Tratamiento con vancomicina cargado sulfato de calcio y hueso autógeno en un modelo de conejo mayor de infección ósea

Resumen

Este estudio presenta un conejo mejorado modelo infectado con Staphylococcus aureus mediante el bloqueo de la misma cantidad de bacterias en la médula ósea. Vancomicina cargado sulfato de calcio y hueso autógeno se utilizan para el tratamiento de antibiótico y hueso reparación. El protocolo podría ser útil para estudiar la infección del hueso y la regeneración.

Resumen

Infección del hueso resultado de invasión bacteriana, que es extremadamente difícil de tratar en la cirugía de la clínica ortopédica y traumática. La infección ósea puede resultar en inflamación mantenida, osteomielitis y eventual no-la Unión del hueso. Establecimiento de un modelo factible, reproducible es importante hueso investigación de infección y tratamiento antibiótico. Como un modelo in vivo, el modelo del conejo es ampliamente utilizado en la investigación de infección ósea. Sin embargo, estudios anteriores realizados sobre conejo hueso modelos de infección mostró que el estado de la infección era incompatible, como la cantidad de bacterias fue variable. Este estudio presenta un método quirúrgico mejorado para inducir la infección del hueso de una de conejo, mediante el bloqueo de las bacterias en la médula ósea. Entonces, se pueden realizar evaluaciones de niveles múltiples para verificar el método de modelado.

En general, desbridan tejido necrótico y la implantación de sulfato de calcio de carga de vancomicina (VCS) son predominantes en el tratamiento antibiótico. Aunque el sulfato de calcio en VCS beneficios Osteocito arrastrándose y neoformación de hueso, defectos óseos masivos ocurren después de desbridamiento. Hueso autógeno (AB) es una estrategia atractiva para superar defectos óseos para el tratamiento de defectos óseos masivos después de desbridamiento óseo necrótico.

En este estudio, hemos utilizado el hueso de la cola como un hueso autógeno en el defecto óseo. Reparación ósea se midió usando tomografía micro computada (micro-CT) y el análisis histológico después de sacrificio de animales. Como resultado, en el grupo de VCS, no-la Unión del hueso se obtuvo consistentemente. En contraste, las zonas de defecto óseo en el grupo de VCS-AB disminuyeron significativamente. El presente método de modelado describe un método factible, reproducible y estable para preparar un modelo de infección ósea. El VCS-AB tratamiento dio lugar a tasas de no Unión ósea después del tratamiento antibiótico. El modelo de infección ósea mejorada y el tratamiento de combinación de VCS y hueso autógeno podrían ser útiles en el estudio de los mecanismos subyacentes en la infección y el hueso la regeneración ósea pertinente a las aplicaciones ortopédicas traumatología.

Introducción

Infección del hueso resulta generalmente de bacterias o la invasión de otros microorganismos después de trauma, fractura de hueso u otras enfermedades de hueso¹. Infección del hueso puede inducir un alto nivel de destrucción tisular inflamación y hueso. En la clínica, Staphylococcus aureus (S. aureus) es el agente causal predominante de infección de hueso^2,3. La infección ósea es dolorosa, debilitante y a menudo toma un curso crónico que es muy difícil de tratar⁴. En la actualidad, desbridamiento de tejido necrótico y la implantación de granos de calcio de carga de vancomicina (VCS) se han confirmado como una estrategia eficiente para controlar la infección local^5,6. Sin embargo, 10% a 15% de los pacientes experimentaron un proceso de reparación ósea prolongada unión retrasada y no unión después de la lucha contra la infección tratamiento⁷. El gran segmento de un defecto del hueso es la cuestión más difícil para los cirujanos ortopédicos. Un injerto de hueso autólogo se considera la sustitución ósea óptima en el tratamiento de no Unión de hueso^8,9.

Hasta la fecha, la mayoría de los estudios sobre hueso implantación de hueso autólogo y la infección se han realizado en diversos tipos de modelos animales, como ratas, conejos, perros, cerdos y ovejas^10,11. Modelos de conejo son más comúnmente utilizados para los estudios de la infección del hueso, como primera realizado por Norden y Kennedy en 1970^12,13. En nuestro estudio anterior, utilizamos modelos de conejo siguiendo método de Norden, y encontramos que la cantidad de S. aureus inyectado en la médula ósea podría no ser cuantificada con exactitud, como la sangre que sale de la médula provocado derrame de solución de las bacterias.

