Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Resumo

Este protocolo combina a caracterização de uma amostra de proteínas por eletroforese em gel capilar e uma triagem rápida ligação para ligantes carregadas por eletroforese capilar de afinidade. É recomendável para proteínas com uma estrutura flexível, tais como proteínas intrinsecamente desordenadas, para determinar as diferenças de ligação para diferentes conformistas.

Resumo

As plantas são fortemente dependentes de seu ambiente. A fim de ajustar-se às mudanças estressantes (por exemplo, a seca e alta salinidade), plantas superiores evoluem classes de proteínas intrinsecamente desordenadas (deslocados internos) para reduzir o stress oxidativo e osmótico. Este artigo utiliza uma combinação de electroforese em gel capilar (CGE) e electroforese de afinidade de turno de mobilidade (ACE) para descrever o comportamento de vinculação de conformistas diferentes de AtHIRD11 o IDP da Arabidopsis thaliana. CGE é usado para confirmar a pureza da AtHIRD11 e para excluir fragmentos, modificações do posttranslational e outras impurezas como razões para padrões complexos de pico. Nesta parte do experimento, os componentes de amostra diferentes são separados por um gel viscoso dentro de um capilar por suas massas diferentes e detectados com um detector de matriz de diodo. Depois disso, o comportamento de vinculação da amostra para vários íons metálicos é investigado pela ACE. Neste caso, o ligante é adicionado à solução tampão e a mudança no tempo de migração é medida para determinar se ocorreu um evento de ligação ou não. Uma das vantagens de usar a combinação de CGE e ACE para determinar o comportamento de vinculação de um IDP é a possibilidade de automatizar a electroforese do gel e o ensaio. Além disso, o CGE mostra um menor limite de detecção do que a eletroforese em gel de clássica e ACE é capaz de determinar o modo de ligação de um ligante de forma rápida. Além disso, ACE também pode ser aplicado a outras espécies carregadas de íons metálicos. No entanto, o uso desse método para experimentos de associação é limitado em sua capacidade de determinar o número de locais obrigatórios. No entanto, a combinação da CGE e ACE pode ser adaptada para caracterizar o comportamento de vinculação de qualquer amostra de proteína para inúmeros ligantes carregadas.

Introdução

As plantas são mais dependentes de seu ambiente do que muitas outras formas de vida. Uma vez que as plantas não podem mover-se para outros lugares, eles têm para se adaptarem às mudanças em seu ambiente (por exemplo, seca, fria e alta concentração de sal). Por conseguinte, plantas superiores desenvolveram proteínas de estresse especializadas como dehydrins, que cumprir tarefas múltiplas para reduzir o estresse de célula relacionada com alta salinidade. Estas proteínas ligam íons e água no interior das células, reduzir o estresse oxidativo vinculando Cu^{2 +}-íons e interagir com fosfolipídios, bem como o citoesqueleto. Além disso, a vinculação Zn^{2 +}-íons permite que estas proteínas que atuam como fatores de transcrição. Sua capacidade de Ca^{2 +}-íons após fosforilação também tem sido relataram que¹.

O multifuncional comportamento destas proteínas está relacionado com a ausência de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Por conseguinte, falta-lhes qualquer interações hidrofóbicas dentro da cadeia peptídica e, também, uma estrutura restrita. No entanto, porque estas proteínas possuem uma estrutura restritiva, eles podem ocupar diferentes conformistas nas mesmas condições. Portanto, eles podem ser descritos melhor como um conjunto de estruturas em vez de uma única conformação. Proteínas com essas propriedades são conhecidas como intrinsecamente desordenado proteínas (deslocados internos) e são um conceito amplamente utilizado para proteínas de estresse e crosstalk entre diferentes caminhos em pilhas eukaryotic².

Dentre estes deslocados internos relacionados com o stress é AtHIRD11. É uma de Arabidopsis thalianada maioria altamente seca-expresso deslocados. Portanto, os conformistas diferentes podem ser separados por seu raio eficaz de cobrar taxa, e eletroforese capilar (CE) tem sido utilizado para mais investigações. Experiências anteriores de ACE demonstraram que as interações entre os íons de metais de transição como Cu^{2 +}- Zn^{2 +}-, Co^{2 +}e Ni^{2 +}e AtHIRD11-íons. Os resultados detalhados podem ser encontrados no Hara et al . ³ e Nachbar et al ⁴.

