Лечение с ванкомицин загружен сульфат кальция и аутогенных кости в модели улучшения кролик кость инфекции

Резюме

Это исследование представляет Улучшенный кролик модель инфицированных золотистого стафилококка , блокируя такое же количество бактерий в костном мозге. Сульфат кальция ванкомицин загружен и аутогенных кости используются для лечения антибиотиками и кости ремонт. Протокол может быть полезным для изучения инфекции костей и регенерации.

Аннотация

Кость инфекции результаты от бактерий вторжения, которое чрезвычайно трудно лечения в клинических, ортопедические и травматических хирургии. Кость инфекции может привести к устойчивой воспаление, остеомиелита и возможного кости не союз. Создание осуществимо, воспроизводимые модели животных очень важно кость инфекции исследования и лечения антибиотиками. Как в естественных условиях модели кролик модель широко используется в исследованиях инфекции костей. Однако предыдущие исследования на кролика костей инфекции модели показали, что ВИЧ-статуса непоследовательно, поскольку количество бактерий переменной. Это исследование представляет Улучшенный хирургический метод для вызывающих инфекции костей на кролика, блокируя бактерий в костном мозге. Затем многоуровневой оценки может осуществляться для проверки метода моделирования.

В общем debriding некротических тканей и имплантации ванкомицин загружен кальция сульфата (VCS) преобладают в лечении антибиотиками. Хотя сульфат кальция в VCS выгоды остеоциты ползать и новый рост костей, массивные кости дефекты возникают после debriding. Автогенный кости (AB) является привлекательным стратегия преодоления костных дефектов для лечения массивные костных дефектов после debriding некротических кости.

В этом исследовании мы использовали копчик как автогенной костей, имплантированные в дефект кости. Ремонт кости была измерена с помощью микро компьютерная томография (микро CT) и гистологический анализ после жертвоприношения животных. В результате в группе VCS, кости не союз последовательно получен. Напротив области дефекта кости в группе VCS-AB были значительно сократилось. Нынешний метод моделирования описал воспроизводимость, возможно, стабильные метод подготовить модель инфекции костей. VCS-AB лечения привели к более низкие ставки-союз кости после лечения антибиотиками. Улучшение кость инфекции модель и сочетание лечения VCS и аутогенных кости могут быть полезны в изучении основных механизмов в кость инфекции и костной регенерации соответствующим приложениям ортопедической травматологии.

Введение

Кость инфекции обычно приводит к от бактерий и других микроорганизмов вторжения после травмы, перелома костей или других заболеваний костей¹. Кость инфекции могут вызвать высокий уровень уничтожения воспаления и костной ткани. В клинике, золотистый стафилококк (S. aureus) является преобладающим возбудителя инфекции костей^2,3. Инфекции костей болезненно, изнурительной и часто принимает хронический курс, который чрезвычайно трудно лечить⁴. В настоящее время хирургическая некротических тканей и имплантировать в бусин ванкомицин загружен кальция (VCS) были подтверждены как эффективную стратегию для управления местной инфекции^5,6. Однако 10% до 15% пациентов испытали процесс ремонта длительное кости, задержки союз или несрастание после лечения против инфекции⁷. Большой сегмент дефекта кости является наиболее трудным вопросом для ортопедических хирургов. Аутологичные костного трансплантата считается замена оптимальный кость в кость-союз лечения^8,9.

На сегодняшний день, большинство исследований на кость инфекции и аутологичных костной имплантация были проведены различные виды животных моделей, таких как крыс, кроликов, собак, свиней и овец^10,11. Кролик модели наиболее часто используются для исследования инфекции костей, как первый, выполняемые Норден и Кеннеди в 1970 году^12,13. В нашем предыдущем исследовании мы использовали модели кролика после Норден в метод, и мы обнаружили, что количество S. aureus вводят в костный мозг может быть количественно не точно, как утечки крови из костного привело к бактерии решение переполнения.

