הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההסרה של טיהור של עורק הריאה אנדותל תאים (PAECs) לדבוק קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעת שהם נמצאים תקוע בעורק הריאה במהלך צנתור הלב הימני יישארו חסיד בלון מנוכה בעקבות הסרת מן הגוף של המטופל.

Abstract

מגוון רחב של פתולוגיות להוביל יתר לחץ דם ריאתי (PH), אשר מוגדר רשע עורק הריאה בלחץ העולה על 25 מ מ כספית במנוחה. עוד יותר לאבחן ולנהל PH, המטופלים עוברים הלב הימני חוזרות catheterizations (RHC) שבו קטטר Swan-גנץ מתקדמת לתוך ענף עורק הריאה, בלון מנופח לתקוע את קצה הקטטר. מאמר זה מדגים פרוטוקול לפיה תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) עשוי להיות שנקטפו לאחר RHC העצות בבועות טקסט של קטטר Swan-גנץ וטיהרו עם טכניקה טור אנטי-CD146 זיקה לטהר בשם PAECs. תאים אלה עשויה לשמש כדי לספק תמונה באתרו של מצב ביולוגי אנדותל להערכת ריאתי כהשלמה מדידות והמודינמיקה שהתקבל במהלך RHC. שנבצרו, מטוהרים PAECs עשוי לשמש גם תרבית תאים או עוקבות מבחני אנליטי כגון זרימת cytometery.

Introduction

האמריקאי והאירופי לפי ההנחיות דורשות הלב הנכון צנתור לאבחון של יתר לחץ דם ריאתי¹. רופאים, מדענים מחפשים להבין את המחלה רצון דגימות ביולוגיות להערכת ריאתי כדי להשלים את הנתונים והמודינמיקה הנאסף במהלך RHC. למרבה הצער, שהסיכון ביופסיה כלי דם ריאתי הוא גבוה מאוד, ולכן דגימות ביולוגיות של להערכת ריאתי הם לעיתים נדירות, אם אי פעם המתקבל החיים בחולים שעברו RHC. בעוד צברה הרבה תובנה של רקמת הריאה וסקולריים המתקבל cadaveric או הריאות explanted, הדוגמיות הללו אינם מסוגלים לשקף את הביולוגיה של תהליך המחלה PH כמו זה מתקיים לחולה לחיות. בשנת 2013, אנחנו קודם דיווחו תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) הם חשופה מן הענפים של עורק הריאה על ידי מגע פיזי עם בלון קצה הצנתר ברבור-גנץ במהלך RHC, ניתן לשחזר במספרים קטנים מן העצות קטטר לאחר הליך².

מאמר זה מדגים את הטכניקה שלנו עבור הסרת וטיהור תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) מכל קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעקבות הלב הנכון צנתור. עד כה, המתודולוגיה לביצוע טכניקה זו הקציר תואר בפירוט לא מספיק בספרות כדי להבטיח תוצאות אחיד בין מעבדות ביצוע הטכניקה. מאמר זה נועד להתגבר על מחסור, המציע מטמיעים הפגנה של הטכניקה, מאוסף המיטה קטטר הטיפים כדי המוצר הסופי של מטוהרים CD146 + אנדותל תאים. טכניקה זו צריכה לסייע בקידום המחקר לתוך pathobiology חבלות מסיבות שונות של PH, יכול לגרום בפיתוח של מבחני אבחון חדש כדי להשלים והמודינמיקה הנתונים שנאספו במהלך RHC.

החשיבות של טכניקה זו בתחום המחקר והרפואה כלי דם ריאתי הוא כי זה מספק גישה תצלום בזק של הביולוגיה של אנדותל ריאתי באתרו, בניגוד מחקרים מוקדמים יותר על הריאות explanted או cadaveric, לא מייצג נקודת קצה של הנושא ריאות. לאחרונה, הראינו כי סמן אנטי-מוות תאים אלה עשויה להיות תועלת ב ליתר דיוק phenotyping הקשורים זנים של יתר לחץ דם ריאתי³. התשואה של תאים שהושג הוא יחסית קטן, ~ 5, 000-25,000 PAECs עבור דגימה, תאים אלה הם קשים (אך לא בלתי אפשרי) לתרבות. אנו מאמינים כי חכם קלינאים וחוקרים ימצא הסינרגיה בין שיטות אלה מסייע על מנת לקדם מחקר כלי דם ריאתי, אבחון, prognostics.

