Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Резюме

Этот протокол сочетает в себе характеристики образец протеина Капиллярный электрофорез и быстро привязки скрининга для заряженных лигандов, близость капиллярного электрофореза. Рекомендуется для белков с гибкой структурой, например неразрывно неупорядоченных белки, чтобы определить какие-либо различия в привязке для различных конформеров.

Аннотация

Растения сильно зависят от окружающей их среды. Для того, чтобы приспособиться к стрессовым изменениям (например, засухи и высокой солености), высших растений развиваться классы неразрывно неупорядоченных белков (ВПЛ) для уменьшения окислительного и осмотического стресса. Эта статья использует комбинацию Капиллярный электрофорез (КГЭ) и мобильность сдвиг сродство электрофореза (ACE), чтобы описать поведение привязки различных конформеров AtHIRD11 ВПЛ из Arabidopsis thaliana. КГЭ используется для подтверждения чистоты AtHIRD11 и исключить фрагменты, Посттрансляционная изменений и других примесей, как причин для сложных пик шаблонов. В этой части эксперимента различные примеры компонентов разделенных их различных масс вязкой гелем внутри капилляра и обнаружены с детектором массив диода. Потом ACE исследуется поведение привязки образца к различных ионов металлов. В этом случае лигандом добавляется буферного раствора и сдвиг в миграции время измеряется для того, чтобы определить, произошло ли событие привязки или нет. Одним из преимуществ использования комбинации КГЭ и ACE определить поведение привязки МВУ является возможность автоматизировать электрофорез геля и пробирного привязки. Кроме того КГЭ показывает нижний предел обнаружения, чем классические гель-электрофорез и туз может определить порядок привязки лиганд в быстром образе. Кроме того ACE также может применяться для других заряженных видов чем ионы металла. Однако использование этого метода для привязки эксперименты ограничен в его способность определить количество сайтов связывания. Тем не менее сочетание КГЭ и туз может быть адаптирована для характеризующие поведение привязки любой образец протеина к многочисленные заряженных лигандами.

Введение

Растения являются более зависимыми от их окружающей среды, чем многие другие формы жизни. Поскольку растения не может переехать в другие места, они должны адаптироваться к изменениям в их окружении (например, засухи, холодной и высокая концентрация соли). Следовательно высших растений разработана специализированная стресс белки как дегидринов, которые выполняют многообразные задачи, чтобы уменьшить стресс ячейки, относящиеся к высокой солености. Эти белки связывают воды и ионов внутри клеток, уменьшить окислительный стресс путем привязки Cu^{2 +}-ионов и взаимодействовать с фосфолипидами, а также cytoskeletons. Кроме того, привязка Zn^{2 +}-ионов позволяет эти белки выступают в качестве факторов транскрипции. Их способность фиксироваться Ca^{2 +}-ионов после фосфорилирования был также сообщили¹.

Многофункциональный поведение этих белков связана с отсутствием гидрофобные аминокислотных остатков. Следовательно им не хватает любой гидрофобных взаимодействий внутри пептидные цепи, а также ограничением структуры. Однако потому что эти белки отсутствие ограничительного структуры, они могут занимать различные конформеров на тех же условиях. Таким образом они могут быть описаны лучшие, как ансамбль сооружений, а не один конформации. Белки с этими свойствами известны как внутренне неупорядоченным белков (ВПЛ) и широко используется понятие стресса белков и перекрестных помех между различными путями в эукариотической клетки².

Один из этих связанных со стрессом ВПЛ является AtHIRD11. Это один из Arabidopsis thalianaнаиболее высоко засухи выразил ВПЛ. Следовательно различные конформеров могут быть разделены их эффективный радиус для зарядки соотношение и капиллярного электрофореза (CE) был использован для дальнейшего расследования. Предыдущие эксперименты ACE продемонстрировал взаимодействия между AtHIRD11 и ионов переходных металлов таких как Cu^{2 +}-, Zn^{2 +}-, Co^{2 +}и Ni^{2 +}-ионов. Подробные результаты можно найти в Хара и др. ³ и Люберцах и др. ⁴.

