ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Summary

פרוטוקול זה משלב האפיון של מדגם חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל נימי הקרנה מחייב מהיר עבור ליגנדים טעון על ידי אלקטרופורזה נימי זיקה. מומלץ חלבונים עם מבנה גמיש, כגון חלבונים המתוסבכים ממהותם, כדי לקבוע את כל ההבדלים ביומן מחייב עבור conformers שונים.

Abstract

הצמחים תלויים חריפה לסביבה שלהם. על מנת להסתגל לשינויים מלחיץ (למשל, הבצורת, מליחות גבוהה), צמחים להתפתח כיתות של חלבונים המתוסבכים מהותית (IDPs) כדי להפחית סטרס חמצוני, osmotic. מאמר זה משתמש בשילוב של נימי בג'ל (CGE) ניידות shift זיקה אלקטרופורזה (ACE) כדי לתאר את התנהגות מחייב conformers שונים של AtHIRD11 IDP מ תודרנית לבנה. CGE משמש כדי לאשר את הטוהר של AtHIRD11 כדי לא לכלול שברים, שינויים posttranslational, זיהומים אחרים כמו סיבות דפוסי השיא מורכב. בחלק זה של הניסוי, הרכיבים דגימה שונים המופרדים באמצעות ג'ל צמיגה בתוך נימי על ידי ההמונים שונים שלהם, מזוהה עם גלאי מערך דיודות. לאחר מכן, אופן הפעולה של איגוד של המדגם כלפי יונים מתכתיים שונים נחקר על ידי אס. במקרה זה, ליגנד נוסף את בופר, המשמרת בזמן ההעברה נמדד על מנת לקבוע אם התרחש אירוע מחייב או לא. אחד היתרונות של שימוש השילוב של CGE ו- ACE כדי לקבוע את אופן הפעולה של איגוד של IDP הוא האפשרות להפוך את בג'ל ו איגוד וזמינותו. יתר על כן, CGE מראה מגבלה נמוכה יותר של זיהוי מאשר בג'ל קלאסית ו ACE יש אפשרות לקבוע את סיבת איגוד של ליגנד בצורה מהירה. בנוסף, ניתן להחיל ACE גם למינים אחרים טעונים יותר יונים מתכתיים. עם זאת, השימוש בשיטה זו עבור איגוד ניסויים היא מוגבלת ביכולתה לקבוע את מספר אתרי קישור. ובכל זאת, השילוב של CGE ו ACE ניתן להתאים עבור אפיון ההתנהגות איגוד של דוגמה חלבון לכיוון ליגנדים טעונה רבים.

Introduction

צמחים הם תלויות יותר לסביבתם מאשר צורות חיים רבות אחרות. מאז צמחים לא ניתן להעביר למקומות אחרים, הם נאלצים להסתגל לשינויים בסביבתם (למשל, הבצורת, ריכוז המלח גבוה וקר). כתוצאה מכך, צמחים פיתח חלבונים מיוחדים מתח כמו dehydrins, אשר למלא משימות סעפת להפחתת מתח התא הקשורים מליחות גבוהה. חלבונים אלה לאגד מים, יונים בתוך תאים, להפחית סטרס חמצוני על-ידי כריכת Cu^{2 +}-יונים, אינטראקציה עם פוספוליפידים, כמו גם את cytoskeletons. יתר על כן, איגוד Zn^{2 +}-יונים מאפשר חלבונים אלה לשמש גורמי שעתוק. היכולת שלהם לאגד Ca^{2 +}-יונים לאחר זרחון היה גם דיווח¹.

ההתנהגות משולבות של חלבונים אלה קשורה העדר של חומצת אמינו הידרופוביות משקעים. כתוצאה מכך, הם חסרי כל אינטראקציות הידרופוביות בתוך הרשת פפטיד, גם מבנה מאולצות. עם זאת, כי חלבונים אלה חסרים מבנה מגבילות, הם יכולים לכבוש conformers שונים תחת באותם התנאים. לכן, הם ניתן לתאר בצורה הטובה ביותר כמו הרכב של מבנים, ולא עם קונפורמציה יחיד. חלבונים עם מאפיינים אלה ידועים כמו ממהותם סמוקים חלבונים (IDPs) הם רעיון בשימוש נרחב עבור מתח חלבונים ואת crosstalk בין מסלולים שונים התאים האיקריוטים².

