Trattamento con vancomicina caricato di solfato di calcio e dell'osso autogeno in un modello di coniglio migliorata dell'infezione dell'osso

Riepilogo

Questo studio presenta un coniglio migliorato modello infettato da Staphylococcus aureus bloccando la stessa quantità di batteri nel midollo osseo. Vancomicina caricato di solfato di calcio e dell'osso autogeno sono utilizzati per il trattamento di riparazione dell'osso e antibiotico. Il protocollo potrebbe essere utile per studiare l'infezione dell'osso e la rigenerazione.

Abstract

Risultati di infezione dell'osso dall'invasione batterica, che è estremamente difficile da trattare in chirurgia clinica, ortopedica e traumatica. L'infezione ossea può provocare l'infiammazione continua, osteomielite ed eventuale osso non-Unione. Istituzione di un modello animale fattibile, riproducibile è importante alle ossa ricerca di infezione e di trattamento antibiotico. Come un modello in vivo, il modello di coniglio è ampiamente usato nella ricerca di infezione dell'osso. Tuttavia, gli studi precedenti sul coniglio dell'osso ha mostrati che lo stato di infezione era incoerente, così come la quantità di batteri variabile di modelli di infezione. Questo studio presenta un metodo chirurgico migliore per indurre l'infezione dell'osso su un coniglio, bloccando i batteri nel midollo osseo. Quindi, valutazioni multi-livelli possono essere effettuate per verificare il metodo di modellazione.

In generale, sbrigliamento del tessuto necrotico e l'impianto di solfato di calcio di vancomicina-caricato (VCS) sono predominanti nel trattamento antibiotico. Sebbene il solfato di calcio in VCS benefici Osteocita strisciando e nuova crescita ossea, voluminosa dell'osso difetti si verificano dopo rimuovere il tessuto morto. L'osso autogeno (AB) è una strategia interessante per superare i difetti dell'osso per il trattamento di difetti ossei massiccia dopo rimuovere il tessuto morto osso necrotico.

In questo studio, abbiamo usato l'osso della coda come un osso autologo impiantato nel difetto osseo. Riparazione ossea è stata misurata utilizzando micro-computare-tomografia (micro-CT) e l'analisi istologica dopo sacrificio animale. Di conseguenza, nel gruppo VCS, non-Unione dell'osso è stata ottenuta costantemente. Al contrario, le zone di difetto dell'osso nel gruppo VCS-AB sono state diminuite significativamente. Il presente metodo di modellazione descritto un metodo riproducibile, fattibile, stabile per preparare un modello di infezione dell'osso. Il trattamento di VCS-AB è provocato da tassi più bassi di pseudoartrosi dell'osso dopo il trattamento antibiotico. Il modello di infezione migliore dell'osso e il trattamento di combinazione di VCS e osso autogeno potrebbe essere utile per studiare i meccanismi di fondo nella rigenerazione ossea dell'osso e infezione pertinente per applicazioni ortopediche di traumatologia.

Introduzione

L'infezione dell'osso provoca solitamente da batteri o altri invasione microorganismo dopo traumi, fratture ossee o altre malattie di osso¹. L'infezione dell'osso può indurre un alto livello di distruzione del tessuto dell'osso e l'infiammazione. Nella clinica, lo Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) è l'agente causativo predominante di osso infezione^2,3. L'infezione dell'osso è doloroso e debilitante e spesso assume un decorso cronico che è estremamente difficile da trattare⁴. Allo stato attuale, lo sbrigliamento del tessuto necrotico e impiantare dei branelli di vancomicina-caricati del calcio (VCS) sono stati confermati come una strategia efficace per il controllo di infezione locale^5,6. Tuttavia, 10-15% dei pazienti ha avvertito un processo di riparazione dell'osso prolungato, ritardi di consolidazione o pseudoartrosi dopo trattamento anti-infezione⁷. Il grande segmento di un difetto dell'osso è la questione più difficile per i chirurghi ortopedici. Un innesto di osso autologo è considerato la sostituzione ottimale dell'osso nell'osso non sindacale trattamento^8,9.

Ad oggi, la maggior parte degli studi sull'osso infezione e l'impianto di osso autologo sono stati condotti in vari tipi di modelli animali, come i ratti, conigli, cani, maiali e pecore^10,11. Modelli di coniglio sono più comunemente utilizzati per studi di infezione dell'osso, come prima interpretata da Norden e Kennedy nel 1970^12,13. Nel nostro studio precedente, abbiamo utilizzato modelli di coniglio seguendo il metodo di Norden, e abbiamo trovato che la quantità di S. aureus iniettato nel midollo osseo non era possibile quantificare con precisione, come la fuoriuscita di sangue dal midollo osseo ha condotto all'overflow di soluzione di batteri.

