カルシウム硫酸塩および改良されたウサギ骨感染症モデルにおける自家骨にバンコマイシンによる治療が読み込まれます

要約

本稿では改良されたウサギ骨髄で細菌の同じ量をブロックすることによって黄色ブドウ球菌に感染しているモデル。読み込まれるバンコマイシン カルシウム硫酸塩および自家骨は、抗生物質と骨の修復治療に使用されます。プロトコルは、骨感染症、再生を勉強のために有用かもしれない。

要約

骨感染症に起因する細菌の侵入、臨床整形外科、外傷外科治療が非常に困難であります。持続的な炎症、骨髄炎、および最終的な骨癒合骨感染可能性があります。可能で、再現可能な動物モデルの確立は、骨の感染症研究と抗生物質による治療が重要です。インビボ モデルとして家兎モデル広く骨感染症研究に使用されます。ただし、ウサギに関する先行研究は細菌の量は変数として、感染状態が一貫性のある、感染症モデルを骨します。本稿では, 骨髄に細菌をブロックすることによって、ウサギの骨感染症を誘発する手術法の改善。それから、多段階評価はモデリング方法を確認する遂行することができます。

一般に、こそぎとって壊死とバンコマイシン ロード カルシウム硫酸塩 (VCS) の注入抗生物質治療で優勢であります。VCS で硫酸カルシウムの利点クロール骨と新しい骨成長、こそぎとって後大規模な骨欠損が発生します。自家骨 (AB) は、壊死骨をこそぎとって後大規模な骨欠損の治療のための骨欠損を克服するために魅力的な戦略です。

本研究では骨欠損部に注入した自家骨と尾の骨を使用しました。骨修復は、動物の犠牲の後マイクロ計算トモグラフィー (マイクロ CT) と組織学的解析を用いて測定しました。その結果、VCS グループ骨癒合は、一貫して得られました。対照的に、VCS AB グループ内の骨欠損区域は有意に減少。現在のモデリング手法は、骨感染症モデルを準備する再現性のある、実行可能な安定した方法を説明します。VCS AB 治療は抗生物質による治療後に骨癒合率が低い結果になった改善された骨感染症モデルとベンチャー ・ キャピタルや自家骨の組み合わせ治療は外傷整形外科用アプリケーションに関連する骨の感染症や骨の再生のメカニズムを勉強に役立つかもしれない。

概要

通常骨感染症細菌または他の微生物侵入外傷、骨折、その他骨疾患¹以降後に起因します。骨感染症は、炎症や骨のティッシュの破壊の高レベルを引き起こす可能性があります。クリニックで黄色ブドウ球菌(ブドウ球菌)、骨感染症^2,3の優勢な原因となるエージェントです。骨感染症、痛み、衰弱、頻繁に⁴の治療が非常に困難である慢性の経過を取る。現時点では、壊死組織のデブリドマンとバンコマイシン ロード カルシウム (VCS) ビードの注入は局所感染症^5,6を制御するための効率的な戦略として確認されています。ただし、患者の 10% から 15% は、抗感染症治療⁷後長期にわたる骨修復処理、遅延連合または非組合員を経験しました。骨欠損の大きい区分は、整形外科医にとって最も困難な問題です。自家骨移植は、骨癒合治療^8,9の最適な骨交換と見なされます。

日付、骨に関する研究のほとんどに感染症や自家骨移植を動物モデル、ネズミ、ウサギ、犬、豚、羊^10,11などの様々 な種類で行われています。ウサギ モデルが一般的な骨感染症研究として最初ノルデンとケネディによって 1970年^12,13で実行されます。以前の研究では、ノルデンのメソッドに続く家兎モデルを使用して、細菌ソリューション オーバーフローにつながって骨髄から血液の漏れとして、黄色ブドウ球菌骨髄注入量が正確に定量化していないとわかった。

家兎骨感染症を誘発する手術法の改良を提案する.骨感染症モデルを確認するは、プロシージャの終わりには、血液生化学検査、細菌学的検査、病理組織学的検討を行った。VCS は、感染を抑制する移植されたし、自家骨は、骨の再生を促進するために移植されました。

プロトコル

本研究で使用されるウサギは、ケアと実験動物の使用のためのガイドに従って扱われました。すべての実験手順は、ルールの生命倫理委員会の浙江省アカデミーの伝統中国医学が続いていた。