אחד IDPs אלה הקשורות ללחץ הוא AtHIRD11. זה אחד של תודרנית לבנהרוב מאוד לידי ביטוי בצורת IDPs. לפיכך, ניתן להפריד את conformers שונים על ידי שלהם רדיוס אפקטיבי לחייב יחס, נימי אלקטרופורזה (CE) שימש לחקירה נוספת. ניסויים אייס קודמות הדגימו את האינטראקציות בין AtHIRD11 יונים של מתכות המעבר כגון Cu^{2 +}-, Zn^{2 +}-, Co^{2 +2 +}Ni-יונים. ניתן למצוא את התוצאות המפורטות ב. ההרה et al. ³ ו. Nachbar et al. ⁴.

שיטת אס שבה ייעשה שימוש כאן מבוסס על עבודותיו שפורסמו קודם לכן⁶. עם זאת, התוספת של acetanilide סמן EOF לדגימת חלבון אינה מתאימה. AtHIRD11 מראה רחב שיא תבניות, הוספת סמן EOF המדגם להסוות שתי הפסגות. לכן, משמש הסמן ריצה נפרדת. לפני הפעולה מחייב נבדק, הוא אישר כי הפסגות נמצאו במהלך ניסויים קודמים הם מן conformers שונים. לפיכך, CGE משמש כדי להבחין בין conformers חלבון, ששינה post-translational חלבון, זיהומים, כמו שברי AtHIRD11, על-ידי ההמונים שלהם שונה. לאחר מכן, התנהגות AtHIRD11 של המדגם מאופיין מחייב כלפי שונים יונים מתכתיים שונים הוא חקר.

מטרת המאמר היא לתאר את התקנה ניסיונית להבחין בין IDP ורכיבים אחרים של מדגם על מנת להעריך את ההבדלים בהתנהגות איגוד של conformers שונים.

Protocol

1. הכנת הכלים אלקטרופורזה נימי

1. להכין את נימי הדם
   1. השימוש לחיתוך זכוכית לחתוך סיליקה התמזגו חשופים נימי עם ציפוי חיצוני פוליאימיד וקוטר פנימי של 50 מיקרומטר 33 ס מ (עבור הניסוי CGE), נימים זמן 30 ס מ (עבור הניסוי ACE). לבצע החיתוך על צלחת זכוכית.
      הערה: 2 כיוונונים ניסיוני שונים פותחו עבור 2 מכשירים שונים. כדי להשתמש בהם על כלים אחרים, העברה שיטה נכונה צריך להתבצע ויש אורך נימי יותאם האורך המותר של המכשיר.
   2. השתמש בעט כדי לסמן באמצע חלון זיהוי רחב 1 ס"מ ממרחק של 24.5 ס"מ מקצה לקצה נימי לניסוי. CGE ו- 21.5 ס מ מקצה לקצה נימי לניסוי אייס (אורך).
   3. הסר את ציפוי חיצוני פוליאימיד הנימים מאת לשרוף אותו עם מבער, 0.5 ס מ לפני ואחרי הסימן. באופן דומה, להשתמש במבער כדי להסיר 1 ס מ של הציפוי בשני הקצוות של הנימים.
      הערה: אורך יעיל עשוי להשתנות מעט מאז זה מסתמך על מכשיר נימי אלקטרופורזה.
   4. לנקות את הקצוות של הנימים והחלונות זיהוי עם אתנול וביו -רקמה רכה.
      הערה: הנימים ללא ציפוי הן פחות גמיש וסביר לשבור.
2. להתקין את נימי הדם
   1. התקן של נימי לתוך מערכת לספירה עם החלון זיהוי ליד השקע.
      הערה: CE לכלי מודלים שונים יש מערכות אחזקה שונות הנימים. עיין במדריך של המכשיר בשימוש על ההוראות המדויקות.

