Tratamento com vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno em um modelo melhorado coelho de infecção óssea

Resumo

Este estudo apresenta um melhoria coelho modelo infectado com Staphylococcus aureus , bloqueando a mesma quantidade de bactérias na medula óssea. Vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno são utilizados para tratamento de reparação de antibiótico e osso. O protocolo pode ser útil para estudar a infecção óssea e regeneração.

Resumo

Infecção óssea resulta da invasão bacteriana, que é extremamente difícil de tratar em cirurgia clínica, ortopédica e traumática. A infecção óssea pode resultar em inflamação sustentada, osteomielite e osso eventual não-sindicalizados. Estabelecimento de um modelo animal viável, pode ser reproduzido é importante para pesquisa de infecção e tratamento antibiótico de osso. Como um modelo in vivo, o modelo de coelho é amplamente utilizado na investigação de infecção óssea. No entanto, estudos anteriores sobre coelho óssea modelos de infecção, mostrou que o status de infecção era inconsistente, como a quantidade de bactérias foi variável. Este estudo apresenta um melhor método cirúrgico para induzir infecção óssea em um coelho, bloqueando as bactérias na medula óssea. Em seguida, multi-nível avaliações podem efectuar para verificar se o método de modelagem.

Em geral, desbridante tecido necrótico e implantação vancomicina-carregado de sulfato de cálcio (VCS) são predominantes no tratamento com antibióticos. Apesar de sulfato de cálcio em VCS beneficia osteócito rastejando e crescimento de novo osso, defeitos ósseos maciça ocorrerem após desbridamento. Osso autógeno (AB) é uma estratégia atraente para superar falhas ósseas para o tratamento de defeitos de massa óssea após desbridamento ósseo necrótico.

Neste estudo, nós usamos o osso da cauda como um osso autógeno implantado no defeito ósseo. Reparação óssea foi medida usando micro--tomografia computadorizada (micro-CT) e análise histológica após o sacrifício de animais. Como resultado, o grupo de VCS, não-união óssea consistentemente foi obtido. Em contraste, as áreas de defeito ósseo no grupo de VCS-AB foram diminuiu significativamente. O presente método de modelagem descrito um método reprodutível, viável, estável para preparar um modelo de infecção óssea. O tratamento de VCS-AB resultou em taxas mais baixas de não-união óssea após tratamento com antibióticos. O modelo de infecção óssea melhorada e o tratamento de combinação de VCS e osso autógeno podem ser útil para estudar os mecanismos subjacentes em infecção e osso regeneração óssea pertinente para aplicações ortopédicas de Traumatologia.

Introdução

Infecção óssea geralmente resulta de bactérias ou outra invasão de microorganismo após trauma, fratura óssea ou outros ossos doenças¹. Infecção óssea pode induzir a um elevado nível de destruição tecidual de inflamação e osso. Na clínica, Staphylococcus aureus (S. aureus) é o agente causador predominante de osso infecção^2,3. A infecção óssea é dolorosa, debilitante e muitas vezes leva um curso crônico que é extremamente difícil de tratar⁴. Presentemente, desbridamento de tecido necrótico e implantação dos grânulos de cálcio vancomicina-carregado (VCS) foram confirmados como uma estratégia eficiente para controlar a infecção local^5,6. No entanto, 10% a 15% dos pacientes experimentaram um processo de reparação óssea prolongada, retarde ou não-União após tratamento anti-infecção⁷. O grande segmento de um defeito ósseo é a questão mais difícil para os cirurgiões ortopédicos. Um enxerto ósseo autólogo é considerado a substituição óssea ideal no tratamento de não-União de osso^8,9.

Até à data, a maioria dos estudos sobre osso autólogo implantação e infecção têm sido realizados em vários tipos de modelos animais, como ratos, coelhos, cães, porcos e ovelhas^10,11. Modelos de coelho são mais comumente utilizados para estudos de infecção do osso, como primeira interpretada por Norden e Kennedy em 1970^12,13. Em nosso estudo anterior, usamos modelos de coelho, seguindo o método do Norden, e achamos que a quantidade de S. aureus injetado em medula óssea não foi possível quantificar com precisão, como o vazamento de sangue fora da medula óssea levou ao excesso de solução de bactérias.