Este artículo presenta un método quirúrgico mejorado para inducir infección ósea en conejos. Al final del procedimiento, se realizaron un examen de bioquímica de la sangre, un examen bacteriológico y una examinación histopatológica para verificar el modelo de infección ósea. A continuación, VCS se implantó para inhibir la infección y hueso autógeno se implantó para promover la regeneración del hueso.

Protocolo

Los conejos utilizados en el presente estudio fueron tratados de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos experimentales fueron seguidos por las reglas de la bioética Comité de Zhejiang Academia de medicina tradicional China.

1. preparación de la suspensión bacteriana

1. Disolver 0,5 mg de S. aureus (ATCC 6538) en polvo de liofilización con 0,3 mL de medio de cultivo Luria Bertani. Suspensión de la mezcla completamente.
2. Raya la suspensión de bacterias en placas de agar soja tríptico e incubar las colonias bacterianas a 37 ° C por 16 h.
3. Seleccione una única colonia bacteriana formando unidad (UFC) y cultivo en tubos de caldo de soja tríptica para 24 h. realizar un subcultivo durante aproximadamente 24 h a 37 ° C y obtener crecimiento medio logarítmicos bacterias fase después de 16 a 18 h, cuando el valor de densidad óptica (OD) es de 0.6 a 600 nm ¹⁴.
4. Transfiera 1 mL de la suspensión de las bacterias en un tubo de centrífuga. Centrifugar durante 5 min a 825 x g y 4 ° C y descarte el sobrenadante. Suspender y lavar las bacterias con 100 μl de tampón fosfato salino (PBS); repetir este paso 3 veces. Por último, resuspender las bacterias con 3 mL de PBS.
5. Calcular la concentración de bacterias utilizando turbidimetría^{15 de McFarland}.
   1. Transferencia de 100 a 500 μl de la suspensión de bacterias de un tubo colorimétrico hasta que la turbiedad es equivalente a un 0,5 McFarland estándar.
   2. Evaluar turbidez por comparación visual a 0,5 McFarland, cuando el contenido de bacterias alcanza aproximadamente 10⁸ UFC/mL.
      Nota: Asegúrese de que el volumen de la suspensión de bacterias es suficiente para los siguientes protocolos. Para cada conejo, el volumen de la suspensión de las bacterias es menos de 1 mL.
6. Transferir 0,2 mL de la suspensión bacteriana a una placa de agar y aplicarla uniformemente. Incubar la placa a 37 ° C por 16 h. recuento de las colonias de bacterias para comprobar la UFC de la suspensión de las bacterias.

2. elaboración de modelos de infección ósea

1. Mantener machos Nueva Zelanda conejos blancos, de 3 meses, en jaulas individuales, bajo condiciones controladas de aire (20 ± 1 ° C) y ciclos de iluminación de luz / oscuridad de 12 h/12 h. Ofrecemos rutina dieta y agua del grifo cada día.
2. Asegúrese de que en el momento de la cirugía que el conejo pesa más de 3 kg.
3. Anestesie conejos por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (3 mg por 100 g de peso corporal). Asegúrese de conejos están completamente anestesiados por la falta de responder a una pizca de pata. Reparación de conejos en la mesa de operaciones durante el procedimiento de la operación.
   Nota: Asegúrese de que el modelado duración del procedimiento es de menos de 1 h.
4. Afeitado de la región de la tibia proximal con una afeitadora eléctrica contra la dirección del crecimiento del pelo. Desinfectar la piel mediante la aplicación de una solución de povidona-yodo.
5. Marcar el extremo superior de la tibia y la posición del agujero perforación para inyección con S. aureus (la distancia al extremo superior de la tibia es 1,5 cm) con lápiz y regla. Asegúrese de que las posiciones de orificio taladrado en el centro de la meseta tibial horizontal (figura 1A).
6. Cortar tibia piel con un bisturí del nº 11 y haga una incisión de 1 cm en el periostio (figura 1B, C). Perforar un agujero de diámetro de 2 mm en la tibia mediante una unidad de taladro eléctrico del hueso (figura 1D).
7. Presione los orificios de 2 mm de diámetro en la meseta tibial con un cilindro de cera ósea de 2 mm de diámetro y 2 mm de altura (figura 1E). Quitar la cera de hueso libre en el plano horizontal de la meseta tibial (figura 1F). Compruebe que el orificio de 2 mm está lleno de cera de hueso (figura 1G).
   Nota: Asegúrese de que los agujeros están llenos de cera ósea activando el agujero con o sin derrame de sangre.
8. Coser el periostio y piel con sutura quirúrgica absorbible en una sutura vertical del colchón para evitar que el animal masticar las suturas (figura 1H).
9. Inyectar 1 x 10⁸ UFC/mL de las soluciones de S. aureus (30 μL por 100 g de peso corporal) con un inyector de asepsia de 1 mL (figura 1). Asegúrese de que las agujas penetran la cera de hueso e inyectan lentamente la solución de S. aureus en la médula ósea.
10. Mantener el animal en condiciones cálidas y limpias para evitar la pérdida de calor después de modelado. Vigilar frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Después de despertar, casa de los conejos en jaulas individuales con libre acceso al alimento y agua.