ACE метод, который будет использоваться здесь основан на нашей ранее опубликованных работ⁶. Однако добавление acetanilide маркер EOF для Образец протеина не подходит. AtHIRD11 показывает широкий пик шаблоны, и добавление метки EOF образца будет замаскировать две вершины. Таким образом маркер используется в отдельном сеансе. Прежде чем рассматривается поведение привязки, он подтвердил, что пики, найденные во время предыдущих экспериментов являются из разных конформеров. Таким образом КГЭ используется для различения между конформеров белка, столб-поступательные изменения протеина и примесей, таких как фрагменты AtHIRD11, их разными массами. Впоследствии Исследовано поведение характеризуется AtHIRD11 Пример привязки к различных различных ионов металлов.

Целью этой статьи является описание экспериментальной установки для различения МВУ и другие компоненты образца для того чтобы оценить различия в поведении привязки различных конформеров.

протокол

1. Подготовка документов капиллярного электрофореза

1. Подготовить капилляры
   1. Используйте стеклорез для нарезать голые кварцевое кремнезема капилляра с внешнее покрытие полиимида и внутренний диаметр 50 мкм 33 см (для КГЭ эксперимента) и длиной 30 см (для эксперимента, ACE) капилляров. Выполните резки на стеклянной пластины.
      Примечание: 2 различных экспериментальных установок были разработаны для 2 различных инструментов. Для того, чтобы использовать их на других инструментах, надлежащего метода передачи должна быть выполнена и длина капилляра должен корректироваться на допустимую длину документа.
   2. Используйте перо для обозначения в середине окна широкий обнаружения 1 см на расстоянии 24,5 см от одного конца капилляра для эксперимента КГЭ и 21,5 см от одного конца капилляра для ACE эксперимента (эффективная длина).
   3. Удаление полиимида внешнее покрытие из капилляров, сжигая его с паяльной лампой, 0,5 см до и после знака. Аналогично Использование паяльной лампой для удаления 1 см покрытия на обоих концах капилляров.
      Примечание: Эффективная длина может отличаться поскольку он полагается на приборе капиллярного электрофореза используется.
   4. Очистите концы капилляров и обнаружения windows с этанолом и мягких тканей.
      Примечание: Немелованной капилляров являются менее гибкими и, вероятно, сломать.
2. Установите капилляров
   1. Установите капилляр в системе CE с окном обнаружения вблизи розетки.
      Примечание: Различные модели инструмента CE имеют различные Холдинг систем для капилляров. Обратитесь к руководству используемый инструмент для точных инструкций.

