AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Özet

Bu iletişim kuralı bir protein örnek karakterizasyonu benzeşme kapiler Elektroforez tarafından kapiller Jel Elektroforez ve hızlı bağlama tarama için şarj edilmiş ligandlar birleştirir. Bu proteinler gibi özünde düzensiz proteinler, esnek bir yapı için bağlama farklı conformers için tüm farklılıkları belirlemek için önerilir.

Özet

Bitkiler kuvvetle çalışma ortamlarına bağlıdır. Stresli değişiklikleri (Örneğin, kuraklık ve yüksek tuzluluk) düzenlemek için sınıflar proteinlerin oksidatif ve ozmotik stresi azaltmak için özünde düzensiz (YDK) daha yüksek bitkiler gelişmeye. Bu makalede kapiller jel elektroforez (CGE) ve hareketlilik shift benzeşme Elektroforez (ACE) bir arada IDP AtHIRD11 farklı conformers Arabidopsis thalianaüzerinden bağlama davranışını tanımlamak için kullanılmaktadır. CGE AtHIRD11 saflığı onaylamak ve parçaları, ardından değişiklikleri ve diğer kirleri nedenlerden dolayı karmaşık tepe desen olarak dışlamak için kullanılır. Deneme bu bölümünde, farklı örnek bileşenleri viskoz bir jel bir kılcal damar içinde onların farklı kitleler tarafından ayrılmış ve bir diyot dizi bulmak ile tespit. Daha sonra örnek çeşitli metal iyonları doğru bağlama davranışını ACE tarafından araştırıldı. Bu durumda, ligand arabellek çözüme eklenir ve geçiş süresi vardiyada bağlama olay ya da değil oluşup oluşmadığını belirlemek için ölçülür. Jel Elektroforez ve bağlama tahlil otomatikleştirme imkanı CGE ve ACE kombinasyonu bir IDP bağlama davranışını belirlemek için kullanmanın yararları biridir. Ayrıca, bir alt sınırından algılama klasik jel elektroforez CGE gösterir ve ACE hızlı bir şekilde bir ligand bağlayıcı şekilde belirlemek yapabiliyor. Buna ek olarak, ACE metal iyonları daha şarj edilmiş diğer türler için de uygulanabilir. Ancak, deneyler bağlama için bu yöntemin kullanılması bağlama sitesi sayısını belirledikten yeteneği sınırlıdır. Yine de, CGE ve ACE kombinasyonu herhangi bir protein örnek çok sayıda şarj edilmiş ligandlar doğru bağlama davranışını karakterize için adapte edilebilir.

Giriş

Bitkiler daha birçok diğer yaşam formları daha çalışma ortamlarına bağlıdır. Bitkiler başka yerlere hareket edemez beri onlar çevreleri (Örneğin, kuraklık, soğuk ve yüksek tuz konsantrasyonu) değişiklikleri ayarlamak zorunda. Sonuç olarak, yüksek bitkiler özel stres proteinler için yüksek tuzluluk ilgili hücre stres azaltmak için manifold görevleri yerine getirmek dehydrins gibi geliştirilmiştir. Bu proteinler su ve iyonları hücrelerin içinde bind, Cu^{2 +}bağlayarak oksidatif stresi azaltmak-iyonları ve fosfolipitler yanı sıra cytoskeletons ile etkileşim. Ayrıca, Zn^{2 +}bağlama-iyonları transkripsiyon faktörleri hareket etmek bu proteinler sağlar. CA^{2 +}şekilde bağlanabilemeleridir-fosforilasyon da kaldıktan sonra iyonları¹bildirdi.

Bu proteinler çok fonksiyonlu davranışını hidrofobik amino asitlerin yokluğu ilgilidir. Sonuç olarak, onlar peptid zinciri ve kısıtlanmış bir yapı içinde hidrofobik etkileşimler eksikliği. Bu proteinler kısıtlayıcı bir yapı eksikliği nedeniyle, ancak, aynı koşullarda farklı conformers kaplayabilir. Bu nedenle, onlar en iyi bir yapılar topluluğu yerine tek bir biçimi olarak tanımlanabilir. Özünde proteinler (YDK) düzensiz ve stres proteinler ve ökaryotik hücreler²farklı yolları arasında çapraz karışma için yaygın olarak kullanılan bir kavram olarak proteinler bu özellikleri ile bilinir.