3. evaluación del modelo de infección ósea

1. A los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, coloque un conejos el fixer de conejo con la cabeza y oído fuera el fixer.
2. Extraer 2 mL de sangre de las venas auriculares en un recipiente de sangre anticoagulante (EDTA-K2) ácido de dipotásico etilendiaminotetracético. Extraer 1 mL de sangre de un vaso sanguíneo en un recipiente de sangre. Centrifugar el suero por 10 min con una velocidad de 651 x g a temperatura ambiente.
   1. Determinar el conteo de glóbulos blancos (WBC) en sangre entera usando un analizador bioquímico de sangre, y análisis de proteína C reactiva (PCR) por una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) método¹⁶.
3. A los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, anestesiar un conejo modelo con pentobarbital sódico a la dosis de 3 mg por 100 g de peso de cuerpo. Cortar tibia piel con un bisturí del nº 11 y haga una incisión de 2 cm en el periostio (figura 2A).
4. Limpiar la cera de hueso. Desbridar el hueso necrótico perforando dos agujeros de diámetro 4,8 mm adyacentes utilizando una unidad de taladro eléctrico del hueso (figura 2B). Desbridar necrosis de médula ósea y tejido de granulación con una cuchara de hueso (figura 2C).
   Nota: Limpiar el tejido óseo durante el desbridamiento para evitar tejido óseo en la médula ósea.
5. Raspar y limpiar el tejido óseo entre los dos orificios (figura 2D).
6. Separado 1 mL de médula ósea en placas de agar sangre de oveja. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C. Seleccione las placas de 30 – 300 colonias y calcular el número de colonias.
7. Al final del día 28 después de la infección, extraer a muestras de tibia a lo largo de los bordes de las articulaciones de la rodilla y el tobillo. Fijar a los especímenes de tibia en paraformaldehído al 4% para 24 h. Descalcifique los especímenes de tibia en EDTA 10% durante 8 semanas.
8. Deshidratar a los especímenes de tibia en una serie gradual de diluciones de etanol y luego incrustar en cera de parafina. Corte 4 secciones consecutivas de 5 μm de los planos coronales. Secciones con una hematoxilina y eosina (H & E) kit de tinción de la mancha.
9. Utilizar un microscopio para ver las secciones manchadas y grabación de imágenes de luz transmitidas con software estándar.

4. preparación de granos de la VCS

1. Añadir 1 g de vancomicina clorhidrato polvo a 9,5 g de sulfato de calcio grado médico y luego agregar 3 mL de solución salina normal a la alimentación mixta. Mezclar bien con una espátula de 30 a 45 s.
2. Coloque el producto mezclado en un molde de gel de silicona flexible (cilindro de 4,8 mm de diámetro y 4,8 mm de altura) y secar a temperatura ambiente por 15 minutos quitar los granos de la VCS por doblar el molde.