2. подготовить решения

1. Подготовка решения для анализа КГЭ
   1. Подготовьте трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris)-SDS буфера (100 mM/1% w/v) при pH 8.0.
      1. Используйте респираторные маски и стенд для взвешивания 1.00 g додецилового сульфата натрия (SDS) в 100-мл стакан.
      2. Добавьте 1,21 г в 100 мл стакан трис и растворить его с использованием 50 мл деионизированной воды и магнитные перемешать бар на магнитной мешалкой.
      3. Помещать рН электрода в раствор и скорректировать рН 8.0, используя 1.0 М HCl.
      4. Заполните решение в объемном колбу 100 мл и Добавьте деионизированной воды до отметки. Встряхните его осторожно, чтобы избежать любого образования пены.
   2. Приготовляют раствор NaOH 0,1 М.
      1. Весят 4.0 г NaOH в объемный флакон 100 мл. Заполните его до отметки с дейонизированной воды, чтобы сделать запас 1 М.
      2. Использование пипетки лампы 10 мл для передачи 10 мл этого раствора в другой объемный флакон 100 мл и заполнить его до отметки деионизированной водой.
   3. Подготовьте раствор HCl 0,1 М.
      1. Положите 10 мл 10 М HCl в 100 мл объемные колбу с использованием 10 мл Объемный дозатор и заполнить его до отметки деионизированной водой. Повторите этот шаг для получения 0,1 М HCl.
   4. Подготовка примера решения.
      1. Вес 0,5 мг белка в 1 мл трубку. Добавьте 0,5 мл буфера Tris-SDS гель из шага 2.1.1 с микропипеткой.
      2. Растворите белка путем встряхивания осторожно во избежание формирования пены и деградации белка.
         Примечание: Используйте ultrasonication если протеин не может быть распущен как описано; Избегайте любого нагрева раствора.
   5. Заполните решения во флаконы.
      1. Фильтр для каждого решения через 0,22 мкм поливинилиденфторид (ПВДФ) фильтр с помощью адекватных шприц непосредственно в пробирку.
         Примечание: Для решения гелем содержащих, обратное давление может быть высоким из-за его высокой вязкости.
      2. Подготовка 15 флаконов в общей сложности и Марк каждого, чтобы избежать любой путаницы.
         1. Заполните 3 флаконов с коммерчески доступных натрия Додециловый сульфат (SDS) гель буфера при pH 8.
            Примечание: Использование коммерчески доступных буфера гель SDS обеспечивает более точные результаты.
         2. Залейте 1 флакон 0,1 М NaOH и 1 флакон с 0,1 М HCl для промывки.
         3. Заполните 1 флакон с примером решения.
         4. Заполните 5 ампул с деионизированной воды и 4 флаконы с 0,1 мл деонизированной воды (погружение ампул).
            Примечание: Погружения флаконы используются как отходов пузырьки во время промывки капилляра до каждого запуска. Капиллярные концы, смоченной в воде, чтобы смыть остатки геля.
2. Подготовка решения для анализа ACE
   1. Приготовляют раствор NaOH 1 M.
      1. Весят 4.0 г NaOH в объемный флакон 100 мл.
      2. Заполните его до отметки с дейонизированной воды, чтобы сделать запас 1 М.
   2. Подготовьте 0,1 М ethylendiaminetetraacetic кислоты (ЭДТА) в 0,1 М растворе NaOH.
      1. Передача 10 мл 0,1 М NaOH в 100 мл объемные колбу с помощью пипетки лампы 10 мл. Заполните его до отметки деионизированной водой.
      2. Весят 2,42 г ЭДТА на лодке весом и растворяет твердые соединения в 100 мл 0.1 М NaOH.
   3. Приготовляют раствор трис буфера (30 мм).
      1. Добавление 3.63 г трис, 200 мл деионизированной воды и перемешать бар в 500 мл стакан. Поместите стакан на тарелку, перемешать и включите его.
      2. РН электроды в стакан и скорректировать рН 7,4, используя 0,1 М HCl.
      3. Заполните решение в объемном флакон 1 Л и заполнить до отметки деионизированной водой.
         Примечание: Эта процедура должна повторяться или большие объемные колбу это необходимо, поскольку для всего анализа требуется более 1 Л.
   4. Подготовка acetanilide электроосмотического потока (EOF)-решение маркер (60 мкм).
      1. Добавьте 6 мг, acetanilide и 100 мл трис-буфер в объемный флакон 100 мл.
      2. Положите объемные колбу в ультразвуковой ванне и переключить его 30 мин.
   5. Подготовьте решение примера (1 мг/мл).
      1. Положить трубку microcentrifuge 0,5 мл на балансе точности и добавлять 0,3 мг порошка лиофилизированных AtHIRD11 в трубку.
      2. Используйте микропипеткой для добавления 0,3 мл буфера Tris 30 мм (рН 7,4) в трубе. Встряхните трубки тщательно, чтобы распустить белка.
   6. Подготовка решений лиганда.
      1. Подготовьте Стоковый раствор CaCl₂ (5 мм).
         1. Возьмите лодку взвешивания, положить его на весы аналитические и весят 36.76 мг CaCl₂* H₂O.
         2. С помощью микропипеткой, флеш CaCl₂* H₂O от весом катера в 50 мл объемные колба с ранее подготовленными буфера Tris.
         3. Заполните объемный колбу с трис-буфер до отметки.
      2. Подготовьте решение оставшихся запасов (5 мм).
         1. Повторите шаг 2.2.6.1, используя другие металлические соли вместо CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23.80 мг, BaCl₂: 26.02 мг, Sr (№₃)₂: 52.91 мг, НКД₂: 31.46 мг, SeCl₄: 52.91 мг, CoCl ₂* 2 H₂O: 41.47 мг, CuCl₂* 2 H₂O: 42.62 мг, ZnCl₂: 3.41 мг и NiCl₂* 6 H₂O: 59.43 мг].
            Примечание: Решение ZnCl₂ имеет концентрацию 0,5 мм. Так как наблюдались сильные взаимодействия ионов и внутренней стенки капилляров, концентрация была снижена с коэффициентом 10⁴.
      3. Приготовляют раствор₂ 500 мкм CaCl.
         1. 10 мл раствора штока₂ CaCl, заполните и положил его в объемный флакон 100 мл.
         2. Заполните объемный колбу с буфером трис для знака и встряхнуть флакон.
      4. Приготовляют раствор₂ 250 мкм CaCl.
         1. 5 мл раствора штока₂ CaCl, заполните и положил его в объемный флакон 100 мл.
         2. Заполните объемный колбу с буфером трис для знака и встряхнуть флакон.
      5. Повторите шаги 2.2.6.3 и 2.2.6.4 для других фондовых решения.
   7. Заполните решения во флаконах.
      Примечание: Каждый повторный запуск требуется набор впускных и выпускных флаконов. Использование свежей лигандом решений на входе и выходе уменьшает сдвиги в время миграции после каждого запуска.
      1. Заполните 250 мкм CaCl₂ раствор в шприц 10 мл.
      2. Положите фильтр PVDF 0,22 мкм на шприц и push 2 мл раствора через фильтр, с помощью шприца, чтобы отменить этот отфильтрованный раствор.
      3. Заполните 10 ампул до максимального допустимого объема оставшихся 250 мкм CaCl раствором₂ шприца. Марк каждый как 250 мкм CaCl ₂ решения входе флакона.
      4. Заполните 10 ампул, пока они наполовину заполненный с 250 мкм CaCl₂ решения. Марк каждый как 250 мкм CaCl решения ₂ розетки во флаконе.
      5. Повторите шаги 2.2.7.1 - 2.2.7.4 металлические соли содержащих решений.
      6. Повторите действия для каждой пары входе и выходе флаконов, вместо этого с помощью 30 мм трис-буфере (рН 7,4) решение.
         Примечание: 30 ммоль/Л трис буфер рН 7,4 используется между запусками для получения данных время миграции для протеина в отсутствие ионов металлов. Это необходимо для того, чтобы игнорировать изменения в EOF.
      7. Повторите вышеуказанные шаги для одного флакона, вместо этого с помощью acetanilide метка EOF (60 мкм) решение. Кроме того повторите эти шаги, вместо этого использовать решение примера (1 мг/мл).