Bu stres kaynaklı YDK biridir AtHIRD11. Arabidopsis thaliana' ın en son derece kuraklık ifade etmektedir biridir. Bu nedenle, farklı conformers oranı şarj etmek için etkili onların RADIUS tarafından ayrılmış olabilir ve kapiller Elektroforez (CE) daha ileri araştırmalar için kullanılan. Önceki ACE deneyler göstermiştir AtHIRD11 ve Cu^{2 +}-, Zn^{2 +}-, Co^{2 +}ve Ni^{2 +}gibi geçiş metal iyonları arasındaki etkileşimler-iyonları. Mufassal-den sonuçlanmak-ebilmek bulunmak içinde Hara vd. ³ ve Nachbar vd. ⁴.

Burada kullanılacak ACE yöntemi üzerinde bizim daha önce yayımlanmış eserler⁶temel alır. Ancak, protein örnek için EOF işaret acetanilide eklenmesi uygun değildir. AtHIRD11 geniş tepe desen gösterir ve örnek için EOF marker ekleme iki doruklarına gizlemek. Bu nedenle, işaretçiyi ayrı bir vadede kullanılır. Bağlama davranışı inceledi önce önceki deneyler sırasında bulunan tepeler farklı conformers olduğunu doğruladı. Bu nedenle CGE protein conformers arasında ayırt etmek için kullanılır, translasyon protein ve onların farklı kitleler tarafından AtHIRD11, parçaları gibi yabancı maddelerin değiştirilme tarihi. Daha sonra çeşitli farklı metal iyonları karşı karakterize AtHIRD11 örneği'nın bağlama davranış araştırıldı.

Bu makalenin amacı, farklı conformers bağlama davranış farklılıkları değerlendirmek için bir IDP ve diğer bileşenleri örneği arasında ayırt etmek için deneysel bir kurulum tarif etmektir.

Protokol

1. hazırlanması kapiler Elektroforez cihazları

1. Kılcal hazırlamak
   1. Bir cam kesici çıplak erimiş silis (için CGE deney) 33 cm ve 30 cm (ACE deneme için) uzun kılcal kapiller polimid dış kaplama ve bir iç çapı 50 µm ile kesmek için kullanın. Kesme cam tabak içinde gerçekleştirin.
      Not: 2 farklı deneysel kurulumları için 2 farklı aygıtlar geliştirilmiştir. Onları diğer aletleri üzerinde kullanmak için uygun yöntemi transfer yapılması gerekiyor ve kılcal damar uzunluğu aracı izin verilen uzunluğu için ayarlanması gerekir.
   2. Kılcal CGE deneme için bir ucunu 24.5 cm uzaklıkta ve ACE deneme (etkin uzunluğu) için kılcal bir ucundan 21,5 cm 1 cm geniş algılama pencerenin ortasında işaretlemek için bir kalem kullanın.
   3. Polimid dış yüzey kılcal bir alev lambasına 0.5 cm önce ve sonra işareti ile uzakta yanan çıkarın. Benzer şekilde, kaynak makinesini 1 cm mantolama kılcal her iki ucundaki kaldırmak için kullanın.
      Not: Bu kullanılan kapiler Elektroforez araç erişimine beri etkin uzunluğu biraz farklı olabilir.
   4. Biter kılcal ve etanol ve yumuşak bir doku ile algılama pencereler temiz.
      Not: Daha az esnek ve kırmak büyük olasılıkla kaplamasız kılcal damarlar.
2. Kılcal yüklemek
   1. Bir kılcal çıkış yanında hafiye pencere ile CE sistemine yükleyin.
      Not: Farklı tutma sistemleri, kılcal damarlar için çeşitli CE araç modelleri var. Kesin talimatlar için kullanılan alet el kitabına bakın.