1. 細菌懸濁液の調製

1. 黄色ブドウ球菌ルリア ベルターニカミラ培養液 0.3 mL と粉末 (ATCC 6538) を凍結乾燥の 0.5 mg を溶解します。完全に懸濁液を混ぜます。
2. トリプシン大豆寒天に菌懸濁液を連勝、16 h の 37 ° C で細菌のコロニーを孵化させなさい。
3. ユニット (CFU) とトリプシン大豆スープ用 24 時間実行 37 ° C で約 24 時間のサブカルチャー文化を形成単一細菌のコロニーを選択し、取得半ば対数増殖相細菌 16 に 18 h、光学濃度 (OD) 値が 600 で 0.6 nm¹⁴。
4. 遠心管に細菌懸濁液の 1 mL を移します。825 x gと 4 ° C で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。再懸濁します、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS); 100 μ L で細菌を洗浄この手順を 3 回繰り返します。最後に、3 ml の PBS の細菌を再懸濁します。
5. ¹⁵のマクファーランド比濁法を用いた細菌濃度を推定します。
   1. 濁度が 0.5 マクファーランド標準と同等になるまで、菌懸濁液の 100 を 500 μ L を比色管に転送します。
   2. 細菌のコンテンツ約 10 に達したとき 0.5 マクファーランドを視覚的に比較して濁度を評価⁸ CFU/mL。
      注:菌懸濁液の量は次のプロトコルのために十分であることを確認します。すべてのウサギの細菌懸濁液の体積は 1 mL 未満です。
6. 寒天版の細菌懸濁液 0.2 mL に転送し、均等にそれを適用します。CFU の菌懸濁液を確認する細菌コロニーの 16 h. 数 37 ° C でプレートを孵化させなさい。

2. 骨感染症モデルの作成

1. 男性ニュージーランド白ウサギ、空気制御条件 (20 ± 1 ° C) および 12/12 h 光暗い照明サイクルの下、個々 のケージで、3 ヶ月熟成をしてください。日常食を提供し、毎日水をタップします。
2. ウサギ 3 kg 以上の重量を量ることを手術の時に確認します。
3. ペントバルビ タール ナトリウム (体重 100 g あたり 3 mg) と腹腔内投与によるウサギを anaesthetize します。ウサギは麻酔を完全に前足ピンチに応答に失敗したかどうかを確認します。操作の処理中に、オペレーティング テーブルの上ウサギを修正します。
   注:確認、モデリング手順期間は 1 h 未満。
4. 髪の成長の方向に対して電気シェーバーを用いた脛骨近位端領域を剃る。ポビドン ヨード溶液を適用することによって、皮膚を消毒します。
5. 脛骨とペンと定規で黄色ブドウ球菌(脛骨の上端までの距離が 1.5 cm) 注射用掘削穴の位置の上部端をマークします。掘削穴の位置が脛骨の高原の真ん中に水平を確認してください (図 1A)。
6. 第 11 メスによる脛骨皮膚を切り取って、骨膜 (図 1B, C) に 1 cm の切開を行います。電気骨ドリル ユニット (図 1D) を使用して脛骨の 2 mm 径の穴をパンチします。
7. 直径 2 mm と 2 mm の高さ (図 1E) の骨ワックス シリンダーで脛骨高原の直径 2 mm の穴を押してください。脛骨プラトー (図 1F) の水平面に沿って予備骨ワックスを削除します。2 mm の穴が骨ワックス (図 1G) の完全であることを確認します。
   注:穴が穴血オーバーフローの有無をチェックすることによって骨ワックスの完全であることを確認します。
8. 骨膜を縫うし、皮膚縫合糸 (図 1H) を噛むから動物を防ぐために垂直マットレス縫合で縫合手術。
9. (図 1の私) 1 mL 無菌インジェクター付き 1 × 10⁸ 黄色ブドウ球菌ソリューション (体重 100 g あたり 30 μ L) の CFU/mL を注入します。針骨ワックスを浸透し、ゆっくりと骨髄に黄色ブドウ球菌の溶液を注入していることを確認します。
10. モデリング後熱損失を避けるために暖かく、きれいな状態で動物を飼います。呼吸数や心拍数を監視します。起きて家の食料や水への無料アクセスを個々 のケージでウサギを実行します。

3. 骨感染症モデルの評価

1. 7、14、21、感染後 28 日で頭とフィクサーの外耳ウサギ フィクサーにウサギを配置します。
2. グリチルリチン エチレンジアミン四酸 (EDTA K2) 抗凝固血容器に耳介静脈から血液 2 mL を描画します。血管から血液の容器に 1 ミリリットルの血液を描画します。室温で 651 x gの速度で 10 分間血清を遠心します。
   1. 血液の生化学的分析を使用して全血で白血球数 (WBC) を決定し、C-反応性蛋白 (CRP) 酵素免疫測定 (ELISA) 法¹⁶。
3. 7、14、21、感染後 28 日で体重 100 g あたり 3 mg の用量でペントバルビ タール ナトリウムと 1 つのモデル ウサギを anaesthetize します。第 11 メスによる脛骨皮膚を切り取って、骨膜 (図 2A) に 2 cm の切開を行います。
4. ボーン ワックスをきれいに。電気骨ドリル ユニット (図 2B) を使用して 2 つの隣接する 4.8 mm 径の穴を打つことによって壊死した骨を苔します。骨髄壊死および骨スプーン (図 2C) を使用して肉芽組織を苔します。
   注:骨、骨髄内の残りを避けるためにデブリドマン中骨をきれいに。
5. 2 つの穴 (図 2D) 間の骨組織をこすり清潔。
6. 羊血液寒天培地プレートに骨髄の 1 mL を広めます。37 ° C で一晩版を孵化させなさい30-300 のコロニーのプレートを選択し、コロニーの数を計算します。
7. 感染後 28 日目の終わりには、膝と足首の関節の端に沿って脛骨標本を抽出します。24 時間 Decalcify の 4% パラホルムアルデヒドで脛骨標本脛骨標本の修正 10% EDTA 8 週間。
8. エタノールの希釈の一連の階級における脛骨標本を脱水し、埋め込むパラフィン ワックス。コロナの平面から 4 連続 5 μ m 部分をカットします。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色キットのセクションを染色します。
9. ステンド グラスのセクションを表示するのには顕微鏡を使用して、レコードが標準ソフトウェアとともに光の画像を送信しました。

