Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Résumé

Ce protocole combine la caractérisation d’un échantillon de protéines par électrophorèse capillaire et une projection de liaison rapide avec les ligands chargés par électrophorèse capillaire en affinité. Il est recommandé pour les protéines avec une structure souple, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, afin de déterminer les différences dans la liaison des différents conformères.

Résumé

Les plantes sont fortement dépendantes de leur environnement. Pour s’adapter à des changements stressants (par exemple, la sécheresse et à une salinité élevée), les plantes supérieures évoluent classes de protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) pour réduire le stress oxydatif et osmotique. Cet article utilise une combinaison de l’électrophorèse capillaire (CGE) et de la mobilité Maj affinité électrophorèse (ACE) pour décrire le comportement de liaison de différents conformères de l’IDP AtHIRD11 d’Arabidopsis thaliana. CGE est utilisé pour confirmer la pureté de AtHIRD11 et d’exclure les fragments, modifications post-traductionnelles et autres impuretés comme raisons de modèles complexes de pointe. Dans cette partie de l’expérience, les différents exemples de composants sont séparés par un gel visqueux à l’intérieur d’un tube capillaire par leurs différentes masses et détectés par un détecteur à barrettes de diodes. Par la suite, le comportement de liaison de l’échantillon vers différents ions métalliques est étudié par l’ACE. Dans ce cas, le ligand est ajouté à la solution tampon et le décalage dans le temps de migration est mesuré afin de déterminer si un événement de liaison a eu lieu ou non. Un des avantages de l’utilisation de la combinaison de la CGE et ACE pour déterminer le comportement de liaison d’un PCI est la possibilité d’automatiser l’électrophorèse de gel et l’essai de liaison. En outre, CGE indique une limite inférieure de détection que l’électrophorèse de gel classique et ACE est en mesure de déterminer le mode de liaison d’un ligand d’une manière rapide. En outre, ACE peut également être appliqué à d’autres espèces chargées que les ions métalliques. Cependant, l’utilisation de cette méthode pour les expériences de liaison est limitée dans sa capacité à déterminer le nombre de sites de liaison. Néanmoins, la combinaison de la CGE et ACE peut être adaptée pour caractériser le comportement de liaison de n’importe quel échantillon de protéines vers nombreux ligands chargés.

Introduction

Les plantes sont plus dépendantes de leur environnement que beaucoup d’autres formes de vie. Étant donné que les plantes ne peuvent pas se déplacer à d’autres endroits, ils doivent s’adapter à des changements dans leur environnement (p. ex., sécheresse, froides et hautes concentrations salines). Par conséquent, plantes supérieures développé des protéines de stress spécialisés comme les alignements, qui remplissent des tâches multiples afin de réduire le stress cellulaire lié à une salinité élevée. Ces protéines se lient l’eau et des ions à l’intérieur des cellules, réduire le stress oxydatif en liant Cu^{2 +}-ions et d’interagir avec les phospholipides ainsi que les cytosquelettes. En outre, liaison Zn^{2 +}-ions permet ces protéines d’agir comme des facteurs de transcription. Leur capacité à fixer Ca^{2 +}-ions après phosphorylation a été également rapporté¹.

Le comportement multifonctionnel de ces protéines est lié à l’absence de résidus d’acides aminés hydrophobes. Par conséquent, ils n’ont pas toutes les interactions hydrophobes à l’intérieur de la chaîne peptidique et aussi une structure restreinte. Toutefois, étant donné que ces protéines n’ont pas une structure restrictive, ils peuvent occuper différents conformères dans les mêmes conditions. Donc, ils peuvent mieux décrits comme un ensemble de structures plutôt que comme une seule conformation. Les protéines possédant ces propriétés sont connues comme intrinsèquement désordonnées des protéines (PDI) et sont un concept largement utilisé pour les protéines de stress et de la diaphonie entre les différentes voies dans les cellules eucaryotes².

Un de ces déplacés liés au stress est AtHIRD11. C’est un des déplacés de sécheresse fortement exprimés la plupart de Arabidopsis thaliana. Par conséquent, les conformères différents peuvent être séparées par leur rayon effectif pour charger le rapport et électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour complément d’enquête. Des expériences antérieures de ACE a démontré les interactions entre les AtHIRD11 et les ions de métaux de transition tels que Cu^{2 +}- Zn^{2 +}-, Co^{2 +}et Ni^{2 +}-ions. Les résultats détaillés se trouvent dans le Hara et al. ³ et Nachbar et al. ⁴.