Protocol

כל המחקרים שתוארו במאמר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של הרשת בריאות אלגני. כל המטופלים באתר הסכמה מדעת לפני המינהל מהסוכנים הרגעה, מבטל את אותרו על-ידי הקצאת מספר הלימוד.

1. אוסף המיטה

הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. חשוב לזירוז stasis קר בתאים כדי לשמר שלהם פנוטיפ ביולוגי באתרו. פרוטוקול זה כרוך הטיפול של דם ותאים המתקבל בני אדם, ולכן צריך להיות שנצפו הזהירות אוניברסלי.

1. לאחר נסיגה של הקטטר מהנדן, מיד לטבול את הצנתר בתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל המכיל 40 מ ל תמיסת סטרילית צוננת. מערבולת הקטטר מספר פעמים כדי להסיר דם ולאחר אשטוף את הצורך להסיר דם נשמר בתוך השורה.
2. לחתוך את 5 ס מ דיסטלי של קצה הצנתור ולאפשר לו ליפול לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ ל המכיל תמיסת מלח צוננת. מיד להסיר את הטיפ הצנתור עם מלקחיים, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל המכיל 15 מ"ל של מדיום הגידול תא אנדותל (EC).
3. לאטום את הצינור, הניחו אותו על קרח, להעביר למעבדה כדי להתכונן עיבוד או משלוח. זה קריטי כי הבלון נשאר שקוע בפעילות בינונית, לכן ודא יש קראוון מינימלי בצינור 15 מ"ל על ידי ממלא אותו לחלוטין עם מדיום הגידול EC.
4. תהליך הדגימה מיד על ידי הליך 2.1 שלב או חותם, הספינה המדגם על קרח רטוב בין לילה לעיבוד-מעבדה מיומנים פרוטוקול זה. אם תאים בסופו של דבר הולך לשמש תרבית תאים, זה ממליצים כי הטיפ הצנתור יעובדו מיד באותו אתר שבו זה נאסף.

2 קציר תא

הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. התאים הם בהקפאה קר, וזה חשוב למנוע התעוררות אותם עד שהם יהיו מוכנים להיות קבוע או תרבותי. פרוטוקול זה כולה צריכה להתבצע בתוך תא למינארי, באמצעות מכשירים סטריליים, אם הכוונה האולטימטיבית היא תרבות PAECs שנקטפו. אם התרבות אינה מתוכננת (למשל, flow cytometry ניתוח), אין צורך לבחון אמצעי זהירות סטרילי.

1. הוסף 5 מ של פתרון ניתוק התא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל; מניחים על קרח.
2. שואבים את שנותרו בצינור אוסף המיטה לתוך המזרק 1 מ"ל 1 מ"ל של EC מדיה.
3. מהר להשלים שלבים 2.3 דרך 2.5. זהו זה סוף חיתוך של קצה הקטטר עם ועוצרי דימום.
4. הכנס היטב את המחט של המזרק 1 מ"ל לתוך החור"לבן"מול החוט ("חור שחור"). . שמור על עצמך כדי למנוע פציעות עם המחט.
5. להעביר את הטיפ הצנתור לתוך צנטריפוגה 15 מ"ל הצינור המכיל את הפתרון ניתוק התא.
6. לנפח את הבלון, נזהר שלא להתפוצץ זה; ניפוח הבלון עם-200 µL של התקשורת עובד.
7. לאפשר את הצנתר לשבת בפתרון ניתוק התא על קרח למשך 5 דקות עם בלון מנופח. אם הבלון מצטמקות בכוחות עצמו במהלך 5 דקות, זו קביל.
8. שופכים את התוכן של הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל לתוך המנה 100 מ מ. מקם את הבלון הפתרון ניתוק התא "שלולית".
9. לגרד את הבלון המנופח עם המגרד התא. ניתן להסיק את המגרד תא מסביב לבלון תנועה מעגלית או תנועה צחצוח. להתמקד "הפולנים" של הבלון, שם הוא פוגש את הקטטר. ודא מגרד תא השטח כולו של הבלון יוצר קשר לפחות פעמיים. לשטוף את המגרד תא בפתרון ניתוק התא "שלולית" מעת לעת.
10. השטחת קצה את הבלון, לגרד את זה עם תנועה צחצוח. יש לשטוף את המגרד תא בפתרון ניתוק התא "שלולית".
11. להתעלם במגרדת עצה ומחט תא את הצנתור בגורם המכיל פסולת המתאים.
12. יוצקים את הפתרון ניתוק התא המכיל את הקציר תא לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. לנער את הצינור אוסף ויוצקים התקשורת הנותרים מהצינור אוסף לתוך הדגימה שנאספו גם כן.
13. Centrifuge הדגימה ב x 650 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חשוב לציין כי לרוב גלולה לא ישודר. זה יכול להיות מועיל לסמן את המיקום שבו גלולה היה אפשר לראות, אם גלוי, כדי להימנע כ רפה בעברית בגדר במקרה זה קטן מדי כדי לראות...
    הערה: בדרך כלל, גלולה נתפסת רק כאשר המדגם שזוהמו על ידי הדם. זיהום דם הוא משנה המוצר האולטימטיבי הקציר כי דם נכשל לאגד את החרוזים CD146 שוטף באמצעות המדור. בדיקות מקיפות הוכיחה כי למותג הספציפי של 1.5 mL microcentrifuge צינורות שאוזכרו טבלה של חומרים ממזערת אובדן התא ביחס אחרים צינורות מנוצל במהלך המיטוב פרוטוקול.
14. בזהירות תשאף מדיה, ולהימנע מפריע או כ רפה בעברית בגדר.