Questo articolo presenta un metodo chirurgico migliore per indurre infezione ossea sui conigli. Al termine della procedura, un'analisi biochimica del sangue, un esame batteriologico e un esame istopatologico sono stati effettuati per verificare il modello di infezione dell'osso. Quindi, VCS è stata impiantata per inibire l'infezione e l'osso autogeno è stato impiantato per promuovere la rigenerazione ossea.

Protocollo

I conigli utilizzati nel presente studio sono stati trattati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le procedure sperimentali sono state seguite dalle regole di bioetica Comitato di Zhejiang Accademia di medicina tradizionale cinese.

1. preparazione della sospensione batterica

1. Sciogliere 0,5 mg di S. aureus liofilizzazione polvere (ATCC 6538) con 0,3 mL di terreno di coltura di Luria-Bertani. Mescolare la sospensione completamente.
2. Inoculare la sospensione di batteri su piastre di agar soia triptico ed incubare le colonie batteriche a 37 ° C per 16 h.
3. Selezionare una singola colonia batterica formando unità (CFU) e cultura in tubi di brodo di soia triptico per 24 h. eseguire una sottocultura per circa 24 h a 37 ° C e ottenere metà-logaritmica crescita fase batteri dopo 16-18 h, quando il valore di densità ottica (OD) è 0,6 a 600 nm ¹⁴.
4. Trasferire 1 mL di sospensione di batteri in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 5 min a 825 x g e a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere e lavare i batteri con 100 µ l di tampone fosfato salino (PBS); Ripetere l'operazione 3 volte. Infine, risospendere i batteri con 3 mL di PBS.
5. Stimare la concentrazione di batteri usando Turbidimetria^{15 di McFarland}.
   1. Trasferire 100 e 500 µ l della sospensione di batteri in una provetta colorimetrica, fino a quando la torbidità è equivalente a un 0,5 McFarland standard.
   2. Valutare la torbidità di confronto visivo per il 0,5 McFarland, quando il contenuto di batteri raggiunge circa 10⁸ CFU/mL.
      Nota: Assicurarsi che il volume della sospensione di batteri è sufficiente per i seguenti protocolli. Per ogni coniglio, il volume della sospensione di batteri è inferiore a 1 mL.
6. Trasferire 0.2 mL di sospensione batterica ad una piastra di agar e applicarlo in modo uniforme. Incubare la piastra a 37 ° C per 16 h. conteggio delle colonie di batteri per verificare il CFU della sospensione di batteri.

2. preparazione di modelli di infezione dell'osso

1. Mantenere maschio Nuova Zelanda conigli bianchi, invecchiati 3 mesi, in gabbie individuali, sotto condizioni di aria-controllato (20 ± 1 ° C) e cicli di illuminazione luce-buio di 12 h/12 h. Offriamo dieta ordinaria e acqua di rubinetto al giorno.
2. Assicurare che al momento dell'intervento che il coniglio pesa più di 3 kg.
3. Anestetizzare conigli tramite l'iniezione intraperitoneale con sodio pentobarbital (3 mg per 100 g di peso corporeo). Assicurarsi di conigli sono completamente anestetizzati da un tentativo di rispondere a un pizzico di zampa. Difficoltà conigli sul tavolo operatorio durante la procedura di funzionamento.
   Nota: Assicurarsi che la modellazione procedura dura meno di 1 h.
4. Radere l'area di tibia prossimale utilizzando un rasoio elettrico contro la direzione della crescita dei capelli. Disinfettare la pelle applicando una soluzione povidone-iodio.
5. Contrassegnare l'estremità superiore della tibia e la posizione del foro foratura per iniezione con S. aureus (la distanza all'estremità superiore della tibia è 1,5 cm) con penna e righello. Assicurarsi che la posizione dei fori perforazione sono nel mezzo del plateau tibia in orizzontale (Figura 1A).
6. Tagliare la tibia pelle usando un bisturi n. 11 e praticare un'incisione di 1 cm nel periostio (Figura 1B, C). Effettuare un foro di diametro di 2 mm nella tibia utilizzando un'unità di trapano elettrico dell'osso (Figura 1D).
7. Premere i fori di diametro di 2 mm nel plateau tibia con un cilindro di cera dell'osso del diametro di 2 mm e 2 mm di altezza (Figura 1E). Rimuovere la cera di ricambio osseo lungo il piano orizzontale del plateau tibia (Figura 1,F). Controllare che il foro di 2 mm è pieno di cera dell'osso (Figura 1G).
   Nota: Assicurarsi che i fori siano pieni di cera dell'osso controllando il foro con o senza troppo pieno di sangue.
8. Cucire il periostio e pelle con sutura chirurgica riassorbibile in una sutura verticale materasso per impedire che l'animale mastica i punti di sutura (Figura 1H).
9. Iniettare 1 x 10⁸ UFC/mL delle soluzioni di S. aureus (30 µ l per 100 g di peso corporeo) con un iniettore di asepsi 1 mL (Figura 1ho). Assicurarsi che gli aghi penetrano la cera dell'osso e iniettare lentamente la soluzione di S. aureus nel midollo osseo.
10. Mantenere l'animale in condizioni di caldo e pulite per evitare la perdita di calore dopo la modellazione. Monitorare la frequenza respiratoria e cardiaca. Dopo il risveglio, casa conigli in gabbie individuali con libero accesso al cibo e acqua.