3. Капиллярная гель электрофоретического разделения

Примечание: Подготовьте разделения в соответствии с методом, описанным в предыдущей работе в Люберцах и др. ⁴.

1. Подготовить анализ
   1. Состояние капилляров
      1. Установите термостат на 23 ° C.
      2. Промойте капилляра для 10 мин на 2,5 бар с 0,1 М NaOH.
      3. Промойте капилляр 5 мин на 2,0 бар с 0,1 М HCl.
      4. Промойте капилляра 2 мин на 2,0 бар деионизированной водой.
   2. Заполните в буфере гель SDS
      1. Заполните капилляр для 10 мин на 2,0 бар с коммерчески доступных буфера гель SDS при pH 8.0.
   3. Промойте капилляр до каждого запуска разделения
      1. Промойте капилляров на 3 мин на 4.0 бар с 0,1 М NaOH.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 4.0 бар с 0,1 М HCl.
      3. Промойте капиллярные за 1 мин на 4.0 бар деионизированной водой.
      4. Промойте капилляра для 10 мин на 4.0 бар с буфером гель SDS.
2. Запуск разделения
   1. Придать эжекции пример решения для КГЭ экспериментов (шаг 2.1.4), применяя 0,1 бар на 4 мин на входе.
   2. Применить-16.5 кв и давлении 2,0 бар на обоих концах капилляра для 25 мин.