3. תא טיהור

הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. התאים הם בהקפאה קר, וזה חשוב למנוע התעוררות אותם עד שהם יהיו מוכנים להיות קבוע או תרבותי.

1. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של תאי הדם האדומים צוננת פירוק פתרון, להעביר אותו צינור microfuge 1.5 מ; בעדינות רוק 10 דקות ב 4 º C.
2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון פירוק RBC.
3. Resuspend בגדר ב- 60 μL של PBS, μL 20 ה-FcR חוסם μL 20 של האנטי-האדם CD146 גרגרי. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C.
4. להוסיף 1 מ"ל של PBS צוננת. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS צוננת.
5. במקום עמודה LS מגנטי על מתלה מגנטי (ראו טבלה של חומרים ספציפיים מסחרי זהותם של פריטים אלה) בטמפרטורת החדר. פריים עמודה על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ולאפשר האחסון כולו לזרום דרך. למחוק את הזרימה דרך.
6. מקם את הדגימה בעמודה מגנטי. למחוק את הזרימה דרך.
7. רחץ טורים 3 מ"ל של PBS צוננת שלוש פעמים. למחוק את הזרימה דרך מ. כל כביסה.
8. להוסיף 3 מ"ל של PBS צוננת שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. הסר את העמודה מגנטי מגנט, שופכים את 3 מ"ל של PBS מהצינור צנטריפוגה 15 מ"ל לתוך העמודה ולמקם במהירות את העמודה בצינור צנטריפוגה כדי לתפוס את הזרימה דרך. מיד מזנקת עם הבוכנה שסופק עם עמודה. המדגם הוא עכשיו מטוהרים, מוכנים פיקסציה/צביעת, או תרבות.

תוצאות

פרוטוקול זה מתבטא הטיהור של תאים, טיפים קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני, לאגד עמודת בחירה CD146, יש פרופילים לפנים לצד פיזור הם נבדלים מן האדם העיקרי בתרבית ריאתי עורק תאי אנדותל (איור 1). בהתחשב בכך הבלון הצנתר הוא במגע פיזי עם רק introducer נדן (תא ללא חומר), הקיר כלי עורק הריאה, ואת הדם, נתונים ניתנת בזאת כדי להדגים כי תאים אלה לא נגזרות הדם (איור 2) , ואת ולכן ההנחה היא כי הן אכן נוצרו מן הקיר כלי עורק הריאה. הקורא צריך לציין כי beads מגנטי anti-CD146 המשמשים לטהר את התאים נשארים מחסידי השטח תא לאחר ההליך, ובכך זה היא שיוצרת כדי לנסות לנתח את יבול תא עבור CD146 כסמן של תאי אנדותל. CD31 או סמנים אנדותל אחרים ככל הנראה יהיה זמין עבור תיוג, יכול להיחשב חלופות.

המרכיבים העיקריים של פרוטוקול זה זוהו זה עשוי להשפיע על התוצאות. ראשית, חשוב לשטוף את קצה הקטטר ליד מיטת החולה על מנת להסיר את הדם. איור 3 מראה את הצד פיזור (האס) / פיזור קדמי (FSC) פרופילים של זרימה דרך מן העמודה anti-CD146 עבור אחד לטעום את זה היה כמו שצריך לשטוף, אחד זה לא היה. העמודה מופיעה כדי לא לכלול תאים דם-derived יבולים (איור 2), אך הצעד השטיפה יבטיח מינימלי זיהום אפשרי מלהסתובב תאי אנדותל (אשר קיימים בדרך כלל ב- < 50 תאים למ"ל של דם⁴). הבחנו את eluate של CD146 העמודה היא ברורה לחלוטין, אפילו במקרה של דגימות קצה הצנתר מדמם מאוד. זה מרמז כי העמודה הוא מסוגל להתמודד עם כמויות משמעותיות של דם ללא סתימת או שמירה שאינם-CD146 + bloodborne תאים.