Este artigo apresenta um método cirúrgico melhorado para induzir infecção óssea em coelhos. No final do processo, um exame de bioquímica de sangue, um exame bacteriológico e um exame histopatológico foram realizados para verificar o modelo de infecção óssea. Então, VCS foi implantado para inibir a infecção, e osso autógeno foi implantado para promover a regeneração óssea.

Protocolo

Os coelhos utilizados no presente estudo foram tratados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos experimentais foram seguidos as regras da bioética Comité de Zhejiang Academia de medicina tradicional chinesa.

1. preparação da suspensão bacteriana

1. Dissolva 0,5 mg de S. aureus (ATCC 6538) de pó de liofilização com 0,3 mL de meio de cultura de Luria-Bertani. Misture a suspensão completamente.
2. Marcam a suspensão de bactérias em placas de ágar tryptic soy e incubar as colônias bacterianas a 37 ° C durante 16 h.
3. Selecione uma única colônia bacteriana, formando unidade (CFU) e cultura em tubos de caldo tryptic soy por 24 h. realizar uma subcultura por aproximadamente 24 h a 37 ° C e obter crescimento meados-logarítmica bactérias fase após 16 a 18 h, quando o valor de densidade óptica (OD) é de 0,6 a 600 nm ¹⁴.
4. Transferi 1 mL da suspensão de bactérias em um tubo de centrífuga. Centrifugue por 5 min em 825 x g e 4 ° C e descartar o sobrenadante. Resuspenda e lavar as bactérias com 100 µ l de soro de tampão fosfato (PBS); Repita este passo 3 vezes. Finalmente, Ressuspender as bactérias com 3 mL de PBS.
5. Estime a concentração de bactérias usando Turbidimetria^{15 do McFarland}.
   1. Transferência 100 a 500 µ l de suspensão de bactérias de um tubo colorimétrico até que a turbidez é equivalente a um padrão de McFarland 0,5.
   2. Avaliar turbidez por comparação visual com a 0,5 de McFarland, quando o conteúdo de bactérias atinge aproximadamente 10⁸ UFC/mL.
      Nota: Certifique-se que o volume da suspensão de bactérias é suficiente para os seguintes protocolos. Para cada coelho, o volume da suspensão de bactérias é menos de 1 mL.
6. Transferência de 0,2 mL de suspensão bacteriana para uma placa de ágar e aplicá-lo uniformemente. Incube a placa a 37 ° C, durante 16 h. contagem das colônias de bactérias para verificar se o UFC da suspensão de bactérias.

2. preparação dos modelos de infecção óssea

1. Manter masculina Nova Zelândia coelhos brancos, com 3 meses, em gaiolas individuais, sob condições controladas de ar (20 ± 1 ° C) e ciclos de iluminação de claro-escuro de 12 h/12 h. Oferecer dieta rotineira e água da torneira diariamente.
2. Certifique-se de que no momento da cirurgia que o coelho pesa mais de 3 kg.
3. Anestesiar coelhos por injeção intraperitoneal com pentobarbital de sódio (3 mg por 100 g de peso corporal). Certifique-se de coelhos são totalmente anestesiados por uma falha para responder a uma pitada de pata. Corrigi os coelhos na mesa de operação durante o procedimento de operação.
   Nota: Certifique-se que a modelagem duração do procedimento é inferior a 1 h.
4. Raspe a região proximal da tíbia usando um barbeador elétrico no sentido contrário do crescimento dos pelos. Desinfecte a pele aplicando uma solução de iodo-povidona.
5. Marca a extremidade superior da tíbia e a posição de buraco da perfuração para injeção com S. aureus (a distância para a extremidade superior da tíbia é 1,5 cm), com caneta e régua. Certifique-se de que as posições da perfuração do furo são no meio da tíbia na horizontal (Figura 1A).
6. Cortar a pele de tíbia usando um bisturi n º 11 e faça uma incisão de 1 cm no periósteo (Figura 1B, C). Um buraco de 2 milímetros de diâmetro na tíbia usando uma unidade de broca elétrica do osso (Figura 1D).
7. Pressione os furos de 2 mm de diâmetro no planalto tibial com um cilindro de cera óssea de 2 mm de diâmetro e 2 mm de altura (Figura 1E). Remova a cera de reposição óssea ao longo do plano horizontal do planalto tibial (Figura 1-F). Verifique se o buraco de 2 milímetros é cheio de cera para osso (Figura 1G).
   Nota: Certifique-se de que os buracos estão cheios de cera para osso, verificando o buraco com ou sem excesso de sangue.
8. Coser o periósteo e pele com sutura cirúrgica na sutura vertical para evitar que o animal mastigar as suturas (Figura 1-H).
9. Injecte 1 x 10⁸ UFC/mL das soluções de S. aureus (30 µ l 100 g de peso corporal), com um injector de assepsia de 1 mL (Figura 1eu). Certifica-se de que as agulhas penetram a cera para osso e injetam a solução de S. aureus em medula óssea lentamente.
10. Manter o animal em condições quentes e limpas para evitar a perda de calor após a modelagem. Monitorar a frequência respiratória e cardíaca. Depois de acordar, casa dos coelhos em gaiolas individuais com livre acesso à comida e água.