2. מכינים את הפתרונות

1. להכין את הפתרונות לניתוח CGE
   1. להכין את טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס)-מאגר מרחביות (100 mM/1% w/v) ב- pH 8.0.
      1. להשתמש מסכה הנשימה ואת תא במשקל 1.00 גר' dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) בתוך 100-מ.
      2. הוסף 1.21 גר' טריס לתוך כשהספל 100 מל ' להמיס באמצעות 50 מ של מים יונים ובר מערבבים מגנטי פגים.
      3. מכניסים אלקטרודה pH של הפתרון ולהתאים את ה-pH ל 8.0 באמצעות 1.0 M HCl.
      4. למלא את הפתרון לתוך בקבוקון הנפחי 100 מ ל ומוסיפים מים יונים עד לסימון. לנער את זה בעדינות כדי למנוע כל ויוצרים קצף.
   2. להכין את הפתרון NaOH 0.1 M.
      1. לשקול g 4.0 של NaOH בבקבוקון הנפחי 100 מ. למלא אותו עד כדי לסמן יונים מים כדי ליצור מניה 1 מ'.
      2. השתמש פיפטה הנורה של 10 מ"ל כדי להעביר 10 מ"ל של פתרון זה עוד 100 מ ל סטריליות ולמלא אותה עד כדי לסמן עם מים יונים.
   3. להכין את הפתרון HCl 0.1 M.
      1. להכניס 10 מיליליטר 10 M HCl 100 מ ל סטריליות באמצעות פיפטה הנפחי של 10 מ"ל ולמלא אותה עד כדי לסמן עם מים יונים. חזור על שלב זה כדי להשיג את ה-M HCl 0.1.
   4. להכין את הפתרון הדגימה.
      1. שוקלים 0.5 מ ג של החלבון לתוך צינור 1 מ"ל. להוסיף 0.5 mL המאגר ג'ל טריס-מרחביות מהשלב 2.1.1 עם micropipette.
      2. להמיס את החלבון ע י ניעור בעדינות כדי למנוע כל ויוצרים קצף והשפלה של החלבון.
         הערה: השתמש ultrasonication אם לא יכול להיות מומס החלבון כפי שמתואר; הימנע כל חימום של הפתרון.
   5. למלא את הפתרונות לתוך הבקבוקונים.
      1. לסנן כל פתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר polyvinylidene פלואוריד (PVDF) סינון באמצעות מזרק נאותה של ישירות לתוך המבחנה.
         הערה: על פתרונות המכיל ג'ל, הלחץ חזרה יכולה להיות גבוהה לאור שלו צמיגות גבוהה.
      2. מכינים צלוחיות 15 בסך ולסמן כל כדי למנוע טעויות בכל.
         1. למלא 3 צלוחיות עם dodecyl זמינים מסחרית נתרן גופרתי (מרחביות) ג'ל בופר ב- pH 8.
            הערה: השימוש חיץ ג'ל מרחביות זמינים מסחרית מספק תוצאות מדויקות יותר.
         2. למלא מבחנה 1 0.1 M NaOH ו- 1 בקבוקון עם 0.1 M HCl עבור שטיפה.
         3. למלא מבחנה 1 הפתרון הדגימה.
         4. למלא 5 מבחנות מים יונים ו- 4 בקבוקונים עם 0.1 מ ל מים יונים (טובלים בקבוקונים).
            הערה: הבקבוקונים וטבלו משמשים בקבוקונים פסולת במהלך שטיפה של נימי לפני כל הפעלה. הקצוות נימי טבל במים כדי לשטוף מכל משקעים ג'ל.
2. להכין את הפתרונות עבור ניתוח ACE
   1. להכין את הפתרון NaOH 1 מ'.
      1. לשקול g 4.0 של NaOH בבקבוקון הנפחי 100 מ.
      2. למלא אותו עד כדי לסמן יונים מים כדי ליצור מניה 1 מ'.
   2. להכין את החומצה ethylendiaminetetraacetic 0.1 M (EDTA) בפתרון NaOH 0.1 M.
      1. העברת 10 מ"ל של NaOH 0.1 M בבקבוקון הנפחי 100 מ ל באמצעות פיפטה הנורה של 10 מ"ל. למלא אותו עד כדי לסמן את המים יונים.
      2. שוקל 2.42 גר' במשקל בסירה EDTA, לפזר את המתחם מלא ב- 100 מ של 0.1 M NaOH.
   3. הכינו את טריס (30 מ מ) בופר.
      1. להוסיף 3.63 ש g של טריס, 200 מ של מים יונים, וכן בר מערבבים גביע 500 מ"ל. מניחים את הספל על צלחת stir, הפעילו את זה.
      2. מכניסים אלקטרודה מד pH כשהספל ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 0.1 M HCl.