O método ACE que será usado aqui baseia-se em nossos trabalhos anteriormente publicados⁶. No entanto, a adição da acetanilida de marcador EOF para a amostra de proteína não é adequada. AtHIRD11 mostra padrões de pico largo, e adicionar o marcador EOF para a amostra seria disfarçar dois picos. Portanto, o marcador é usado em uma execução separada. Antes do comportamento de vinculação é examinado, confirma-se que os picos encontrados durante as experiências anteriores são de diferentes conformistas. Assim, CGE é usado para distinguir entre os conformistas de proteína, o borne-translational modificado, proteína e as impurezas, tais como fragmentos de AtHIRD11, por suas massas diferentes. Posteriormente, o comportamento de vinculação do exemplo AtHIRD11 caracterizadas para vários diferentes íons metálicos é investigado.

O objetivo deste artigo é descrever uma instalação experimental para distinguir entre um IDP e outros componentes de uma amostra para avaliar as diferenças entre o comportamento de vinculação de conformistas diferentes.

Protocolo

1. preparação dos instrumentos de eletroforese capilar

1. Preparar os capilares
   1. Use um cortador de vidro para corte de sílica fundida-bare capilar com um revestimento externo de poliimida e um diâmetro interno de 50 µm em 33 cm (para o experimento CGE) e 30 cm (para o experimento ACE) longo capilares. Execute o corte em uma placa de vidro.
      Nota: As 2 configurações experimentais diferentes foram desenvolvidas para 2 diferentes instrumentos. Para utilizá-los em outros instrumentos, uma transferência de método adequado tem de ser realizada e o comprimento capilar deve ser ajustado para o tamanho permitido do instrumento.
   2. Use uma caneta para marcar no meio de uma janela de deteção de largura de 1 cm a uma distância de 24,5 cm de uma extremidade do capilar para o experimento da CGE e a 21,5 cm de uma extremidade do capilar para o experimento ACE (comprimento efectivo).
   3. Remova o revestimento externo de poliimida os capilares por queimá-lo com um maçarico, 0,5 cm antes e depois da marca. Da mesma forma, use o maçarico para remover 1 cm do revestimento em ambas as extremidades dos capilares.
      Nota: O comprimento efectivo pode variar ligeiramente desde que baseia-se no instrumento eletroforese capilar usado.
   4. Limpe as extremidades dos capilares e as janelas de deteção com etanol e um tecido macio.
      Nota: Os capilares não revestidos são menos flexível e mais propensos a quebrar.
2. Instalar os capilares
   1. Instale um capilar no sistema com a janela de deteção perto da saída do CE.
      Nota: Os vários modelos de instrumento de CE têm sistemas de exploração diferente para os capilares. Consulte o manual do instrumento utilizado para as instruções exatas.

