מיקרו-CT). לבחור של אזור אליפטי 4.8 מ"מ קוטר של 9.6 ארוך אזור בעל עניין (ROI). לשחזר תמונות דגם התלת-ממד באמצעות מפת סיביות נתונים.
4. בחרו עשרות רבות של היחס בין נפח אחסון/רקמות עצם (BV/טלוויזיה), עובי trabecular (Tb.Th), trabecula (Tb.N) ומספר ההפרדה trabecular (Tb.Sp)from the3D מודלים להערכת התחדשות העצם.

תוצאות

הערכה של מודל זיהום עצם
לאחר זיהום עם S. aureus, ביטויים פתולוגיים ארנבים היו הדומה הסימפטום הייצוגי ביותר של דלקת עצם מוגלתית כרונית במרפאה. במחקר שלנו, ארנבים 30 היו נגועים, נתון כקבוצה מודל, ונחשפו ארנבים 10 היו כמו חיות בקרת. כל הארנבונים דגם יש נגוע הסינוסים ...

Discussion

במחקרים קודמים, נבנו סוגים שונים של מודלים בעלי חיים כדי ללמוד הן זיהום אקוטי וכרוני העצם; עם זאת, חפש את המודל האידיאלי עדיין נמשכת^17,18. בנוסף, המודל זיהום עצם אידיאלי צפוי לדמות את מאפייני פתולוגי של העצם זיהום בסביבה קלינית, תוך התקופות הדוגמנות, להישאר זול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180