5. antibioterapia e implantación de hueso autógeno

1. Anestesie conejos modelo con pentobarbital sódico a la dosis de 3 mg por 100 g de peso de cuerpo en^{el día 28 después de la infección} . Afeitado de la región de la tibia proximal con una afeitadora eléctrica. Desinfectar la piel mediante la aplicación de solución de povidona-yodo.
   Nota: Asegúrese de que el procedimiento de modelización es menos de 1 h.
2. Afeitado de la región de la cola con una afeitadora eléctrica y desinfecte la cola mediante la aplicación de solución de povidona-yodo.
3. Corta la cola con tijeras quirúrgicas. Cortar cola piel con un bisturí del nº 11 y revelan el hueso de la cola. Coser la piel en la región de la cola con suturas quirúrgicas absorbibles en una sutura vertical del colchón para evitar que el animal masticar las suturas.
4. Retire cualquier músculo, tejidos blandos y periostio. Separar el hueso de la cola en cada empalme y transferir el fragmento de hueso a un plato de plástico de 100 mm que contiene solución salina estéril.
5. Implante de 4 pedazos de granos de la VCS (cilindro de 4,8 mm de diámetro y 4,8 mm de altura, vancomicina 1,25 mg por unidad de grano) en la cavidad de la médula ósea usando pinzas curvadas (figura 2E).
6. Llenar el defecto óseo con 8 pedazos de huesos autógenos (cilindro de 2 mm de diámetro y 4 mm de altura por cada pieza) utilizando curva pinzas (figura 2E).
7. Coser el periostio y piel con suturas quirúrgicas absorbibles en forma de sutura colchón (figura 2F).
   Nota: Mantener la temperatura a 25 ° C durante la cirugía.
8. Mantener el animal en condiciones cálidas y limpias para evitar pérdida de calor después de la cirugía. Vigilar frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Después de despertar, casa de los conejos en jaulas individuales con libre acceso al alimento y agua.

6. evaluaciones de actividad antibiótica

1. Poner conejos en un fixer de conejo y la cabeza y oído fuera el fixer en 2, 4, 6 y 8 semanas después del tratamiento.
2. Extraer la sangre de las venas auriculares con vascular anticoagulante EDTA-K2. Extraer 1 mL de sangre de un vaso sanguíneo en un recipiente de sangre. Centrifugar el suero por 10 min con una velocidad de 651 x g a temperatura ambiente.
3. Determinar el recuento de glóbulos blancos (WBC) en sangre entera mediante analizador bioquímico de sangre y proteína C reactiva (PCR) por un método de ELISA¹⁶.

7. evaluaciones de la regeneración ósea

1. Eutanasia de conejos mediante la inyección con una dosis de pentobarbital sódico, en el final de 8 o 12 semanas después del tratamiento.
2. Extraer a muestras de la tibia, a lo largo de los bordes de las articulaciones de la rodilla y el tobillo. Desbridar los músculos y capas fasciales.
3. Analizar estructura de tibia mediante tomografía computada micro (micro-CT). Elija un área oval 4,8 mm de diámetro y 9.6 mm de longitud como la región de interés (ROI). Reconstruir imágenes 3D del modelo utilizando datos de mapa de bits.
4. Elegir cuentas de la relación de volumen de volumen tisular del hueso (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th), número de trabécula (Tb.N) y separación trabecular (Tb.Sp)from the3D modelos para evaluar la regeneración ósea.

Resultados

Evaluación del modelo de infección ósea
Después de la infección con S. aureus, las manifestaciones patológicas de los conejos fueron similares a lo síntoma representativo de osteomielitis crónica en la clínica. En nuestro estudio, 30 conejos fueron infectados y sometidos como grupo modelo, y se sometieron 10 conejos como animales de control. Todos los conejos modelo han infectado los senos del sitio local de tibia, con pus blanco y amarillo sobre el f...

Discusión

En los estudios anteriores, se construyeron diversos tipos de modelos animales para estudiar ambos infección de hueso aguda y crónica; sin embargo, la búsqueda del modelo ideal persiste^17,18. Además, el modelo de infección ósea ideal pretende simular las características patológicas de la infección del hueso en el ajuste clínico, mientras que los períodos de modelación, permanecen bajo costo y fácil de realizar. Hasta ahora, el modelo de infección de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180