2. prepare as soluções

1. Preparar as soluções para a análise da CGE
   1. Preparar o tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-reserva de SDS (100 mM/1% w/v) em pH 8.0.
      1. Use uma máscara respiratória e um estande para a pesagem de 1,00 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) em um copo de 100 mL.
      2. Adicionar 1,21 g de Tris para o copo de 100 mL e dissolvê-lo usando 50 mL de água desionizada e uma barra de agitação magnética em um agitador magnético.
      3. Colocar um eletrodo de pH na solução e ajustar o pH a 8.0 usando 1,0 M de HCl.
      4. Preencher a solução para um balão volumétrico de 100 mL e adicionar água desionizada até ao traço. Agitá-lo com cuidado para evitar qualquer formação de espuma.
   2. Prepare a solução de NaOH 0,1 M.
      1. Pese de 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada para fazer um estoque de 1 M.
      2. Use uma pipeta de bulbo de 10ml para transferir 10 mL desta solução para um balão volumétrico de 100 mL e encha-o até a marca com água desionizada.
   3. Prepare a solução de HCl 0,1 M.
      1. Colocar 10 mL de 10 M de HCl em um balão volumétrico de 100 mL com uma pipeta volumétrica de 10 mL e encha-o até a marca com água desionizada. Repita esta etapa para obter a 0.1 M HCl.
   4. Prepare a solução de amostra.
      1. Um tubo de 1 mL, pese 0,5 mg de proteína. Adicione 0,5 mL de tampão de gel de Tris-SDS da etapa 2.1.1 com uma micropipeta.
      2. Dissolva a proteína agitando suavemente para evitar qualquer formação de espuma e a degradação da proteína.
         Nota: Usar ultrasonication se a proteína não pode ser dissolvida conforme descrito; Evite qualquer aquecimento da solução.
   5. Preencha as soluções para os frascos.
      1. Filtre cada solução através de um 0,22 µm fluoreto de polivinilideno (PVDF) filtrar usando uma seringa adequada diretamente dentro do frasco.
         Nota: Para as soluções contendo gel, o pressão de retorno pode ser elevado devido à sua alta viscosidade.
      2. Prepare 15 frascos no total e marcar cada um para evitar quaisquer confusões.
         1. Encha 3 frascos com um amortecedor de gel disponível comercialmente sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) a pH 8.
            Nota: A utilização de um amortecedor de gel SDS comercialmente disponível fornece resultados mais precisos.
         2. Encha 1 frasco com 0.1 M NaOH e 1 frasco com 0.1 M HCl para irrigação.
         3. Encha 1 frasco com a solução de amostra.
         4. Encha 5 frascos com água desionizada e 4 frascos com 0,1 mL de água desionizada (mergulhando frascos).
            Nota: Os frascos de imersão são usados como frascos de resíduos durante a lavagem do capilar antes de cada corrida. As extremidades do capilares são mergulhadas em água para enxaguar os resíduos de gel.
2. Preparar as soluções para a análise ACE
   1. Prepare a solução de NaOH 1 M.
      1. Pese de 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL.
      2. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada para fazer um estoque de 1 M.
   2. Prepare o ácido de ethylendiaminetetraacetic de 0,1 M (EDTA) em uma solução de NaOH 0,1 M.
      1. Transferi 10 mL de 0.1 M NaOH num balão volumétrico de 100 mL com uma pipeta de bulbo de 10 mL. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada.
      2. Pesar de 2,42 g de EDTA em um barco de pesagem e dissolver o composto sólido a 100 mL de 0.1 M de NaOH.
   3. Prepare o tampão Tris (30 mM).
      1. Adicione 3,63 g de Tris, 200 mL de água desionizada e uma barra de agitação em um copo de 500 mL. Coloque o copo sobre um prato de celeuma e ligá-lo.
      2. Colocar um eletrodo pH no copo e ajustar o pH para 7,4 usando 0.1 M HCl.
      3. Preencha a solução em um balão volumétrico de 1 L e encha até ao traço com água desionizada.
         Nota: Este procedimento tem de ser repetida ou num balão volumétrico de maior é necessária, já que mais de 1 L é necessário para a análise de toda.
   4. Preparar o fluxo de electroosmotic de acetanilida (EOF)-solução de marcador (60 µM).
      1. Adicione 6 mg de acetanilida e 100 mL de tampão Tris num balão volumétrico de 100 mL.
      2. Colocar o balão aferido em um banho ultra-sônico e ligue-o por 30 min.
   5. Prepare a solução de amostra (1 mg/mL).
      1. Coloque um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL em balança de precisão e adicione 0,3 mg de pó liofilizado AtHIRD11 dentro do tubo.
      2. Use uma micropipeta para adicionar 0,3 mL de um tampão Tris de 30 mM (pH 7,4) no tubo. Agite o tubo cuidadosamente para dissolver a proteína.
   6. Prepare as soluções de ligante.
      1. Prepare a solução CaCl₂ (5 mM).
         1. Pegar um barco de pesagem, colocá-lo em uma balança analítica e pesar 36,76 mg de CaCl₂* H₂O.
         2. Utilizando uma micropipeta, irrigue o CaCl₂* H₂O partir com o peso do barco em um balão volumétrico de 50 mL com o tampão Tris previamente preparado.
         3. Encha o balão volumétrico com o tampão Tris até à marca.
      2. Prepare as soluções estoque restantes (5 mM).
         1. Repita a etapa 2.2.6.1 usando o outro metal sais em vez de CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr (NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl ₂* 2 H₂O: mg 41,47, CuCl₂* 2 H₂O: mg 42,62, ZnCl₂: 3,41 mg e NiCl₂* 6 H₂O: mg 59,43].
            Nota: A ZnCl₂ solução tem uma concentração de 0,5 mM. Uma vez que observaram-se fortes interações entre os íons e a parede interna do capilar, a concentração foi reduzida por um fator de 10⁴.
      3. Prepare a solução de₂ 500 µM CaCl.
         1. 10 mL da solução-mãe CaCl₂ e colocá-lo num balão volumétrico de 100 mL.
         2. Encha o balão aferido com um tampão Tris para a marca e agitar o frasco.
      4. Prepare a solução-250 µM CaCl₂ .
         1. 5 mL de solução-mãe CaCl₂ e colocá-lo num balão volumétrico de 100 mL.
         2. Encha o balão aferido com um tampão Tris para a marca e agitar o frasco.
      5. Repita as etapas 2.2.6.3 e 2.2.6.4 para outras soluções estoque.
   7. Preencha as soluções em frascos.
      Nota: Cada execução repetida precisa de um conjunto de entrada e saída de frascos. O uso de soluções de ligante fresco na entrada e na saída reduz as mudanças em tempo de migração após cada execução.
      1. Preencha a solução de₂ 250 µM CaCl em uma seringa de 10 mL.
      2. Coloque o filtro 0.22 µm PVDF na seringa e empurrar 2 mL da solução através do filtro, utilizando a seringa para descartar esta solução filtrada.
      3. Enchem o restante 250 µM CaCl₂ da solução da seringa de 10 frascos até o volume máximo permitido. Marca todos como 250 µM CaCl ₂ solução entrada tubo de ensaio.
      4. Preencha 10 frascos até que eles são meio-contém a 250 µM CaCl₂ solução. Marca todos como 250 µM CaCl ₂ solução saída tubo de ensaio.
      5. Repita os passos de 2.2.7.1 - 2.2.7.4 para as outras soluções metais contendo sal.
      6. Repita as etapas para cada par de frascos de entrada e saída usando o tampão Tris (pH 7,4) de 30 mM em vez disso.
         Nota: O 30 mmol/L Tris tampão pH 7,4 é usado entre as execuções, a fim de obter dados de tempo de migração para a proteína na ausência de íons metálicos. É necessário a fim de negligenciar as mudanças no EOF.
      7. Repita as etapas acima para um frasco usando a acetanilida solução de EOF-marcador (60 µM) em vez disso. Além disso, repita essas etapas usando a solução da amostra (1 mg/mL) em vez disso.