2. çözümleri hazırlayın

1. Çözümler CGE analiz için hazırlamak
   1. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) hazırlamak-SDS arabellek (100 mM/1% w/v) pH 8.0.
      1. Solunum maskesi ve bir kabin Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 100 mL ölçek 1.00 g ağırlığında için kullanın.
      2. Tris 1,21 g 100 mL kabı içine ekleyin ve 50 mL deiyonize su ve bir manyetik heyecan bar üzerinde bir manyetik karıştırıcı kullanarak geçiyoruz.
      3. PH elektrodu çözümde koymak ve 1.0 M HCl kullanarak 8,0 pH ayarlayın.
      4. Çözüm 100 mL volumetric flask doldurun ve işareti kadar deiyonize su ekleyin. Yavaşça herhangi bir köpük şekillendirme önlemek için salla.
   2. 0.1 M NaOH çözüm hazırlamak.
      1. 100 mL volumetric flask NaOH 4.0 g ağırlığında. Deiyonize su ile 1 M stok yapmak işareti kadar doldurun.
      2. Bu çözüm 10 mL başka bir 100 mL volumetric flask aktarıp işareti kadar deiyonize su ile doldurun bir 10 mL ampul pipet kullanın.
   3. 0.1 M HCl çözüm hazırlamak.
      1. 10 M HCL 10 mL 10 mL hacimsel pipet kullanarak 100 mL volumetric flask koymak ve mark kadar deiyonize su ile doldurun. 0,1 M HCl elde etmek için bu adımı yineleyin.
   4. Örnek çözüm hazırlamak.
      1. 0.5 mg protein 1 mL tüp içine tartın. Bir micropipette ile 2.1.1. adımdaki Tris-SDS jel arabelleği 0.5 mL ekleyin.
      2. Protein herhangi bir köpük şekillendirme ve protein yıkımı önlemek için hafifçe sallayarak geçiyoruz.
         Not: protein açıklandığı gibi çözünmüş olamaz ultrasonication kullanın; çözümün herhangi bir Isıtma kaçının.
   5. Çözümler şişeleri doldurun.
      1. Her çözüm konusunda bir 0,22 µm polivinilidin florid (PVDF) filtre doğrudan şişeyi yeterli bir Ģırınga kullanarak filtre.
         Not: jel içeren çözümler için geri dönüş basıncı yüksek viskozite nedeniyle yüksek olabilir.
      2. Toplam 15 tüpleri hazırlayın ve her herhangi bir karışmalarının önlemek için işaretleyin.
         1. Piyasada bulunan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) jel arabelleği pH 8 ile 3 şişeleri doldurun.
            Not: Ticari olarak mevcut SDS jel arabellek kullanımını daha kesin sonuçlar sağlar.
         2. 1 şişe yıkama için 0.1 M NaOH ve 0.1 M HCl ile 1 flakon ile doldurun.
         3. 1 şişe örnek çözümü ile doldurun.
         4. Deiyonize su ve 0.1 mL deiyonize su (şişeleri daldırma) ile 4 şişeleri ile 5 şişeleri doldurun.
            Not: Daldırma şişeleri atık şişeleri her çalışma önce kılcal kızarma sırasında kullanılır. Kılcal uçlarına su herhangi bir jel artıkları durulama için daldırma.
2. ACE analiz için çözümler hazırlamak
   1. 1 M NaOH çözüm hazırlamak.
      1. 100 mL volumetric flask NaOH 4.0 g ağırlığında.
      2. Deiyonize su ile 1 M stok yapmak işareti kadar doldurun.
   2. Bir 0.1 M NaOH çözümde 0.1 M ethylendiaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlayın.
      1. 10 mL 10 mL ampul pipet kullanarak 100 mL volumetric flask 0.1 M NaOH aktarın. Mark kadar deiyonize su ile doldurun.
      2. EDTA tartı bir teknede 2.42 g tartmak ve 100 ml 0.1 M NaOH katı bileşik geçiyoruz.
   3. Tris arabellek (30 mM) çözüm hazırlamak.
      1. 3.63 g Tris, 200 mL deiyonize su ve bir heyecan bar bir 500 mL kabı ekleyin. Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin ve açın.
      2. Bir pH metre elektrot kabı içinde koymak ve pH 7.4 0.1 M HCl kullanarak için ayarlayın.
      3. Çözüm 1 L volumetric flask ve dolgu işareti kadar deiyonize su ile doldurun.