3. avaliação do modelo de infecção óssea

1. Nos dias 7, 14, 21 e 28 após a infecção, coloca coelhos o fixador de coelho com a cabeça e a orelha fora o fixador.
2. Desenhe 2 mL de sangue das veias auriculares em um recipiente de sangue anticoagulante dipotássico etilenodiaminotetracético ácido (EDTA-K2). Empate 1 mL de sangue de um vaso sanguíneo em um recipiente de sangue. Centrifugue o soro para 10 min com uma velocidade de 651 x g , à temperatura ambiente.
   1. Determinar a contagem de glóbulos brancos (WBC) em sangue total utilizando um analisador bioquímico do sangue, e proteína C - reativa (CRP) por uma enzima-lig da imunoabsorção (ELISA) método¹⁶de ensaios.
3. Nos dias 7, 14, 21 e 28 após a infecção, anestesiar um coelhinho de modelo com pentobarbital de sódio na dosagem de 3 mg por 100 g de massa corporal. Cortar a pele de tíbia usando um bisturi n º 11 e faça uma incisão de 2 cm no periósteo(Figura 2).
4. Limpar a cera para osso. Debride osso necrótico, perfurando dois furos adjacentes 4,8 mm de diâmetro que usando uma unidade de broca elétrica do osso (Figura 2B). Debride necrótico da medula óssea e tecido de granulação, usando uma colher de osso (Figura 2C).
   Nota: Limpe o tecido ósseo durante o desbridamento para evitar tecido ósseo restante na medula óssea.
5. Raspar e limpar o tecido ósseo entre os dois furos (Figura 2D).
6. Espalhou-se 1 mL de medula óssea em placas de ágar sangue de carneiro. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C. Selecione as placas de 30 a 300 colônias e calcular o número de colônias.
7. No final do dia 28, após a infecção, extrair amostras de tíbia ao longo das bordas das articulações do joelho e tornozelo. Corrigi os espécimes de tíbia em paraformaldeído 4% por 24 h. Decalcify os espécimes de tíbia em EDTA 10% durante 8 semanas.
8. Desidratar os espécimes de tíbia em uma série graduada de diluições de etanol e em seguida incorporar em cera de parafina. Corte 4 consecutivos 5 µm seções dos planos coronais. Mancha de seções com hematoxilina e eosina (H & E) coloração kit.
9. Use um microscópio para ver as seções manchadas e gravar imagens de luz transmitidas com software padrão.

4. preparação dos grânulos de VCS

1. Adicionar 1 g de pó de cloridrato de vancomicina para 9,5 g de sulfato de cálcio da classe médica e em seguida, adicionar 3 mL de solução salina para a alimentação mista. Misture-os bem com uma espátula para 30 a 45 s.
2. Coloque o produto misturado em um molde de gel de silicone flexível (cilindro de diâmetro de 4,8 mm e 4,8 mm de altura) e secar em temperatura ambiente por 15 min. remover as contas de VCS flexionando o molde.