3. capilar Gel separação eletroforética

Nota: Preparar a separação de acordo com o método descrito no trabalho anterior por Nachbar et al ⁴.

1. Preparar a análise
   1. Condição do capilar
      1. Ajuste o termostato de 23 ° C.
      2. Irrigue o capilar durante 10 minutos a 2,5 bar com 0.1 M NaOH.
      3. Irrigue o capilar por 5 min em 2,0 bar com 0.1 M HCl.
      4. Irrigue o capilar por 2 min em 2,0 bar com água desionizada.
   2. Preencher o buffer do gel de SDS
      1. Encha um capilar por 10 min em 2,0 bar com o amortecedor de gel SDS comercialmente disponível em pH 8.0.
   3. Irrigue o capilar antes de cada corrida de separação
      1. Irrigue o capilar para 3 min 4,0 bar com 0.1 M NaOH.
      2. Irrigue o capilar para 1 min no 4.0 bar com 0.1 M HCl.
      3. Irrigue o capilar para 1 min no 4.0 bar com água desionizada.
      4. Irrigue o capilar para 10 min a 4.0 bar com o amortecedor do gel de SDS.
2. Executar a separação
   1. Injecte a solução de amostra para os experimentos CGE (etapa 2.1.4) direccionado aplicando 0.1 bar por 4 min na entrada.
   2. Aplicar-se -16.5 kV e uma pressão de 2,0 bar em ambas as extremidades do capilar por 25 min.

4. afinidade capilar análise eletroforética

Nota: Preparar a separação de acordo com o método descrito em trabalhos anteriores por Nachbar et al ⁴ e Alhazmi et al ⁵.