         Not: Bu yordam düzenli olarak yapılmasını planlamıştı vardır veya daha--dan 1 L bütün analizi için gereklidir bu yana büyük volumetric flask gereklidir.
   4. Acetanilide electroosmotic akışı (EOF) hazırlamak-marker (60 µM) çözüm.
      1. 6 mg acetanilide ve Tris arabelleği 100 mL 100 mL volumetric flask ekleyin.
      2. Volumetric flask ultrasonik banyoda koymak ve 30 dk için açın.
   5. Örnek (1 mg/mL) çözüm hazırlamak.
      1. 0.5 mL microcentrifuge tüp bir hassas denge üzerinde koymak ve dondurularak AtHIRD11 tozu 0.3 mg tüpün içine ekleyin.
      2. Bir micropipette bir 30 mM Tris arabellek (pH 7,4) 0.3 mL tüp eklemek için kullanın. Dikkatle protein çözülmeye tüp sallamak.
   6. Ligand çözümleri hazırlayın.
      1. CaCl₂ (5 mM) hisse senedi çözüm hazırlamak.
         1. Tartı bir tekne almak, bir analitik dengesi üzerinde koymak ve CaCl₂36.76 mg tartmak * H₂O.
         2. Bir micropipette kullanarak floş CaCl₂* üzerinden ağırlığında H₂O tekne içine önceden hazırlanmış Tris arabelleği ile 50 mL volumetric flask.
         3. Volumetric flask Tris arabelleği kadar işareti ile doldurun.
      2. Kalan stok çözümleri (5 mM) hazırlayın.
         1. Adımı yineleyin 2.2.6.1 kullanarak diğer metal tuzları CaCl₂yerine * H₂O [MgCl₂: 23.80 mg, BaCl₂: 26.02 mg, Sr (NO₃)₂: 52.91 mg, MnCl₂: 31.46 mg, SeCl₄: 52.91 mg, CoCl ₂* 2 H₂O: 41.47 mg, CuCl₂* 2 H₂O: 42.62 mg, ZnCl₂: 3.41 mg ve NiCl₂* 6 H₂O: 59.43 mg].
            Not: Bir konsantrasyonu 0.5 mm ZnCl₂ çözüm vardır. İyonları ve iç kapiller duvarı arasındaki güçlü etkileşimler gözlenmiştir beri konsantrasyonu 10 katına düşürüldü⁴.
      3. 500 µM CaCl₂ çözüm hazırlamak.
         1. 10 mL CaCl₂ stok çözeltisi doldurun ve 100 mL volumetric flask koydu.
         2. Tris arabelleği işareti ile hacimsel şişeye doldurun ve şişeye sallamak.
      4. 250 µM CaCl₂ çözüm hazırlamak.
         1. 5 mL CaCl₂ stok çözeltisi doldurun ve 100 mL volumetric flask koydu.
         2. Tris arabelleği işareti ile hacimsel şişeye doldurun ve şişeye sallamak.
      5. Adım 2.2.6.3 ve 2.2.6.4 diğer hisse senedi çözümleri için yineleyin.
   7. Şişeleri çözümlerinde doldurun.
      Not: Giriş ve çıkış şişeleri bir dizi yinelenen her çalışma ihtiyacı var. Giriş ve çıkış taze ligand Solutions'da kullanımını geçiş zaman her çalıştırdıktan sonra nöbetleşe azaltır.
      1. Bir 10 mL şırınga 250 µM CaCl₂ çözümde doldurun.
      2. 0,22 µm PVDF filtre filtre uygulanmış bu çözüm atmak için şırınga kullanarak filtre şırınga ve itme çözüm 2 mL koymak.
      3. Maksimum izin verilen ses kadar 10 şişeleri kalan 250 µM CaCl₂ çözüm şırınga ile doldurun. Her 250 µM CaCl ₂ çözüm giriş flakonolarak işaretleyin.
      4. 250 µM CaCl₂ çözüm ile yarı dolu olana 10 şişeleri doldurun. Her 250 µM CaCl ₂ çözüm çıkış flakonolarak işaretleyin.
      5. 2.2.7.1 - 2.2.7.4 diğer metal tuz içeren çözümü için yineleyin.
      6. Giriş ve çıkış şişeleri 30 mM Tris arabellek (pH 7,4) çözüm yerine kullanarak her çifti arasındaki adımları tekrarlayın.
         Not: 30 mmol/L Tris tampon pH 7.4 ishal arasında geçiş zaman verilerini protein için metal iyonları, yokluğunda elde etmek için kullanılır. EOF değişimler ihmal için gereklidir.
      7. Bunun yerine acetanilide EOF-marker (60 µM) çözüm kullanarak bir şişe için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Ayrıca, örnek (1 mg/mL) çözüm yerine kullanarak bu adımları yineleyin.