4. VCS ビーズの作製

1. 医療グレード カルシウム硫酸塩、9.5 g にバンコマイシン塩酸塩粉末 1 g を追加し、混合の電源に通常生理食塩水 3 mL を追加します。ミックスに徹底的にへらで 30 に 45 s。
2. 柔軟なシリカゲル型 (直径 4.8 mm、高さ 4.8 mm のシリンダー) に混合製品を置き、15 分は、金型を曲げる VCS ビーズを削除するために室温で乾燥します。

5. 抗生物質治療と自家骨移植

1. 感染後 28 日^目体重 100 g あたり 3 mg の用量でペントバルビ タール ナトリウム モデル家兎を anaesthetize します。電気シェーバーを用いた脛骨近位端領域を剃る。ポビドン ヨード溶液を適用することによって、皮膚を消毒します。
   注:モデリング手順が 1 h 未満であることを確認します。
2. 電気シェーバーを使って尻尾領域を剃るし、ポビドン ヨード溶液を適用することによって尾を消毒します。
3. 手術用のはさみを使って尻尾を削減します。第 11 メスによる尾の皮膚を切り取って、尾の骨を明らかにします。吸収性縫合縫合糸を噛むから動物を防ぐために垂直マットレス縫合と尾地域で皮膚を縫います。
4. すべての筋肉、軟部組織、骨膜を削除します。各関節に尾の骨を切断し、骨片を滅菌生理食塩水を含む 100 mm プラスチックの皿に転送します。
5. ピンセット (図 2E) を用いた骨髄腔にインプラントの VCS ビーズ (直径 4.8 mm と 4.8 mm の高さ、ビードの部分あたり 1.25 mg バンコマイシンのシリンダー) の 4 個セット。
6. 骨欠損部を埋める自家骨を 8 個とピンセット (図 2E) を曲線 (直径 2 mm、高さ 4 mm の各部分ごとのシリンダー) を使用しています。
7. 骨膜を縫うし、マットレス縫合方法 (図 2F) で吸収性縫合と皮膚します。
   注:手術中に 25 ° c の温度を保ちます。
8. 手術後熱損失を避けるために暖かく、きれいな状態で動物を飼います。呼吸数や心拍数を監視します。起きて家の食料や水への無料アクセスを個々 のケージでウサギを実行します。

6. 抗菌活性の評価

1. ウサギ フィクサーにウサギを入れて、治療後 2、4、6、8 週間で頭と耳、フィクサーの外に配置。
2. EDTA K2 抗凝固血管の耳介静脈から血液を描画します。血管から血液の容器に 1 ミリリットルの血液を描画します。室温で 651 x gの速度で 10 分間血清を遠心します。
3. ELISA 法¹⁶血液生化学分析装置、および C 反応性蛋白 (CRP) を用いた全血で白血球数 (WBC) を決定します。

7. 骨再生の評価

1. 注入することによってウサギを安楽死させる治療後 8 〜 12 週間の終わりにネンブタールの投与量。
2. 膝と足首の関節の端に沿って、脛骨の標本を抽出します。筋肉や筋膜層を苔します。
3. マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) を使用して脛骨の構造を分析します。オーバル形のエリア 4.8 φ と 9.6 をミリメートル長い利益 (率 ROI) の領域として選択します。ビットマップ データを用いた 3 D モデル画像を再構築します。
4. 骨量/組織ボリューム (BV/TV)、骨梁の厚さ (Tb.Th) の比率のスコアを選択による骨梁数 (Tb.N) と骨梁間隔 (Tb.Sp)from the3D モデル骨再生を評価します。

結果

骨感染症モデルの評価
黄色ブドウ球菌の感染後ウサギの病的な症状の診療所で慢性骨髄炎の代表的な症状と類似していた。私たちの研究では 30 ウサギが感染しており、モデル グループとして受けるし、10 ウサギ制御動物として受けた。すべてのモデルのウサギは、副鼻腔 (図 3A) からフローを白と黄色の膿と?...

ディスカッション

両方の急性および慢性の骨感染症; を勉強する建設された各種動物モデルの以前の研究でただし、理想的なモデルの検索はまだ^17,18が保持されます。さらに、低コストで実施しやすいまま、モデル期間中の臨床場面における骨感染症の病理組織学的特性をシミュレートする理想的な骨感染症モデルは期待されます。これまでのところ、家兎骨感染症?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180