1. Condição do capilar
   1. Ajuste o termostato de 23 ° C.
      Nota: A temperatura é usada de acordo com protocolos publicados e pode ser alterada para outras temperaturas^4,5. No entanto, as interações são dependentes da temperatura e vão mudar nesse sentido.
   2. Liberar um capilar por 40 min em 2,5 bar com 0.1 M NaOH.
   3. Irrigue o capilar durante 10 minutos a 1,0 bar com água desionizada.
   4. Irrigue o capilar por 30 min em 1,0 bar com um tampão de 30 mM Tris (pH 7,4).
2. Preparação para os métodos ACE
   1. Prepare o método para as medições sem ligantes.
      Nota: Acetanilida não foi adicionada à solução de amostra, como ele disfarça 2 picos de proteína.
      1. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com água desionizada.
      3. Enxágue do capilar para min 1,5 2,5 bar com um tampão Tris para equilibração.
      4. Injecte a solução de acetanilida para 6 s 0,05 bar e alterar a entrada e saída frascos para os frascos de tampão Tris.
      5. Aplicar 0,05 bar para 2.4 s para promover a solução de acetanilida da ponta do capilar mais dentro.
      6. Aplicar 10,0 kV para 6 min e detectar o pico de acetanilida no comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repita os passos de 4.2.1.1. -4.2.1.6. usando a proteína da amostra em vez da solução de acetanilida e detectar todos os picos de proteína.
   2. Prepare o método para as medições com ligantes.
      1. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com água desionizada.
      3. Enxágue do capilar para min 1,5 2,5 bar com a solução de ligante para a equilibração.
      4. Injecte a solução de acetanilida para 6 s 0,05 bar e alterar a entrada e saída frascos para os frascos de tampão contendo ligand.
      5. Aplicar 0,05 bar para 2.4 s para promover a solução de acetanilida da ponta do capilar mais dentro.
      6. Aplicar 10,0 kV para 6 min e detectar o pico de acetanilida no comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repita as etapas 4.2.2.1 - 4.2.2.6 usando a amostra de proteína em vez da solução de acetanilida e detectar todos os picos de proteína.
   3. Alternadamente, repita as etapas 4.2.1 e 4.2.2 para calcular a mudança nas relações custo-tamanho para várias interações proteína-metal íon (descritas na secção Resultados representante).
      1. Altere a solução de proteína após cada 60h para uma fresca.
         Nota: neste momento, o experimento pode ser pausado. Este procedimento é repetido pelo menos 10 x para cada concentração de ligantes desde que o padrão de pico varia ligeiramente de execução para execução. Se a solução é utilizada em mais de 60 h, as variações tornam-se muito grandes.
   4. Executar os métodos
      1. Execute o método descrito no passo 4.2.2, usando as soluções de ligante de terra alcalina (CaCl₂, MgCl₂, SrCl₂ soluções e BaCl₂).
      2. Continue usando o método descrito no passo 4.2.2, usando o MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂e NiCl₂ soluções em vez das soluções de ligante de terra alcalina.
         Nota: Os cloretos de metais de transição este último mostraram interações mais fortes com o capilar e não podem ser removidos completamente. Estes resultam de interações em turnos na época de migração de execução para execução. Consequentemente, eles foram investigados após os outros íons metálicos.

Resultados

A Figura 1 mostra a electroferograma para a amostra de AtHIRD11 obtida durante os experimentos da CGE. O tamanho do peptídeo aumenta da esquerda para a direita. Pico número 4 tem a maior massa e indica a proteína intacta. Os menores picos de 2 e 3 representam as impurezas menores (por exemplo, produtos de degradação). O primeiro pico e a inconsistência de linha de base antes também podem ser reproduzidas sem a amostra de proteína. Portanto, e...

Discussão

Para todos os experimentos do CE, a preparação do capilar é uma etapa crítica. Uma vez que é um tubo de vidro com um diâmetro pequeno, pode facilmente quebrar nos pontos onde o revestimento é removido quando está a ser tratado. A instalação do capilar dentro do instrumento deve ser feita com muito cuidado.

Os passos críticos envolvidos em usando o método ACE principalmente referem-se à instalação experimental. Outro passo crítico é encontrar os parâmetros de injeção de amos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it