La méthode ACE qui sera utilisée ici est issue de nos plus tôt les œuvres publiées⁶. Toutefois, l’ajout de l’acétanilide de marqueur du folklore à l’échantillon de protéines n’est pas adapté. AtHIRD11 montre motifs pic large et ajouter le marqueur du folklore à l’échantillon serait dissimuler deux pics. Par conséquent, le marqueur est utilisé dans un run séparé. Avant que le comportement de liaison est examiné, il est confirmé que les pics trouvées au cours d’expériences précédentes proviennent de différents conformères. Ainsi, CGE est utilisé pour distinguer entre les conformères de protéine, le poteau-de translation modifiées protéine et impuretés, telles que des fragments de AtHIRD11, par leurs masses différentes. Ensuite, le comportement de liaison de l’échantillon AtHIRD11 caractérisée vers divers différents ions métalliques est étudiée.

Le but de cet article est de décrire un dispositif expérimental de distinguer entre un IDP et autres composants d’un échantillon afin d’évaluer les différences dans le comportement de liaison de différents conformères.

Protocole

1. préparation des Instruments électrophorèse capillaire

1. Préparer les capillaires
   1. Utilisez un coupe-verre pour couper une silice fondue nu capillaire avec un revêtement extérieur de polyimide et 50 µm de diamètre intérieur en 33 cm (pour l’expérience de la CGE) et les capillaires long de 30 cm (pour l’expérience ACE). Effectuer la coupe sur une plaque de verre.
      Remarque : Les 2 configurations expérimentales différentes ont été développées pour 2 instruments différents. Afin de les utiliser sur d’autres instruments, un transfert de méthode appropriée doit être effectuée et la longueur capillaire doit être adaptée à la longueur autorisée de l’instrument.
   2. Utilisez un stylo pour marquer au milieu d’une fenêtre de détection large de 1 cm à une distance de 24,5 cm d’une extrémité du capillaire pour l’expérience de la CGE et à 21,5 cm d’une extrémité du capillaire pour l’expérience ACE (longueur effective).
   3. Enlever le revêtement extérieur de polyimide des capillaires par brûler avec un chalumeau, 0,5 cm avant et après la marque. De même, utiliser le chalumeau pour enlever 1 cm de l’enduit aux deux extrémités des capillaires.
      Remarque : La longueur effective peut varier légèrement car il repose sur l’instrument de l’électrophorèse capillaire utilisé.
   4. Nettoyez l’extrémité des capillaires et les fenêtres de détection avec l’éthanol et des tissus mous.
      Remarque : Les capillaires non couchés sont moins flexibles et susceptibles de se briser.
2. Installer les capillaires
   1. Installer un capillaire dans CE système avec la fenêtre de détection près de la sortie.
      Remarque : Les divers modèles d’instrument CE ont des systèmes d’exploitation différents pour les capillaires. Reportez-vous au manuel de l’instrument utilisé pour les instructions exactes.