Эта статья представляет усовершенствованный хирургический метод для вызывающих инфекции костей на кроликов. В конце процедуры Биохимия крови, бактериологическое исследование и гистопатологические экзамена были проведены для проверки модели инфекции костей. Затем VCS был имплантирован подавлять заражения, и аутогенных кости был имплантирован костной регенерации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Кроликов, используемые в настоящем исследовании рассматривались в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных. Все экспериментальной процедуры были соблюдены правила о биоэтике Комитет из Чжэцзян академии традиционной китайской медицины.

1. Подготовка бактериальных подвеска

1. Растворите 0,5 мг S. aureus для порошка (ATCC 6538) с 0,3 мл Лурия Бертани питательной среды. Смешайте подвеска полностью.
2. Полоса бактерий подвески на tryptic соевый агар пластин и инкубировать бактериальных колоний при 37 ° C для 16 h.
3. Выберите один бактериальные колонии, формирование группы (CFU) и культуры в tryptic соевый бульон трубы для 24 h. выполнение субкультуры для около 24 ч при 37 ° C и получить середине логарифмического роста бактерий фазы после 16-18 ч, когда значение оптической плотности (OD) 0,6 на 600 Нм ¹⁴.
4. Передача 1 мл суспензии бактерий в пластиковых пробирок. Центрифуга для 5 мин на 825 x g и 4 ° C и отбросить супернатант. Ресуспензируйте и промойте бактерий с 100 мкл-фосфатный буфер (PBS); Повторите этот шаг 3 раза. Наконец Ресуспензируйте бактерий с 3 мл ФСБ.
5. Оценки с использованием МакФарланд в турбидиметрия¹⁵концентрации бактерий.
   1. 100 до 500 мкл суспензии бактерии можно передавать колориметрические трубки до тех пор, пока замутненность эквивалентен 0.5 МакФарланд стандарта.
   2. Оценить мутности путем визуального сравнения до 0.5 МакФарланд, когда содержание бактерий достигает примерно 10⁸ кое/мл.
      Примечание: Убедитесь, что объем бактерий подвеска является достаточным для следующих протоколов. Для каждого кролика объем бактерий подвеска составляет менее 1 мл.
6. Передавать плита агара 0,2 мл бактериальной подвески и применить его равномерно. Инкубируйте пластины при 37 ° C для 16 h. количество колоний бактерий для проверки CFU подвеска бактерий.

2. Подготовка моделей инфекции костей

1. Держите мужской Новой Зеландии белого кролика, в возрасте 3 месяцев, в отдельных клетках, воздух контролируемых условиях (20 ± 1 ° C) и 12 h/12 h свето тени освещения циклов. Предлагаем обычной диете и водопроводной воды ежедневно.
2. Убедитесь, что во время хирургии кролик весит более 3 кг.
3. Обезболивают кроликов внутрибрюшинной инъекции с Пентобарбитал натрия (3 мг на 100 г веса тела). Убедитесь, что кролики полностью под наркозом, неспособность реагировать щепотку лапы. Исправьте кроликов на операционном столе во время операции процедуры.
   Примечание: Убедитесь, что моделирование продолжительность процедуры составляет менее 1 ч.
4. Бритье регионе проксимального отдела голени с помощью электробритвы против направления роста волос. Лечить кожу, применяя повидон йод раствор.
5. Марк верхний конец большеберцовой кости и бурения отверстия позиции для инъекций с S. aureus (расстояние до верхней части голени-1,5 см) с ручкой и правителя. Убедитесь, что сверления отверстия позиции находятся в середине плато большеберцовой кости горизонтально (рис. 1A).
6. Вырезать кожи голени с помощью скальпеля № 11 и 1 см разрез в надкостнице (Рисунок 1B, C). Пробейте отверстие диаметром 2 мм в голени с помощью электрических кости сверлильного станка (рис. 1D).
7. Нажмите отверстия диаметром 2 мм на плато большеберцовой кости с цилиндром кости восковые диаметром 2 мм и высотой 2 мм (рис. 1E). Удаление воска запасных кости вдоль горизонтальной плоскости плато большеберцовой кости (рис. 1F). Проверьте полное воска кости (рис. 1G) отверстие 2 мм.
   Примечание: Убедитесь, что отверстия полны костей воска, проверяя отверстие с или без переполнения кровью.
8. Зашить надкостницы и кожи с рассасывающиеся хирургические шовные в вертикальной матрас шов для предотвращения животное от жевания швы (рис. 1H).
9. Придать 1 x 10⁸ кое/мл растворов (30 мкл на 100 г веса тела) S. aureus с инжектором Асептика 1 мл, (рис. 1я). Убедитесь, что иглы проникают кости воска и вставляют S. aureus раствора костного медленно.
10. Держите животное в условиях теплого и чистой, чтобы избежать потери тепла после моделирования. Монитор частоты дыхания и пульса. После пробуждения, дом кроликов в отдельных клетках с бесплатным доступом к продовольствию и воде.