      3. למלא את הפתרון 1 ליטר סטריליות, מילוי עד כדי לסמן את המים יונים.
         הערה: הליך זה יש צורך לחזור או בקבוקון נפח גדול יותר יש צורך מאז יותר מ 1 ליטר נדרש עבור כל ניתוח.
   4. להכין את הזרימה electroosmotic acetanilide (EOF)-מרקר (60 מיקרומטר) פתרון.
      1. להוסיף 6 מ ג של acetanilide ו- 100 מ של טריס מאגר 100 מ ל סטריליות.
      2. לשים על סטריליות באמבט אולטראסוני, הפעילו את זה במשך 30 דקות.
   5. להכין את הפתרון מדגם (1 mg/mL).
      1. לשים צינור microcentrifuge 0.5 mL איזון דיוק והוסף 0.3 מ ג של אבקת AtHIRD11 הליחה לתוך הצינור.
      2. השתמש micropipette כדי להוסיף mL 0.3 של בופר טריס 30 מ מ (pH 7.4) בצינור. לנער את הצינור בקפידה כדי להמיס את החלבון.
   6. הכינו את הפתרונות ליגנד.
      1. להכין את הפתרון CaCl מניות₂ (5 מ מ).
         1. לקחת סירה במשקל, שים את זה על איזון האנליטי, שוקל 36.76 מ"ג CaCl₂* H₂O.
         2. שימוש של micropipette, לשטוף את CaCl₂* H₂O משקילת סירה לתוך בקבוקון נפח 50 מ עם המאגר טריס מוכן קודם לכן.
         3. למלא את סטריליות המאגר טריס עד לסימון.
      2. הכינו את הפתרונות המניות הנותרים (5 מ מ).
         1. וחזור על שלב מספר 2.2.6.1 באמצעות המתכת אחרים מלחי במקום CaCl₂* H₂O [MgCl₂: מ ג 23.80, BaCl₂: 26.02 mg, Sr (₃)₂: מ ג 52.91, MnCl₂: 31.46 מ"ג, SeCl₄: מ ג 52.91, CoCl ₂* 2 H₂o: 41.47 מ"ג, CuCl₂* 2 H₂o: 42.62 מ"ג, ZnCl₂: 3.41 מ"ג, ו- NiCl₂* 6-אייץ '-₂o: מ"ג 59.43].
            הערה: הפתרון₂ ZnCl יש ריכוז של 0.5 מ מ. מאז נצפו חזק אינטראקציות בין היונים נימי החומה הפנימית, הריכוז צומצם לפי פקטור של 10⁴.
      3. להכין את הפתרון₂ CaCl מיקרומטר 500.
         1. למלא 10 מ"ל של הפתרון מניות של₂ CaCl ולשים אותו סטריליות 100 מ.
         2. למלא את סטריליות בופר טריס לסימן ומנערים את הבקבוקון.
      4. להכין את הפתרון₂ CaCl 250 מיקרומטר.
         1. מילוי מ של הפתרון מניות של₂ CaCl ולשים אותו סטריליות 100 מ.
         2. למלא את סטריליות בופר טריס לסימן ומנערים את הבקבוקון.
      5. חזור על שלבים 2.2.6.3 ו- 2.2.6.4 עבור מניות פתרונות אחרים.
   7. למלא את פתרונות הבקבוקונים.
      הערה: כל הפעלה חוזרת ונשנית צריך ערכה של כניסת ולשקע בקבוקונים. השימוש של פתרונות ליגנד טריים כניסת, שקע מפחית את המשמרות בזמן ההעברה לאחר כל הפעלה.
      1. למלא את הפתרון₂ CaCl מיקרומטר 250 ב מזרק 10 מ"ל.
      2. שם מסנן PVDF מיקרומטר 0.22 על המזרק, לדחוף 2 מ"ל של הפתרון דרך המסנן בעזרת המזרק כדי למחוק פתרון מסונן זה.
      3. למלא 10 מבחנות עד האחסון המרבי המותר הפתרון₂ CaCl מיקרומטר 250 הנותרים של המזרק. לסמן כל אחת 250 מיקרומטר CaCl ₂ פתרון המבחנה מפרץ צר.
      4. תמלא בקבוקונים 10 עד שהם חצי ממולא עם הפתרון₂ CaCl 250 מיקרומטר. לסמן כל אחת 250 מיקרומטר CaCl ₂ פתרון המבחנה עודפים.
      5. חזור על שלבים 2.2.7.1 - 2.2.7.4 לפתרונות אחרים מתכת המכילים מלח.
      6. חזור על השלבים עבור כל זוג של בקבוקונים כניסת ולשקע להשתמש במקום זאת את 30 מ מ טריס בופר (pH 7.4).
         הערה: 30 mmol/L טריס מאגר pH 7.4 משמש בין שלשול על מנת לקבל נתונים זמן ההעברה עבור החלבון בהעדר יונים מתכתיים. זה הכרחי כדי להזניח את השינויים ב- EOF.
      7. חזור על השלבים שלעיל בקבוקון אחד להשתמש במקום זאת את acetanilide EOF-מרקר (60 מיקרומטר) פתרון. כמו כן, חזור על שלבים אלה באמצעות הפתרון מדגם (1 מ"ג/מ"ל) במקום.