2. préparer les Solutions

1. Préparer les solutions pour l’analyse de la CGE
   1. Préparer le tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)-tampon de SDS (100 mM/1% p/v) à un pH de 8,0.
      1. Utiliser un masque respiratoire et une cabine pour le pesage 1,00 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans un bécher de 100 mL.
      2. Ajouter 1,21 g de Tris dans le bécher de 100 mL et dissoudre à l’aide de 50 mL d’eau désionisée et un bar d’agitation magnétique sur un agitateur magnétique.
      3. Mettre une électrode pH dans la solution et ajuster le pH à 8.0 avec 1,0 M HCl.
      4. Verser la solution dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter de l’eau désionisée jusqu'à la marque. Secouez-le doucement afin d’éviter toute formation de mousse.
   2. Préparer la solution de NaOH 0,1 M.
      1. Environ 4,0 g de NaOH dans une fiole jaugée de 100 mL. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau déminéralisée pour faire un stock de 1 M.
      2. Utiliser une pipette de 10 mL ampoule transférer 10 mL de cette solution dans une fiole jaugée de 100 mL et le remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
   3. Préparer la solution de HCl 0,1 M.
      1. Mettre 10 mL de 10 M HCl dans une fiole jaugée de 100 mL à l’aide d’une pipette jaugée de 10 mL et remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée. Répétez cette étape pour obtenir le 0,1 M HCl.
   4. Préparer la solution de l’échantillon.
      1. Peser 0,5 mg de la protéine dans un tube de 1 mL. Ajouter 0,5 mL du tampon Tris-SDS gel de l’étape 2.1.1 avec une micropipette.
      2. Dissoudre la protéine en agitant doucement afin d’éviter toute formation de mousse et la dégradation de la protéine.
         Remarque : Utilisez ultrasonication si la protéine ne peut pas être dissous comme décrit ; éviter tout échauffement de la solution.
   5. Remplissez les solutions dans les flacons.
      1. Filtrer chaque solution à travers un 0,22 µm Polyfluorure de vinylidène (PVDF) filtre en utilisant une seringue adéquate directement dans le flacon.
         NOTE : Pour les solutions contenant du gel, la pression de retour peut être élevée en raison de sa haute viscosité.
      2. Préparer 15 flacons au total et marquez-les pour éviter toute confusion.
         1. Remplir 3 flacons avec un tampon de gel disponibles dans le commerce de sodium dodecyl sulfate (SDS) à un pH de 8.
            NOTE : L’utilisation d’un tampon de gel SDS disponible dans le commerce donne des résultats plus précis.
         2. Remplissez 1 flacon avec NaOH 0,1 M et 1 flacon de 0,1 M HCl pour le rinçage.
         3. Remplissez 1 flacon avec la solution de l’échantillon.
         4. Remplir 5 fioles d’eau désionisée et 4 flacons avec 0,1 mL d’eau désionisée (trempage des flacons).
            Remarque : Les flacons de trempage sont utilisés comme déchets flacons pendant le rinçage du capillaire avant chaque course. Les extrémités capillaires sont trempées dans l’eau afin de rincer les résidus de gel.
2. Préparer les solutions pour l’analyse de l’ACE
   1. Préparer la solution de NaOH 1 M.
      1. Environ 4,0 g de NaOH dans une fiole jaugée de 100 mL.
      2. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau déminéralisée pour faire un stock de 1 M.
   2. Préparer l’acide ethylendiaminetetraacetic de 0,1 M (EDTA) dans une solution de NaOH 0,1 M.
      1. Transférer 10 mL de NaOH 0,1 M dans une fiole jaugée de 100 mL à l’aide d’une pipette d’ampoule de 10 mL. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
      2. Environ 2,42 g d’EDTA sur un bateau de pesage et dissoudre le composé solide dans le 100 mL de NaOH 0,1 M.
   3. Préparer le tampon Tris (30 mM).
      1. Ajouter 3,63 g de Tris, 200 mL d’eau désionisée et un bar en émoi dans un bécher de 500 mL. Placer le bécher sur une plaque de remuer et allumez-le.
      2. Mettre une électrode de pH dans le bécher et ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl.
      3. Remplissez la solution dans une fiole jaugée de 1 L et remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
         Remarque : Cette procédure doit être répétée ou une fiole jaugée de plus grande est nécessaire, car plus de 1 L est nécessaire pour l’analyse entière.
   4. Préparer l’électroosmotique acétanilide (EOF)-solution de marqueur (60 µM).
      1. Ajouter 6 mg d’acétanilide et 100 mL de tampon Tris dans une fiole jaugée de 100 mL.
      2. Placer la fiole dans un bain à ultrasons et l’allumer pendant 30 min.
   5. Préparer la solution d’échantillon (1 mg/mL).
      1. Mettez un tube à microcentrifugation 0,5 mL sur une balance de précision et ajoutez 0,3 mg de poudre lyophilisée de AtHIRD11 dans le tube.
      2. Utiliser une micropipette pour ajouter 0,3 mL de tampon Tris 30 mM (pH 7,4) dans le tube. Agiter le tube soigneusement afin de dissoudre les protéines.
   6. Préparer les solutions de ligand.
      1. Préparer la solution mère de CaCl₂ (5 mM).
         1. Prendre un bateau de pesage, le mettre sur une balance analytique et peser 36,76 mg de CaCl₂* H₂O.
         2. À l’aide d’une micropipette, rincer le CaCl₂* H₂O de la pesée en bateau dans une fiole jaugée de 50 mL avec le tampon Tris préalablement préparée.
         3. Remplir la fiole jaugée avec le tampon Tris jusqu’au repère.
      2. Préparer les solutions restantes (5 mM).
         1. Répétez l’étape 2.2.6.1 à l’aide de l’autre métal sels au lieu de CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr (NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl ₂* 2 H₂o : 41,47 mg, CuCl₂* 2 H₂o : 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg et NiCl₂* 6 H₂o : 59,43 mg].
            Remarque : La solution de ZnCl₂ a une concentration de 0,5 mM. Étant donné les fortes interactions entre les ions et la paroi capillaire ont été observées, la concentration a été réduite d’un facteur 10⁴.
      3. Préparer la solution de₂ 500 µM CaCl.
         1. Compléter à 10 mL de la solution mère de CaCl₂ et le mettre dans une fiole jaugée de 100 mL.
         2. Remplir la fiole jaugée avec un tampon Tris au trait et agiter la fiole.
      4. Préparer la solution de₂ 250 µM CaCl.
         1. Remplir 5 mL de la solution mère de CaCl₂ et le mettre dans une fiole jaugée de 100 mL.
         2. Remplir la fiole jaugée avec un tampon Tris au trait et agiter la fiole.
      5. Répétez les étapes 2.2.6.3 et 2.2.6.4 pour les autres solutions courantes.
   7. Remplissez les solutions dans les flacons.
      Remarque : Chaque passage répété a besoin d’une série de flacons d’entrée et de sortie. L’utilisation de solutions de ligand fraîches à l’entrée et la sortie permet de réduire les déplacements dans le temps de migration après chaque course.
      1. Remplissez la solution de₂ 250 µM CaCl dans une seringue de 10 mL.
      2. Mettre un filtre PVDF 0,22 µm sur la seringue et le poussoir 2 mL de la solution à travers le filtre à l’aide de la seringue afin d’écarter cette solution filtrée.
      3. Remplir 10 flacons à la concurrence de la quantité autorisée avec la solution restante de₂ ACIC de 250 µM de la seringue. Marquez-les comme 250 vial µM CaCl ₂ solution inlet.
      4. Remplir 10 flacons jusqu'à ce qu’ils sont remplis à moitié avec la solution de₂ 250 µM CaCl. Marquez-les comme 250 vial µM CaCl ₂ solution prise.
      5. Répétez les étapes 2.2.7.1 - 2.2.7.4 pour d’autres les solutions métalliques contenant du sel.
      6. Répétez les étapes pour chaque paire de flacons d’entrée et de sortie à l’aide de la solution tampon (pH 7,4) Tris de 30 mM au lieu de cela.
         Remarque : Le 30 mmol/L de tampon Tris pH 7,4 est utilisé entre les pistes afin d’obtenir des données de temps de migration de la protéine en absence d’ions métalliques. Il est nécessaire pour négliger les changements dans les expressions du folklore.
      7. Répétez les étapes ci-dessus pour un flacon à l’aide de l’acétanilide solution (60 µM) EOF-marqueur à la place. En outre, répétez ces étapes en utilisant la solution d’échantillon (1 mg/mL) à la place.