3. Оценка модели инфекции костей

1. В дни 7, 14, 21 и 28 после инфекции место кроликов в фиксаж кролика с головой и уха вне закрепитель.
2. Нарисуйте 2 мл крови из ушной раковины вен в контейнер антикоагулянт крови калия Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА-K2). Нарисуйте 1 мл крови из кровеносного сосуда в контейнер крови. Центрифуга сыворотка для 10 мин со скоростью 651 x g при комнатной температуре.
   1. Определить количество лейкоцитов (WBC) в цельной крови с помощью крови биохимический анализатор, и C - реактивного белка (СРБ) путем иммуноферментного анализа (ИФА) метод¹⁶.
3. В дни 7, 14, 21 и 28 после инфекции обезболивают одна модель Кролик с Пентобарбитал натрия в дозировке 3 мг на 100 г веса тела. Вырезать кожи голени с помощью скальпеля № 11 и сделать разрез 2 см в надкостнице (рисA).
4. Очистить воск кости. Предотвращать некротические кости штамповкой два прилегающих 4,8 мм диаметр отверстия с помощью электрических кости сверлильного станка (рис. 2B). Предотвращать некротические костного мозга и грануляционной ткани с помощью ложки кости (рис. 2C).
   Примечание: Очистить костной ткани во время хирургическая избежать костной ткани, оставшиеся в костном мозге.
5. Очистить и очистить костной ткани между двумя отверстиями (рис. 2D).
6. Распространение 1 мл костного мозга на плиты агара крови овец. Инкубировать пластин на ночь при 37 ° C. Выберите пластины 30 – 300 колоний и рассчитать количество колоний.
7. В конце дня 28 после инфекции экстракт голени образцов по краям коленного и голеностопного суставов. Исправить голени образцов в параформальдегида 4% за 24 ч. Decalcify голени образцов в 10% ЭДТА для 8 недель.
8. Обезвоживает голени образцов в градуированных серию разведений этанола, а затем внедрить в парафин. Стрижки 4 подряд 5 мкм с коронковой самолетов. Пятно секции с гематоксилином и эозином (H & E) пятная комплект.
9. Использование микроскопа для просмотра окрашенных разделы и записи передаваемых света изображений со стандартным программным обеспечением.

4. Подготовка VCS бусины

1. Добавьте 1 g порошка Ванкомицина гидрохлорид в 9,5 г сульфата кальция медицинский класс, а затем добавьте 3 мл физиологическим смешанного питания. Тщательно перемешайте с помощью шпателя для 30-45 s.
2. Поместите смешанный продукт в гибкой силикагель плесень (цилиндр диаметром 4,8 мм и высотой 4,8 мм) и высушите при комнатной температуре за 15 мин удалить VCS бусы, разминая плесень.