3. ההפרדה Electrophoretic ג'ל נימי

הערה: להכין את ההפרדה על פי השיטה המתוארת בעבודה הקודמת על-ידי. Nachbar et al. ⁴.

1. להכין את הניתוח
   1. במצב נים
      1. הגדר את התרמוסטט 23 ° C.
      2. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 2.5 עם 0.1 M NaOH.
      3. לרוקן את נימי עבור 5 דקות בבר 2.0 עם 0.1 M HCl.
      4. לרוקן את נימי למשך 2 דקות בבר 2.0 עם מים יונים.
   2. למלא את מאגר ג'ל מרחביות
      1. למלא עם נימי 10 דקות בבר 2.0 עם המאגר ג'ל מרחביות זמינים מסחרית ב- pH 8.0.
   3. לשטוף את נימי לפני כל הפעלה ההפרדה
      1. לרוקן את נימי למשך 3 דקות בבר 4.0 עם 0.1 M NaOH.
      2. לרוקן את נימי עבור 1 דקות בבר 4.0 עם 0.1 M HCl.
      3. לרוקן את נימי עבור 1 דקות בבר 4.0 עם מים יונים.
      4. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 4.0 עם המאגר ג'ל מרחביות.
2. הפעל את ההפרדה
   1. להזריק את הפתרון דוגמת הניסויים CGE (שלב 2.1.4) hydrodynamically על-ידי החלת בר 0.1 במשך 4 דקות על הים.
   2. החל-16.5 kV, בלחץ של 2.0 בר בשני קצוות נימי במשך 25 דקות.

4. זיקה ניתוח Electrophoretic נימי

הערה: להכין את ההפרדה על פי השיטה המתוארת בעבודות קודמות על ידי. Nachbar et al. ⁴ ועמנואל ואח . ⁵.