שנית, חשוב לנפח את בלון עיצה לפחות פעם אחת במהלך השלב במגרדת תא תא פתרון ניתוק. בהתחשב בכך PAECs בשם בקצה הבלון להישאר למרות חסיד רינס מלוחים צעד, סביר להניח שהם חלקית לכודים על ידי קפלי הבלון ויניל כמו זה הוא מנוכה המחירים לקראת הסרת מן המטופל. ככל הנראה, הצעד האינפלציה משחרר את PAECs, לאפשר להם להיות שפשוף בעדינות. . זה לא ברור אחד יכול לבדוק השערה זו, אבל תשואות נמוכות של תאים נצפו כאשר הבלון היא לא מופקע (נתונים לא מוצג).

לבסוף, חשוב לציין כי התשואות של PAECs נגזר בשיטה זו יכול להשתנות במידה ניכרת. ככל הנראה, החולה-, מחלת ספציפיים למדינה או רופא גורמים תורמים ההשתנות, כמו הפרוטוקול אינו מכיל שלבים הייתה צפויה לגרום אובדן גדול של חומר המקור. טבלה 1 מציגה את נציג ש-cd146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא.

איור 1 : תרבות האס/FSC פרופילים של יבול עצה בלון קטטר טיפוסי מטופלת ביתר לחץ דם ריאתי (א), מספר דומה של תאים רכשה באופן מסחרי ראשי האדם PAEC (ב). שתי דוגמאות היו מטוהרים עם העמודה anti-CD146, קבוע, permeablized כפי שמתואר הפרוטוקול, לפני ניתוח FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : האס/FSC פרופילים של בלון קטטר טיפוסי עצה הקציר מיתר לחץ דם ריאתי המטופל (א) ו טורי 1:10 דילול Ficoll מטוהרים הדרגתי האנושי באפי את המעיל (B, C, D). (א) היה טהור עם העמודה anti-CD146 ואילו (B-D) לא היו. כל הדגימות תא קבוע, permeablized כפי שמתואר הפרוטוקול, לפני ניתוח FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : האס/FSC פרופילים של יבול עצה בלון קטטר ממטופל יתר לחץ דם ריאתי דם היה גלוי בקצה הקטטר לפני עיבוד. לפני שלב 3.1 של הפרוטוקול, המדגם היה מפוצל, פירוק מאגר היה להוסיף aliquot אחד שנוכו השני. (א) ו- (ג) להראות את הפרופילים האס/FSC מדגם lysed, בשני התאים נשמרים על ידי עמודת (א), של הזרימה דרך מן העמודה. (B) ו- (ד) להראות את הפרופילים האס/FSC מדגם unlysed, בשני התאים נשמרים על ידי עמודת (B), של הזרימה דרך מן העמודה (D). אנו מסיקים כי פירוק מסיר חלק אבל לא כולם של לויקוציטים אבל זה לויקוציטים אינן נשמרות באמצעות העמודה, ובכך לא יכללו את הקציר הסופי, ללא קשר פירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדגם	תאריך	תפוקת תא	אבחון
433	4/17/2018	7364	מחלות ריאה אינטרסטיציאליות-PH
279	4/17/2018	7130	PH-סקלרודרמה
432	4/13/2018	3976	PH-Multifactorial
431	4/13/2018	3634	HFrEF
390	4/13/2018	5666	פה
423	3/23/2018	9024	HFrEF
272	3/23/2018	7098	HFrEF
408	2/27/2018	4784	HFrEF
403	2/14/2018	10376	PH-ASD + מחלות המסתם הדו-צניפי
396	1/26/2018	4890	HFpEF-IPCPH
397	1/26/2018	7672	ספיקת הדם נורמלי
318	1/4/2018	7002	HFrEF-האל-וואד הנוכחי

טבלה 1: CD146 + התשואות ממגוון רחב של יבול PAEC. נציג CD146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא.