5. антибиотикотерапии и имплантации автогенный кости

1. Обезболивают модель кроликов с Пентобарбитал натрия в дозировке 3 мг на 100 г веса тела на 28-^е сутки после инфекции. Бритье регионе проксимального отдела голени с помощью электробритвы. Лечить кожу, применяя повидон йод раствор.
   Примечание: Убедитесь, что моделирующая процедура является менее 1 ч.
2. Брить хвост региона с использованием электробритвы и продезинфицируйте хвост, применяя повидон йод раствор.
3. Отрежьте вниз хвост, используя Ножницы хирургические. Cut хвост кожи с помощью скальпеля № 11 и выявить копчик. Зашейте кожу в регионе хвост с рассасывающихся хирургических нитей в вертикальной матрас шов для предотвращения животное от жевания швы.
4. Удалите любые мышц, мягких тканей и надкостницы. Отсоединить копчик на каждое соединение и передача фрагмент кости на блюдо пластика 100 мм, содержащие стерильного физиологического раствора.
5. Имплантировать 4 штук бусин VCS (цилиндр диаметром 4,8 мм и высотой 4,8 мм, ванкомицин 1,25 мг за штуку из бисера) в полости костного мозга, используя Изогнутый пинцет (Eрис. 2).
6. Заполнить дефект кости с 8 штук автогенный костей (цилиндр диаметром 2 мм и 4 мм высота за каждый кусок) с помощью Изогнутый пинцет (2 рисунокE).
7. Зашить надкостницы и кожи с рассасывающиеся хирургические шовные материалы образом шов матрасе (Рисунок 2F).
   Примечание: Поддержания температуры при 25 ° C во время операции.
8. Держите животное в условиях теплого и чистой, чтобы избежать потери тепла после операции. Монитор частоты дыхания и пульса. После пробуждения, дом кроликов в отдельных клетках с бесплатным доступом к продовольствию и воде.

6. оценки антибактериальной активности

1. Положите кроликов в кролика fixer и место головы и уха вне монтер в 2, 4, 6 и 8 недель после лечения.
2. Нарисуйте крови от аурикулярных вен с ЭДТА-K2 антикоагулянт кровеносного сосуда. Нарисуйте 1 мл крови из кровеносного сосуда в контейнер крови. Центрифуга сыворотка для 10 мин со скоростью 651 x g при комнатной температуре.
3. Определите белых кровяных телец (Лейкоцитов) в цельной крови, биохимический анализ крови и C - реактивного белка (СРБ) с помощью метода ИФА¹⁶.

7. оценки костной регенерации

1. Усыпить кроликов путем инъекций с чрезмерной дозы Пентобарбитал натрия, в конце 8 или 12 недель после лечения.
2. Распакуйте образцы голени, по краям коленного и голеностопного суставов. Предотвращать мышц и Фасциальных слоев.
3. Анализ структуры голени с помощью микро компьютерная томография (микро CT). Выберите Овальная область 4,8 мм диаметром и 9,6 мм длиной, как регион интерес (ROI). Реконструировать изображения 3D модели с помощью растровых данных.
4. Выберите десятки отношение объема кости тома/ткани (BV/TV), Трабекулярная толщина (Tb.Th), Трабекула номер (Tb.N) и трабекулярной разделения (Tb.Sp)from the3D модели для оценки костной регенерации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Оценка модели инфекции костей
После инфекции с S. aureusпатологических проявлений кроликов были похожи на представителя симптомом хронического остеомиелита в клинике. В нашем исследовании 30 кроликов были инфицированы и подвергаются как модель группы, и 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В предыдущих исследованиях были построены различные виды животных моделей для изучения обе кости острые и хронические инфекции; Однако Поиск идеальной модели по-прежнему сохраняется^17,18. Кроме того модель идеального кость инфекции ожидается моделирова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180