1. במצב נים
   1. הגדר את התרמוסטט 23 ° C.
      הערה: הטמפרטורה משמש על פי פרוטוקולים שפורסמו, ניתן לשנות אחרים הטמפרטורות^4,5. עם זאת, הגומלין תלויים בטמפרטורה, ישתנו בהתאם.
   2. ריקון של נימי למשך 40 דקות בבר 2.5 עם 0.1 M NaOH.
   3. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 1.0 עם מים יונים.
   4. לרוקן את נימי למשך 30 דקות בבר 1.0 באמצעות בופר טריס 30 מ מ (pH 7.4).
2. הכנה השיטות אייס
   1. הכינו את שיטת המדידות ללא ליגנדים.
      הערה: Acetanilide לא נוספה הפתרון הדגימה, כפי שהוא הטוב 2 חלבון פסגות.
      1. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות בבר 2.5 עם פתרון EDTA 0.1 M.
      2. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות ב- 2.5 בר עם מים יונים.
      3. לשטוף את נימי עבור מינימום 1.5-2.5 בר עם בופר טריס עבור equilibration.
      4. להזריק את הפתרון acetanilide 6 s-בר 0.05 ושינוי לים ו עודפים הבקבוקונים על הבקבוקונים מאגר טריס.
      5. החל בר 0.05 עבור 2.4 s כדי לדחוף את הפתרון acetanilide מהקצה הפנימי נוספת נימי.
      6. החלת 10.0 kV במשך 6 דקות לזהות הפסגה acetanilide באורך-גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 4.2.1.1. -4.2.1.6. בעזרת החלבון לדגום במקום הפתרון acetanilide ולגלות את כל הפסגות חלבון.
   2. הכינו את שיטת המדידות עם ליגנדים.
      1. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות בבר 2.5 עם פתרון EDTA 0.1 M.
      2. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות ב- 2.5 בר עם מים יונים.
      3. לשטוף את נימי עבור מינימום 1.5-2.5 בר עם הפתרון ליגנד equilibration.
      4. להזריק את הפתרון acetanilide 6 s-בר 0.05 ושינוי לים ו עודפים הבקבוקונים על הבקבוקונים מאגר המכיל ליגנד.
      5. החל בר 0.05 עבור 2.4 s כדי לדחוף את הפתרון acetanilide מהקצה הפנימי נוספת נימי.
      6. החלת 10.0 kV במשך 6 דקות לזהות הפסגה acetanilide באורך-גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 4.2.2.1 - 4.2.2.6 באמצעות המדגם חלבון במקום הפתרון acetanilide, לזהות את כל הפסגות חלבון.
   3. לסירוגין חזור על שלבים 4.2.1 ו 4.2.2 כדי לחשב את השינוי שחל יחס גודל תשלום עבור אינטראקציות חלבון-מטאל יון שונים (המתוארים תחת נציג תוצאות).
      1. לשנות את הפתרון חלבון לאחר h 60 בכל אחד טרי.
         הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן להשהות. ההליך זה חוזר ונשנה לפחות 10 x עבור כל ריכוז ליגנדים מאז דפוס שיא משתנה מעט מן לרוץ לרוץ. אם הפתרון משמש יותר מ 60 h, הווריאציות יגדל יתר על המידה.
   4. הפעל את השיטות
      1. הפעל את השיטה המתוארת תחת שלב 4.2.2, באמצעות הפתרונות ליגנד עפרורית (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂, ופתרונות SrCl₂ ).
      2. המשך באמצעות השיטה המתוארת תחת שלב 4.2.2, באמצעות את MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂ו- NiCl₂ פתרונות במקום הפתרונות ליגנד עפרורית.
         הערה: כלורידים מתכות מעבר האחרון הראה אינטראקציות חזקה עם נימי ואין אפשרות להסירה לחלוטין. התוצאה אינטראקציות אלה משמרות בזמן ההעברה לרוץ לרוץ. כתוצאה מכך, הם נחקרו לאחר יונים מתכתיים אחרים.

תוצאות

איור 1 מציג את electropherogram עבור הדגימה AtHIRD11 שהתקבל במהלך הניסויים CGE. גודל פפטיד עולה משמאל לימין. שיא מספר 4 כולל הכמות הגדולה ביותר, מציין את חלבון שלם. הפסגות קטנים 2 ו- 3 מייצגים זיהומים קטנים יותר (למשל, השפלה מוצרים). השיא הראשון, את חוסר העקביות של התוכ?...

Discussion

עבור כל הניסויים לסה נ, הכנת נימי הוא שלב קריטי. מאז זה צינור זכוכית עם קוטר קטן, יכול להינתק בקלות בנקודות היכן הציפוי יוסר בעת זה בטיפול. התקנת נימי לתוך הכלי צריך להיעשות בזהירות רבה.

הצעדים קריטיים הכרוכים אייס בשיטת בעיקר מתייחסים הגדרת הניסוי. עוד צעד קריטי הוא מציאת הפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it