3. valutazione del modello di infezione dell'osso

1. A giorni 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione, è necessario posizionare conigli nel fissatore di coniglio con la testa e orecchio fuori il fissatore.
2. Disegnare 2 mL di sangue dalle vene auricolare in un contenitore di sangue dell'anticoagulante di dipotassio Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA-K2). Disegnare 1 mL di sangue da un vaso sanguigno in un contenitore di sangue. Centrifugare il siero per 10 min con una velocità di 651 x g e a temperatura ambiente.
   1. Determinare il numero di globuli bianchi (WBC) nel sangue intero utilizzando un analizzatore di biochimica del sangue, e proteina C - reattiva (CRP) di un enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) metodo¹⁶del test.
3. Ai giorni 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione, anestetizzare un coniglio modello con sodio pentobarbital al dosaggio di 3 mg per peso corporeo di 100 g. Tagliare la tibia pelle usando un bisturi n. 11 e praticare un'incisione di 2 cm nel periostio (Figura 2A).
4. Pulire la cera dell'osso. Sbrigliare osso necrotico di punzonatura due adiacenti 4,8 mm diametro fori utilizzando un'unità di trapano elettrico dell'osso (Figura 2B). Sbrigliare necrotico del midollo osseo e del tessuto di granulazione con un cucchiaio di osso (Figura 2C).
   Nota: Pulire tessuto osseo durante lo sbrigliamento per evitare tessuto osseo restanti nel midollo osseo.
5. Raschiare e pulire il tessuto osseo tra i due fori (Figura 2D).
6. Spread 1 mL di midollo osseo su piastre di agar sangue di pecora. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C. Piastre di 30 – 300 colonie di selezionare e calcolare il numero di colonie.
7. Alla fine del giorno 28 dopo l'infezione, estrarre campioni di tibia lungo i bordi delle articolazioni del ginocchio e della caviglia. Difficoltà gli esemplari di tibia in paraformaldeide al 4% per 24 h. DECALCIF gli esemplari di tibia in 10% EDTA per 8 settimane.
8. Disidratare gli esemplari di tibia in una serie graduata di diluizioni di etanolo e quindi incorporare in paraffina. Tagliare 4 consecutivi 5 µm sezioni dai piani coronale. Macchia di sezioni con ematossilina ed eosina (H & E) colorazione kit.
9. Utilizzare un microscopio per visualizzare le sezioni macchiate e registrare immagini trasmesse luce con software standard.

4. preparazione del VCS perline

1. Aggiungere 1 g di vancomicina cloridrato polvere a 9,5 g di solfato di calcio di grado medico e quindi aggiungere 3 mL di soluzione salina normale per l'alimentazione mista. Mescolare accuratamente con una spatola per 30-45 s.
2. Posizionare il prodotto miscelato in uno stampo flessibile gel di silice (cilindro di diametro 4,8 mm e 4,8 mm di altezza) e asciugare a temperatura ambiente per 15 minuti, rimuovere le perline VCS flettendo la muffa.