3. capillaire Gel séparation électrophorétique

Remarque : Préparer la séparation selon la méthode décrite dans une étude antérieure par Nachbar et al. ⁴.

1. Préparer l’analyse
   1. Condition du capillaire
      1. Réglez le thermostat à 23 ° C.
      2. Rincez le capillaire pendant 10 min à 2,5 bars avec NaOH 0,1 M.
      3. Rincez le capillaire pendant 5 min à 2,0 bar avec du HCl 0,1 M.
      4. Rincez le capillaire pendant 2 min à 2,0 bar avec de l’eau désionisée.
   2. Remplir le tampon de gel SDS
      1. Remplir un capillaire pendant 10 min à 2,0 bar avec le tampon de gel SDS disponible dans le commerce à un pH de 8,0.
   3. Rincer le tube capillaire avant chaque course de séparation
      1. Rincez le capillaire pendant 3 min à 4,0 bar avec NaOH 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 4,0 bar avec du HCl 0,1 M.
      3. Rincez le capillaire pendant 1 min à 4,0 bar avec de l’eau désionisée.
      4. Rincez le capillaire pendant 10 min à 4,0 bar avec le tampon de gel SDS.
2. Exécutez la séparation
   1. Injecter la solution de l’échantillon pour les expériences de la CGE (étape 2.1.4) hydrodynamique en appliquant 0.1 bar pendant 4 min à l’entrée.
   2. Appliquer -16,5 kV et une pression de 2,0 bars aux deux extrémités du capillaire pendant 25 min.

4. l’analyse par électrophorèse capillaire affinity

Remarque : Préparer la séparation selon la méthode décrite dans des travaux antérieurs par Nachbar et al. ⁴ et Alhazmi et al. ⁵.