3. kılcal jel elektroforetik ayrımı

Not: önceki çalışmalarında Nachbar vd tarafından açıklanan yöntemine göre ayırma hazırlamak ⁴.

1. Analize hazırlamak
   1. Koşul kılcal
      1. Termostat 23 ° C'ye ayarla
      2. Kılcal 0.1 M NaOH ile 2.5 barda 10 dakika yıkayın.
      3. 0,1 M HCl ile 2.0 barda 5 min için kılcal floş.
      4. Deiyonize su ile 2.0 barda 2 min için kılcal floş.
   2. SDS jel arabellekte doldurun
      1. Bir kılcal 2.0 barında 10 min için piyasada bulunan SDS jel tampon pH 8.0 ile doldurun.
   3. Her ayrılık çalışması önce kılcal sifonu
      1. Kılcal 0.1 M NaOH ile 4.0 barda 3 dakika yıkayın.
      2. 0,1 M HCl ile 4.0 barda 1 dk. için kılcal floş.
      3. Deiyonize su ile 4.0 barda 1 dk. için kılcal floş.
      4. Kılcal SDS jel arabellek ile 4.0 barda 10 dakika yıkayın.
2. Ayırma çalıştırmak
   1. Örnek çözüm CGE deneyler (adım 2.1.4) için hydrodynamically giriş, 4 dk için 0.1 bar uygulayarak enjekte et.
   2. -16.5 uygulamak kV ve kılcal 25 min için her iki ucundaki 2,0 bar basınç.

4. benzeşme kapiler elektroforetik Analizi

Not: önceki eserlerinde Nachbar vd tarafından açıklanan yöntemine göre ayırma hazırlamak ⁴ ve Alhazmi vd. ⁵.