5. antibioterapia e implantação do osso autógeno

1. Anestesiar coelhos modelo com pentobarbital de sódio na dosagem de 3 mg por 100 g de massa corporal sobre o 28^º dia após a infecção. Raspe a região proximal da tíbia usando um barbeador elétrico. Desinfecte a pele através da aplicação de solução de iodo-povidona.
   Nota: Certifique-se que o procedimento de modelização é menos de 1 h.
2. Raspar a região da cauda usando um barbeador elétrico e desinfectar a cauda através da aplicação de solução de iodo-povidona.
3. Corte o rabo com uma tesoura cirúrgica. Cortar a pele de cauda usando um bisturi n º 11 e revelar o osso da cauda. Costure a pele na região da cauda com suturas cirúrgicas absorvíveis na sutura vertical para evitar que o animal mastigar as suturas.
4. Remova qualquer músculo, tecidos moles e periósteo. Retire o osso da cauda em cada junta e transferir o fragmento de osso para um prato de plástico de 100mm contendo solução salina estéril.
5. Prótese 4 pedaços de grânulos de VCS (cilindro de 4,8 mm de diâmetro e 4,8 mm de altura, vancomicina 1,25 mg por peça do grânulo) na cavidade da medula, usando uma pinça curva (Figura 2E).
6. Preencher o defeito ósseo com 8 pedaços de ossos autógenos (cilindro de 2 mm de diâmetro e 4 mm de altura por cada peça) usando curvas de pinça(Figura 2).
7. Coser o periósteo e pele com suturas cirúrgicas absorvíveis de forma colchão de sutura (Figura 2-F).
   Nota: Manter a temperatura a 25 ° C durante a cirurgia.
8. Manter o animal em condições quentes e limpas para evitar a perda de calor após a cirurgia. Monitorar a frequência respiratória e cardíaca. Depois de acordar, casa dos coelhos em gaiolas individuais com livre acesso à comida e água.

6. as avaliações da actividade antibiótica

1. Colocou um fixador coelho coelhos e coloque a cabeça e a orelha fora o fixador em 2, 4, 6 e 8 semanas após o tratamento.
2. Tirar sangue das veias auriculares com EDTA-K2 anticoagulante dos vasos sanguíneos. Empate 1 mL de sangue de um vaso sanguíneo em um recipiente de sangue. Centrifugue o soro para 10 min com uma velocidade de 651 x g , à temperatura ambiente.
3. Determine a contagem de glóbulos brancos (WBC) em sangue total por meio de analisador bioquímico do sangue e proteína C - reativa (CRP) por um método de ELISA¹⁶.

7. as avaliações de regeneração óssea

1. Eutanásia em coelhos injetando com um sobre dosagens de pentobarbital de sódio, no final de 8 ou 12 semanas após o tratamento.
2. Extrair amostras de tíbia, ao longo das bordas das articulações do joelho e tornozelo. Debride camadas da fáscia e músculos.
3. Analise a estrutura do tibia usando microtomografia computadorizada (micro-CT). Escolha uma área oval 4,8 mm de diâmetro e 9,6 mm de comprimento como a região de interesse (ROI). Reconstrua o modelo 3D imagens usando dados de bitmap.
4. Escolher as partituras da proporção de volume de volume/tecido ósseo (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número Trabécula (Tb.N) e separação trabecular (Tb.Sp)from the3D modelos para avaliar a regeneração óssea.

Resultados

Avaliação do modelo de infecção óssea
Após a infecção com S. aureus, as manifestações patológicas de coelhos foram semelhantes para o sintoma representativo da osteomielite crônica na clínica. Em nosso estudo, 30 coelhos foram infectados e submetidos como um grupo de modelos, e 10 coelhos estavam sujeitos como animais de controle. Todos os coelhos de modelo tem infectado seios do site local da tíbia, com pus branco e amarelo sobre o fluxo de seio...

Discussão

Nos estudos anteriores, vários tipos de modelos animais foram construídos para estudar ambos infecção óssea aguda e crônica; no entanto, a busca do modelo ideal ainda persiste^17,18. Além disso, o modelo de infecção óssea ideal é esperado para simular as características patológicas da infecção óssea em ambiente clínico, enquanto os períodos de modelização, permanecem, baixo custo e fácil de realizar. Até agora, o modelo de infecção óssea c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180