Discussion

בטכניקה המתוארת במאמר זה ניתנת להערכה הטובה ביותר בהקשר של פרדיגמות ניסיוני הקודם לימוד של אנדותל כלי הדם בריאות. ניסיונות קודמים להשיג PAECs של בני האדם היה מוגבל בריאות explanted/cadaveric⁵ ועל ניסיון קצר כדי לפתח צנתר מסוגל עורק הריאה ביופסיה⁶. כאמור ב- סקירה האחרונות⁷, הטכניקה נוכח נבדל הקציר רקמת הריאה על ידי יכולתו להשיג PAECs של אדם חי, עושים זאת על מספר נקודות זמן ההתקדמות המחלה ו/או טיפול. עם זאת, יצוין כי טכניקה לוויה לאחרונה דווחה לפיה המושרה בתאי גזע pluripotent (IPSCs) יכול להיות transdifferentiated לתוך^4,PAECs⁵. טכניקה זו מייצרת תרבויות בשפע של המטופל הספציפי PAECs ומאפשרת חקר השפעת רקע גנטי לחולה ספציפי על ביולוגיה PAEC. למרות היתרונות האלה, אלה PAECs נגזר IPSC יכול להציע מידע לגבי האינטראקציה בין microenvironment המקומי לבין הרקע הגנטי של החולה הספציפי. קבוצה משלנו הציגה את התצוגה כי "הצנתור עצה" וטכניקות IPSC צפויים להיות סינרגיסטי בקידום שדה⁸.

במסגרת זו מתנת והיסטוריים, המגבלות של טכניקה זו יש לציין. ראשית, חשוב לציין כי התשואות של PAECs נגזר בשיטה זו יכול להשתנות במידה ניכרת. ככל הנראה, החולה-, מחלת ספציפיים למדינה או רופא גורמים תורמים ההשתנות, כמו הפרוטוקול אינו מכיל שלבים הייתה צפויה לגרום אובדן גדול של חומר המקור. טבלה 1 מציגה את נציג ש-cd146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא. שנית, התשואות תא הכוללת נמוכה הינם הנביטה שלהם לתרבות הוכיחה להיות נמוך עדיין בידיים שלנו. בזמן שלמדנו בעבר תרבויות PAECs באמצעות שיטה זו¹, אנו מניחים הצלה מייצגים אלה תוצאות של קבוצת משנה של ובתאים בעקבות die-off של רוב המדגם, הוא רק לסירוגין מוצלח בידיים שלנו. לדוגמה, זה לא נדיר למצוא רק כמה עשרות מחסידי PAECs בתרבות בבוקר לאחר הקציר היה מצופה. לעיתים קרובות המיקרו-תרבויות אלה אינם שורדים להתרחבות. עבודה נוספת יש צורך לייעל את פרוטוקול זה באופן תחזק את הכדאיות של PAECs והתנאים שלהם בתרבות כדי להשיג את המטרה הרצויה של התפשטות של המטופל הספציפי PAEC יבול. בסופו של דבר, הבחירה חיובי CD146 שאנחנו הסתגלו יכול שלא לכלול זיהום עם CD146 + תאים אחרים, כגון העברת תאי אנדותל⁴, pericytes, תאי שריר חלק, נדיר CD146 + T תאים^9,10. יחד עם זאת, תאים אלה הם בחזקת להיות מעט מאוד במספר הדגימות שנאספו באופן זה, CD146 היא במידה ניכרת ספציפית עבור פרוטוקול זה יותר סמנים אחרים התא של תאי אנדותל כגון CD31 (אשר נמצאת גם על מגוון נישא בדם תאים כולל טסיות¹¹). שיפורים עתידיים כלשהם שמטרתם לשפר את ירידה לפרטים לאזן נגד שלהם השפעה שלילית פוטנציאלית על התשואה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm culture dish	Fisher	NC9385690
15 mL Centrifuge Tubes	Midsci	C15R
16% Formaldehyde	Fisher	PI28908
50 mL centrifuge tubes	Midsci	C50R
Accutase	Thermo	A1110501	cell detachment solution
Cell Scraper	Fisher	08-100-241
Endothelial Cell Growth media	Cell Applications	211-500
Forceps	any
Hemostat	any
LoBind microfuge tube	Fisher	13-698-794
Miltenyi CD146 beads	Miltenyi	130-093-596
Miltenyi FCR blocker	Miltenyi	130-059-901
Miltenyi LS columns	Miltenyi	130-042-401
Miltenyi magnet	Miltenyi	MidiMACS
Miltenyi RBC lysis buffer	Miltenyi	130-094-183
PBS	Fisher	BP2438-4
Scissors	any
Syringes	BD	309597