1. Koşul kılcal
   1. Termostat 23 ° C'ye ayarla
      Not: Sıcaklık göre yayımlanmış protokolleri kullanılır ve diğer sıcaklıklar^4,5olarak değiştirilebilir. Ancak, etkileşimleri üzerinde sıcaklık bağımlıdır ve uygun şekilde değiştirir.
   2. Bir kılcal 0.1 M NaOH ile 2.5 barda 40 dakika yıkayın.
   3. Kılcal deiyonize su ile 1.0 barda 10 dakika yıkayın.
   4. 30 dk 30 mM Tris arabelleği (pH 7,4) ile 1.0 barda kılcal floş.
2. ACE yöntemleri için hazırlık
   1. Yöntemi ligandlar olmadan ölçümler için hazırlayın.
      Not: 2 protein doruklarına kılık değiştirerek gibi Acetanilide örnek çözüm eklenmedi.
      1. 1 dk. için kılcal bir 0.1 M EDTA çözüm ile 2.5 barda durulayın.
      2. 1 dk. için kılcal 2.5 Bar deiyonize su ile durulayın.
      3. Tris arabelleği için denge ile 2.5 Bar kılcal 1,5 dakika yıkayın.
      4. 6 s 0,05 bar ve değişim giriş ve çıkış şişeleri Tris tampon tüpleri için acetanilide üçün enjekte.
      5. 2.4 için 0,05 bar uygulamak acetanilide çözüm kapiller daha fazla iç ucundan itmek için s.
      6. 10.0 uygulamak için 6 dk kV ve bir dalga boyu 200 acetanilide zirvesinde tespit nm.
      7. 4.2.1.1 adımları yineleyin. -4.2.1.6. protein kullanarak acetanilide çözüm yerine örnek ve tüm protein doruklarına algılamak.
   2. Yöntemi ölçümleri ile ligandlar için hazırlayın.
      1. 1 dk. için kılcal bir 0.1 M EDTA çözüm ile 2.5 barda durulayın.
      2. 1 dk. için kılcal 2.5 Bar deiyonize su ile durulayın.
      3. Denge için ligand çözüm ile 2.5 Bar kılcal 1,5 dakika yıkayın.
      4. 6 s 0,05 bar ve değişim giriş ve çıkış şişeleri ligand içeren tampon tüpleri için acetanilide üçün enjekte.
      5. 2.4 için 0,05 bar uygulamak acetanilide çözüm kapiller daha fazla iç ucundan itmek için s.
      6. 10.0 uygulamak için 6 dk kV ve bir dalga boyu 200 acetanilide zirvesinde tespit nm.
      7. Adımları 4.2.2.1 - protein örnek acetanilide çözüm yerine kullanarak 4.2.2.6 yineleyin ve protein doruklarına algılamak.
   3. Alternatif olarak şarj-boyut oranları ( Temsilcisi sonuçlarıaltında açıklanan) çeşitli protein-metal iyon etkileşimleri için değişikliği hesaplamak için 4.2.1 ve 4.2.2 adımları yineleyin.
      1. Protein çözüm her 60 h sonra yeni bir değiştirin.
         Not: Bu noktada, deneme duraklatılmış. Bu yordam en az tekrarlanan 10 olduğunu x ligandlar tepeli deseni biraz koş koş değişir bu yana her konsantrasyon için. Çözüm 60 h daha uzun süre kullanılırsa, varyasyonlar çok büyük hale.
   4. Yöntemleri çalışacak
      1. Alkali toprak ligand çözümleri (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂ve SrCl₂ çözümleri) kullanarak adım 4.2.2, altında açıklanan yöntemini çalıştırın.
      2. MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂ve NiCl₂ çözümleri alkali toprak ligand çözümleri yerine kullanarak adım 4.2.2, altında açıklanan yöntemi kullanarak devam.
         Not: İkinci geçiş metal klorürleri kılcal ile daha güçlü etkileşim gösterdi ve tamamen kaldırılamaz. Bu etkileşimler sonucunda geçiş zamanında koş koş kaydırır. Sonuç olarak, onlar sonra diğer metal iyonları araştırıldı.

Sonuçlar

Şekil 1 CGE deneyler sırasında elde edilen AtHIRD11 örnek için electropherogram gösterir. Peptid boyutu soldan sağa doğru artar. En yüksek sayı 4 en büyük kitle var ve bozulmamış protein gösterir. Daha küçük tepeler 2 ve 3 küçük yabancı maddelerin (Örneğin, bozulma ürünleri) temsil eder. Ayrıca ilk zirve ve tutarsızlık daha önce temellerin protein örnek çoğaltılamaz. Bu nedenle, SDS için ilgilidir kendisini jel ve h...

Tartışmalar

Tüm CE deneyler için kılcal hazırlanması kritik bir adımdır. O küçük çaplı bir cam tüp olduğundan, onu kolayca ele alınması nerede kaplama kaldırılır spotları kırabilir. Kılcal yüklemesine araç çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

ACE yöntemi esas olarak kullanmakla ilgili önemli adımlar için deneysel Kur ilgilidir. Başka bir önemli adım doğru örnek ekleme parametreleri bulgudur. Örnek enjekte miktarı yüksek tepeler için yeterli olmalı. Ancak, bu a?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it