4. близость капиллярного электрофореза анализ

Примечание: Подготовьте разделения в соответствии с методом, описанным в предыдущих работах, Люберцах и др. ⁴ и Alhazmi и др. ⁵.

1. Состояние капилляров
   1. Установите термостат на 23 ° C.
      Примечание: Температура используется согласно опубликованные протоколы и может быть изменено для других температур^4,5. Однако взаимодействия зависят от температуры и соответственно изменится.
   2. Флеш капилляр для 40 мин на 2,5 бар с 0,1 М NaOH.
   3. Промойте капилляра для 10 мин на 1,0 бар деионизированной водой.
   4. Промойте капилляра для 30 мин при 1,0 бара с буфером Трис 30 мм (рН 7,4).
2. Подготовка для методов ACE
   1. Подготовьте метод для измерений без лигандами.
      Примечание: Acetanilide не был добавлен для примера решения, как это маскирует 2 белка пиков.
      1. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар с 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляра для 1,5 мин на 2,5 бар с буфером трис для уравновешивания.
      4. Внедрять решение acetanilide для 6 s на 0,05 бар и изменением входе и выходе флаконы для флаконов буфера Tris.
      5. Применить 0,05 бар 2.4 s нажать acetanilide решение от кончика капиллярной еще внутри.
      6. Применить 10,0 кв 6 мин и обнаруживать acetanilide пик на длине волны 200 Нм.
      7. Повторите шаги 4.2.1.1. -4.2.1.6. с помощью белка образца вместо решения acetanilide и обнаружить все вершины белка.
   2. Подготовьте метод для измерения с лигандами.
      1. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар с 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляра для 1,5 мин на 2,5 бар с решением лигандом для уравновешивания.
      4. Внедрять решение acetanilide для 6 s на 0,05 бар и изменением входе и выходе флаконы для флаконов лиганд содержащие буфер.
      5. Применить 0,05 бар 2.4 s нажать acetanilide решение от кончика капиллярной еще внутри.
      6. Применить 10,0 кв 6 мин и обнаруживать acetanilide пик на длине волны 200 Нм.
      7. Повторите шаги 4.2.2.1 - 4.2.2.6, используя образец протеина вместо решения acetanilide и обнаружить все вершины белка.
   3. Попеременно повторите шаги 4.2.1 и 4.2.2 для того чтобы рассчитать изменения в заряд размер коэффициентов для различных белков металл Ион взаимодействий (описано в разделе Представитель результаты).
      1. Измените решение белка после каждые 60 h на свежие.
         Примечание: на данный момент, этот эксперимент может быть приостановлена. Эта процедура является по крайней мере неоднократные 10 x для каждого концентрации лигандов, поскольку пик шаблон изменяется незначительно от запуска к запуску. Если решение используется более чем 60 h, вариации становится слишком большим.
   4. Запустить методы
      1. Запустите метод, описанный в разделе Шаг 4.2.2, используя Щёлочноземельные лигандом решения (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂и SrCl₂ решения).
      2. Далее, с помощью метода, описанного в разделе Шаг 4.2.2, вместо решения лигандом Щёлочноземельные НКД₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂и NiCl₂ решения.
         Примечание: Хлориды последний переходных металлов показали более взаимодействия с капиллярной и не могут быть полностью удалены. Эти взаимодействия результат в сдвиги в миграции время от запуска к запуску. Следовательно они были расследованы после других ионов металлов.

Результаты

Рисунок 1 показывает electropherogram для AtHIRD11 образца, полученные в ходе экспериментов КГЭ. Пептид размер увеличивается слева направо. Максимальное число 4 имеет большой массы и указывает интактных белков. Меньшие вершины 2 и 3 представляют собой меньше примес...

Обсуждение

Для всех CE экспериментов подготовка капилляра является важным шагом. Поскольку это стеклянную трубку с малого диаметра, он может легко сломать в местах, где покрытие удаляется, когда он обрабатывается. Установка капилляра, в инструмент следует делать очень осторожно.

Ва?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it