5. antibiotici e l'impianto di osso autologo

1. Anestetizzare conigli modello con sodio pentobarbital al dosaggio di 3 mg per peso corporeo di 100 g al 28^° giorno dopo l'infezione. Radere l'area di tibia prossimale utilizzando un rasoio elettrico. Disinfettare la pelle applicando soluzione povidone-iodio.
   Nota: Assicurarsi che la procedura di modellazione è meno di 1 h.
2. Radere la regione di coda utilizzando un rasoio elettrico e disinfettare la coda applicando soluzione povidone-iodio.
3. Tagliare la coda utilizzando forbici chirurgiche. Tagliare la coda della pelle usando un bisturi n. 11 e rivelare l'osso della coda. Cucire la pelle in corrispondenza della regione di coda con suture assorbibili chirurgiche in una sutura verticale materasso per impedire all'animale di masticare le suture.
4. Rimuovere qualsiasi muscolo, il tessuto molle e il periostio. Staccare l'osso della coda ad ogni giunto e trasferire il frammento di osso per un piatto di plastica di 100 mm contenente soluzione fisiologica sterile.
5. Impianto 4 pezzi di perline VCS (cilindro di diametro 4,8 mm e 4,8 mm di altezza, vancomicina 1,25 mg al pezzo del branello) nella cavità del midollo con Pinzette curve (Figura 2E).
6. Riempire il difetto osseo con 8 pezzi di ossa autogena (cilindro del diametro di 2 mm e 4 mm di altezza per ogni pezzo) usando curve pinzette (Figura 2E).
7. Cucire il periostio e pelle con suture chirurgiche assorbibili in maniera di sutura materasso (Figura 2F).
   Nota: Mantenere la temperatura a 25 ° C durante la chirurgia.
8. Mantenere l'animale in condizioni di caldo e pulite per evitare la perdita di calore dopo la chirurgia. Monitorare la frequenza respiratoria e cardiaca. Dopo il risveglio, casa conigli in gabbie individuali con libero accesso al cibo e acqua.

6. Le valutazioni di attività antibiotica

1. Mettere i conigli in un fissatore di coniglio e posizionare l'orecchio fuori il fissatore e testa a 2, 4, 6 e 8 settimane dopo il trattamento.
2. Prelevare il sangue dalle vene auricolare con vaso sanguigno dell'anticoagulante EDTA K2. Disegnare 1 mL di sangue da un vaso sanguigno in un contenitore di sangue. Centrifugare il siero per 10 min con una velocità di 651 x g e a temperatura ambiente.
3. Determinare il conteggio di globuli bianchi (WBC) nel sangue intero mediante Analizzatore di biochimica del sangue e la proteina C - reattiva (CRP) di un metodo di ELISA¹⁶.

7. Le valutazioni di rigenerazione ossea

1. Eutanasia conigli iniettando con un over dosaggi di sodio pentobarbital, alla fine di 8 o 12 settimane dopo il trattamento.
2. Estrarre i campioni di tibia, lungo i bordi delle articolazioni del ginocchio e della caviglia. Sbrigliare i muscoli e strati fasciali.
3. Analizzare la struttura della tibia utilizzando micro-tomografia (micro-CT). Scegliere un diametro di 4,8 mm di area ovale e 9.6 mm di lunghezza come la regione di interesse (ROI). Ricostruire le immagini del modello 3D utilizzando dati bitmap.
4. Scegliere punteggi del rapporto del volume volume/tessuto osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecola numero (Tb.N) e trabecular separazione (Tb.Sp)from the3D modelli per valutare la rigenerazione ossea.

Risultati

Valutazione del modello di infezione dell'osso
Dopo l'infezione con S. aureus, le manifestazioni patologiche dei conigli erano simili al sintomo rappresentativo di osteomielite cronica nella clinica. Nel nostro studio, 30 conigli sono stati infettati e sottomesso come un gruppo di modello, e 10 conigli sono stati sottoposti come animali di controllo. Tutti i conigli di modello hanno infettato i seni del sito locale di tibia, con pus bianco e giallo sul flusso ...

Discussione

Negli studi precedenti, sono stati costruiti vari tipi di modelli animali per studiare sia l'infezione acuta e cronica dell'osso; Tuttavia, la ricerca per il modello ideale persiste ancora^17,18. Inoltre, il modello di infezione ossea ideale è previsto per simulare le caratteristiche patologiche di infezione ossea in ambiente clinico, mentre i periodi di modellazione, rimanere basso costo e facile da realizzare. Finora, il modello di infezione dell'osso di conigl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180