1. Condition du capillaire
   1. Réglez le thermostat à 23 ° C.
      Remarque : La température est utilisée selon les protocoles publiés et peut être modifiée à d’autres températures^4,5. Cependant, les interactions dépendent de la température et changeront en conséquence.
   2. Rincer un capillaire pendant 40 min à 2,5 bars avec NaOH 0,1 M.
   3. Rincez le capillaire pendant 10 min à 1,0 bar avec de l’eau désionisée.
   4. Rincez le capillaire pendant 30 min à 1,0 bar avec un tampon Tris de 30 mM (pH 7,4).
2. Préparation pour les méthodes de l’ACE
   1. Préparer la méthode pour la mesure sans ligands.
      Remarque : Acétanilide n’a pas ajouté à la solution de l’échantillon, comme il déguise 2 pics de protéines.
      1. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars à l’eau désionisée.
      3. Rincez le capillaire pendant min 1,5 à 2,5 bars avec un tampon Tris d’équilibration.
      4. Injecter la solution acétanilide pour de 6 s à 0,05 bar et change l’entrée et sortie pour les flacons de tampon Tris.
      5. Appliquer 0,05 bar pour 2.4 s afin de pousser la solution acétanilide de la pointe de l’intérieur plu capillaire.
      6. Appliquer 10.0 kV pendant 6 min et détecter le pic de l’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répétez les étapes 4.2.1.1. -4.2.1.6. en utilisant la protéine Goûtez au lieu de la solution de l’acétanilide et détecter tous les sommets de la protéine.
   2. Préparer la méthode pour les mesures avec les ligands.
      1. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars à l’eau désionisée.
      3. Rincez le capillaire pendant min 1,5 à 2,5 bars avec la solution de ligand pour l’équilibration.
      4. Injecter la solution acétanilide pour de 6 s à 0,05 bar et change l’entrée et sortie pour les flacons contenant du ligand de tampon.
      5. Appliquer 0,05 bar pour 2.4 s afin de pousser la solution acétanilide de la pointe de l’intérieur plu capillaire.
      6. Appliquer 10.0 kV pendant 6 min et détecter le pic de l’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répétez les étapes 4.2.2.1 - 4.2.2.6 à l’aide de l’échantillon de protéine au lieu de la solution de l’acétanilide et détecter tous les sommets de la protéine.
   3. Alternativement, répétez étapes 4.2.1 et 4.2.2 afin de calculer le changement dans les rapports de charge-taille pour les diverses interactions de protéine-metal ion (décrites sous la rubrique Résultats représentant).
      1. Remplacez la solution protéique après toutes les 60 h une nouvelle.
         Remarque : À ce stade, l’expérience peut être suspendue. Cette procédure est répétée au moins 10 x pour chaque concentration des ligands comme le modèle de pointe varie légèrement d’une exécution à l’exécution. Si la solution est utilisée plus de 60 h, les variations deviennent trop grandes.
   4. Exécutez les méthodes
      1. Exécutez la méthode décrite dans l’étape 4.2.2, en utilisant les solutions de ligand alcalino-terreux (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂et LVERS₂ solutions).
      2. Continuer à utiliser la méthode décrite dans l’étape 4.2.2, utilisant le MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂et NiCl₂ solutions au lieu des solutions de ligand alcalino-terreux.
         Remarque : Les chlorures de métaux de transition ce dernier montrent des rapports plus étroits entre le capillaire et ne peuvent être éliminés complètement. Ces résultat d’interactions dans se déplace dans le temps de la migration d’une exécution à l’exécution. Par conséquent, ils ont été étudiés après les autres ions métalliques.

Résultats

La figure 1 montre l’électrophorégramme pour l’échantillon de AtHIRD11 obtenu au cours des expériences de la CGE. La taille de peptide augmente de gauche à droite. Nombre maximum 4 possède la plus grosse masse et indique la protéine intacte. Les petits pics 2 et 3 représentent les impuretés plus petites (p. ex., produits de dégradation). Le premier pic et l’incohérence de la ligne de base avant pourraient également être reproduites...

Discussion

Pour toutes les expériences de CE, la préparation du capillaire est une étape cruciale. Puisque c’est un tube de verre de petit diamètre, il peut facilement se casser dans les endroits où le revêtement est supprimé lorsqu’il est contrôlé. L’installation du capillaire dans l’instrument devrait être faite très soigneusement.

Les étapes critiques liés à l’utilisation de la méthode ACE principalement concernent le montage expérimental. Une autre étape cruciale consiste ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it